Name: Generación cíbrida transmitocondrial utilizando líneas celulares cancerosas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprende a generar cíbridos transmitocondriales a partir de líneas celulares cancerosas en suspensión. Este método permite estudiar el papel de los genotipos mitocondriales en la progresión tumoral y la agresividad celular.

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Esta investigación fue financiada por el número de subvención PID2019-105128RB-I00 a RSA, JMB y AA, y PGC2018-095795-B-I00 a PFS y RML, ambas financiadas por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y números de subvención B31_20R (RSA, JMA y AA) y E35_17R (PFS y RML) y financiadas por el Gobierno de Aragón. El trabajo de RSA fue apoyado por una subvención de la Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Los autores desean agradecer el uso del Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

NOTA: Todos los medios de cultivo y composiciones de búfer se especifican en la Tabla 1. Antes de la generación cíbrida, se deben tipificar los perfiles de ADN mitocondrial y nuclear de las células donante y receptora para confirmar la presencia de diferencias genéticas en ambos genomas entre las líneas celulares. En este estudio, se utilizó una línea celular L929 disponible comercialmente y su línea celular derivada, L929dt, que se generó espontáneamente en nuestro laboratorio (ver13 para más información). Estas líneas celulares presentan dos diferencias en la secuencia de su gen mt-Nd2 que pueden ser utilizadas para confirmar la pureza del ADNmt una vez finalizado el proceso de cibridización13. En este caso, la pureza del fondo nuclear fue confirmada por la sensibilidad a los antibióticos, ya que, contrariamente a las células L929dt, L929 eran resistentes a la genética.
1. Depleción mitocondrial por tratamiento con rodamina 6G (células receptoras)
NOTA: El primer paso para una generación cíbrida exitosa es abolir completa e irreversiblemente las funciones mitocondriales en las células receptoras. Para ello, es necesario determinar previamente, para cada línea celular, la concentración adecuada y la duración del tratamiento con rodamina 6G. Esta concentración adecuada debe estar justo por debajo de la muerte celular inducida por el fármaco (la más alta que no mata las células durante el tratamiento). Realice lo siguiente una vez que se definan las condiciones óptimas.
<ol><li>Sembrar 10 6 células en una placa de6 pocillos utilizando un medio de cultivo completo (ver Tabla 1 para más detalles) y tratarlas diariamente con la concentración óptima de rodamina 6G durante 3-10 días, dependiendo de la línea celular. Las concentraciones tradicionales varían de 2 a 5 μg/mL durante 3-10 días20,21. En este estudio, para las células derivadas de L929, 2,5 μg/mL de rodamina 6G durante 7 días fue el tratamiento seleccionado13,22.</li>
	<li>Para mantener vivas las células, complemente el medio de cultivo celular con 50 μg/mL de uridina y 100 μg/mL de piruvato y renuévelo cada 24 h.</li>
	<li>Después del tratamiento y antes de la fusión, cambiar el medio de las células tratadas con rodamina 6G para completar el medio de cultivo celular sin rodamina 6G, y dejarlas en este medio durante 3-4 h en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2. NOTA: El efecto tóxico de la rodamina 6G es irreversible, y las células con mitocondrias no funcionales no deberían recuperarse20. Por lo tanto, después del tratamiento, las células que no reciben mitocondrias funcionales deben morir incluso en un medio de cultivo suplementado con uridina. Por lo tanto, no debería ser necesaria ninguna selección nuclear. Sin embargo, se recomienda una fusión de control de células tratadas con rodamina 6G sin mitocondrias.</li>
</ol>2. Expansión y aislamiento mitocondrial (células del donante)
<ol><li>Expanda las células donantes de mitocondrias durante el lapso de tiempo del tratamiento con rodamina 6G para obtener alrededor de 25 x 106 células.</li>
	<li>El día 7, cosechar células de crecimiento exponencial en un tubo de 50 ml y recogerlas por centrifugación a 520 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Lave las células 3 veces con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS) y sedimente por centrifugación a 520 x g durante 5 minutos a RT. A partir de ahora, realizar todos los pasos de la extracción mitocondrial a 4 °C, utilizando reactivos fríos y manteniendo los tubos con células o mitocondrias en hielo.</li>
	<li>Después de la tercera centrifugación, desechar el sobrenadante por aspiración utilizando una pipeta de vidrio acoplada a una bomba de vacío y resuspender las células empaquetadas en un volumen de tampón hipotónico igual a 7 veces el volumen del pellet celular. Luego, transfiera la suspensión celular a un tubo homogeneizador y deje que las células se hinchen incubándolas en hielo durante 2 minutos.</li>
	<li>Rompa las membranas celulares realizando de 8 a 10 golpes en el homogeneizador acoplado a un mortero accionado por motor que gira a 600 rpm. NOTA: El paso de la ruptura de la membrana celular puede variar entre los tipos de células; Por lo tanto, debe optimizarse para cada tipo de célula.</li>
	<li>Agregue el mismo volumen de tampón hipertónico a la suspensión celular (7 veces el volumen del pellet celular) para generar un ambiente isotónico.</li>
	<li>Transfiera el homogeneizado a un tubo de 15 ml y centrifugarlo en un rotor fijo a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C. Luego, recolecte solo 3/4 del sobrenadante dejando un gran margen del pellet, para evitar la contaminación con núcleos o células intactas, y transfiéralo a otro tubo. Repita el mismo proceso dos veces. Tenga en cuenta que el sobrenadante debe conservarse y el pellet desechado.</li>
	<li>Guarde la fracción mitocondrial (sobrenadante). Transfiéralo a tubos de 1,5 ml y centrifugar a velocidad máxima (18.000 x g) durante 2 min a 4 °C.</li>
	<li>Desechar el sobrenadante y lavar el pellet enriquecido con mitocondrias con tampón A, combinando el contenido de los dos tubos en uno solo y centrifugando en las mismas condiciones descritas en el paso 2.7. Repita el mismo proceso hasta que todo el material esté en un solo tubo.</li>
	<li>Realizar un lavado adicional con 300 μL de tampón A y cuantificar la concentración de proteína mitocondrial utilizando el ensayo Bradford23. Para cada ensayo de cibridización, se debe determinar la cantidad óptima de mitocondrias para el procedimiento de transferencia (en nuestro caso, una concentración entre 10-40 μg de proteína mitocondrial por 10a 6 células).</li>
	<li>Simultáneamente, prepare las células pretratadas con rodamina 6G para la fusión recolectándolas en un tubo de 15 ml y centrifugando a 520 x g durante 5 minutos a RT. Tenga en cuenta que el pellet adquiere un color rosa neón debido al tratamiento con rodamina 6G.</li>
	<li>Para asegurarse de que tanto la abolición de la función mitocondrial en las células receptoras como la purificación de orgánulos de los donantes se han realizado correctamente, siembre un pequeño número de células tratadas con rodamina 6G y aísle mitocondrias utilizando el medio de cultivo completo en una placa de 6 pocillos y críquelas durante un mes para verificar que no queden células sobrevivientes en ninguno de los pocillos (Figura 2).</li>
	<li>Paralelamente, evaluar la ausencia de contaminantes de núcleos en la fracción mitocondrial mediante inmunodetección de proteínas nucleares (es decir, lamina beta, histona H3, etc.) o mediante la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) de un gen nuclear (es decir, SDH, ARNr 18S, etc.). NOTA: Para evitar contaminaciones, se recomienda realizar todos los pasos en condiciones asépticas trabajando bajo una campana de flujo laminar.</li>
</ol>3. Fusión y generación cíbrida
<ol><li>Para proceder con la fusión, agregue cuidadosamente 106 de las células tratadas con rodamina 6G al pellet de mitocondrias aislado (10-40 μg de proteína mitocondrial) y centrifugar a 520 x g durante 5 min para permitir que las células se mezclen con las mitocondrias.</li>
	<li>Añadir 100 μL de polietilenglicol (PEG, 50%) y resuspender suavemente el pellet durante 30 s. Luego, deje reposar intacto durante otros 30 s.</li>
	<li>Finalmente, transfiera la mezcla a una placa de 6 pocillos con medio de cultivo celular completo fresco y colóquela en la incubadora a 37 °C con 5% deCO2. Después de unos días (generalmente 1 semana), los cíbridas transmitocondriales deben comenzar a crecer (Figura 2), dando lugar a clones que pueden seleccionarse individualmente o mezclarse en un grupo antes de su análisis.</li>
</ol>4. Verificación de los antecedentes mitocondriales y nucleares
NOTA: Una vez que se ha establecido la nueva línea celular y las células comienzan a crecer exponencialmente, se debe verificar la pureza de sus ADN mitocondriales y nucleares. Por lo tanto, las líneas celulares originales deben albergar diferentes mutaciones o polimorfismos dentro de sus genomas para hacerlos reconocibles.
<ol><li>Aislamiento total de ADN<ol><li>Aislar el ADN genómico de todas las líneas celulares utilizadas para la generación cíbrida empleando un kit comercial de extracción de ADN genómico (ver Tabla de Materiales) o realizando un protocolo estándar utilizando extracción de alcohol fenol-cloroformo-isoamílico y precipitación de alcohol24.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluación del ADNmt (Figura 3) NOTA: Se pueden realizar varias técnicas, como la secuenciación, el análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) o la qPCR específica de alelos, para analizar la pureza del ADNmt. Para confirmar la presencia de variaciones de secuencia de ADNmt por RFLP, siga los siguientes pasos del protocolo.<ol><li>Amplificar un fragmento de ADNmt que contenga el cambio de nucleótido mediante PCR.<ol><li>Aquí, las células L929dt presentan una mutación de ADNmt en la posición 4206, dentro de un gen mt-Nd2 (m.4206C>T) que está ausente en las células L929. Para confirmar la presencia de esta sustitución en los cíbridos transmitocondriales, amplificar un fragmento de 397 pb mediante PCR utilizando un protocolo estándar y los siguientes cebadores: 1) 5'-AAGCTATCGGG CCCATACCCCG-3' (posiciones 3862-3884) y 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGCG -3' (posiciones 4236-4258).</li>
		</ol></li>
		<li>Analizar la presencia de la sustitución de nucleótidos deseada por RFLP, utilizando una endonucleasa específica que reconoce el cambio de secuencia y genera un patrón de corte diferente para ambas líneas celulares. NOTA: Cuando la variante de ADNmt L929dt está presente (4206T), el amplicón obtenido en el paso 4.2.1 contiene dos sitios de restricción para SspI (ver Tabla de materiales) que produce tres fragmentos de ADN de 306 pb, 52 pb y 39 pb. El sitio de restricción que genera las bandas 52 y 39 se interrumpe cuando está presente la versión de tipo salvaje (WT) C4206 y aparece una nueva banda de 91 pb. Por lo tanto, se incluye en el análisis un control interno para la digestión completa de SspI. La reacción de digestión se realiza a 37 °C, siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Separe los fragmentos de restricción por electroforesis y compare el patrón de bandas.<ol><li>Una vez realizada la digestión, analizar los fragmentos de restricción obtenidos por electroforesis en geles de poliacrilamida-tris-borato-EDTA (TBE) al 10% (ver Tabla 1 para 1x composición TBE). Ejecutar la electroforesis a 80 V durante 1 h en RT. Visualizar los fragmentos de ADN después de la tinción en gel en una solución de bromuro de etidio en 1x TBE durante 15 min a RT (ver Tabla 1 para la composición de la solución de tinción en gel).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Genotipado de ADN nuclear NOTA: El genotipado de ADN nuclear debe realizarse utilizando la muestra de extracción de ADN anterior empleada para el análisis de RFLP.<ol><li>Amplíe 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 y AMEL) utilizando un conjunto de oligonucleótidos específicos del comercial (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Realizar electroforesis mediante un analizador genético con el fin de separar los fragmentos previamente obtenidos. NOTA: Una vez amplificados, los diferentes loci se analizan mediante electroforesis utilizando un sistema capilar (ver Tabla de Materiales). Los fragmentos se separan en un capilar de 50 cm de largo lleno de un polímero comercial. Los tampones de cátodo y ánodo también están disponibles comercialmente, como se muestra en la Tabla de materiales. La electroforesis se realiza a 19,5 kV durante 20 min a 60 °C.</li>
		<li>Utilizar herramientas bioinformáticas para determinar los alelos correspondientes a cada locus amplificado (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Comparar los datos obtenidos en el paso 4.3.3 con la base de datos del perfil de ADN nuclear (Tabla 1), para comprobar si el perfil de ADN nuclear coincide con el perfil de la línea celular del receptor de las mitocondrias (Figura 4).</li>
	</ol></li>
</ol>

Generación de cíbridos transmitocondriales a partir de células cancerosas en crecimiento en suspensión

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Desde que Otto Warburg informó que las células cancerosas cambian su metabolismo y potencian la "glucólisis aeróbica"3,4 mientras reducen la respiración mitocondrial, el interés en el papel de las mitocondrias en la transformación y progresión del cáncer ha crecido exponencialmente. En los últimos años, las mutaciones en el ADNmt y la disfunción mitocondrial han sido postuladas como características de muchos tipos de cáncer25. Hasta la fec...

La reprogramación del metabolismo energético es un sello distintivo del cáncer1 que fue observado por primera vez por Otto Warburg en la década de 19302. En condiciones aeróbicas, las células normales convierten la glucosa en piruvato, que luego genera acetil-coA, alimentando la maquinaria mitocondrial y promoviendo la respiración celular. Sin embargo, Warburg demostró que, incluso en condiciones normóxicas, la mayoría de las células cancerosas convierten el piruvato obtenido del proceso de glucólisis en lactato, cambiando su forma de obtener energía. Este ajuste metabólico se conoce como el "efecto Warburg" y permite a algunas células cancerosas satisfacer sus demandas energéticas para un rápido crecimiento y división, a pesar de generar ATP de manera menos eficiente que el proceso aeróbico 3,4,5. En las últimas décadas, numerosos trabajos han apoyado la implicación de la reprogramación del metabolismo en la progresión del cáncer. Por lo tanto, la energética tumoral se considera un objetivo interesante contra el cáncer1. Como eje central en el metabolismo energético y en el suministro de precursores esenciales, las mitocondrias juegan un papel clave en estas adaptaciones celulares que, hasta la fecha, solo entendemos parcialmente.
En línea con lo anterior, las mutaciones del ADN mitocondrial (ADNmt) han sido propuestas como una de las posibles causas de esta reprogramación metabólica, lo que podría conducir a un deterioro del rendimiento de la cadena de transporte de electrones (ETC)6 y explicaría por qué algunas células cancerosas mejoran su metabolismo glucolítico para sobrevivir. De hecho, se ha relatado que el ADNmt acumula mutaciones dentro de las células cancerosas, estando presente en al menos el 50% de los tumores7. Por ejemplo, un estudio reciente realizado por Yuan et al. reportó la presencia de moléculas de ADNmt hipermutadas y truncadas en cánceres de riñón, colorrectal y tiroides8. Además, muchos trabajos han demostrado que ciertas mutaciones del ADNmt están asociadas con un fenotipo tumoral más agresivo y con un aumento del potencial metastásico de las células cancerosas 9,10,11,12,13,14,15,16.
A pesar de la aparente relevancia del genoma mitocondrial en la progresión del cáncer, el estudio de estas mutaciones y su contribución a la enfermedad han sido desafiantes debido a las limitaciones en los modelos experimentales y tecnologías actualmente disponibles17. Por lo tanto, se necesitan nuevas técnicas para comprender el impacto real del ADN de las mitocondrias en el desarrollo y la progresión de la enfermedad del cáncer. En este trabajo, introducimos un protocolo para la generación de cíbridos transmitocondriales a partir de células cancerosas en crecimiento en suspensión, basado en la repoblación de células pretratadas con rodamina 6G con mitocondrias aisladas, que supera los principales desafíos de los métodos tradicionales de cibridización18,19. Esta metodología permite el uso de cualquier núcleo donante independientemente de la disponibilidad de su correspondiente línea celular ρ0 y la transferencia de mitocondrias a partir de células que, siguiendo las técnicas tradicionales, serían difíciles de enuclear (es decir, líneas celulares no adherentes).

<table><tbody><tr><td>Analizador genético 3500XL&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4406016</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>AmpFlSTR Identifiler Plus Kit de amplificación de PCR</td> Contenedor <td></td> tampón de ánodo <td>ThermoFisher Scientific</td> 4427368 <td></td></tr><tr><td>serie 3500</td><td>Biosystems aplicados</td><td>4393927</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Ensayo PanReac</td><td>131015</td><td></td></tr> Bradford <tr><td>Contenedor tampón de cátodo</td><td></td><td></td> Biorad 5000002 serie 3500 Applied Biosystems 4408256 <td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alto contenido de glucosa</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131026</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Bromuro de etidio <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8751</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador Mortero de teflón</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>L929 Línea celular</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean Tetra4 Sistema de gel</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Productos</td><td></td>personalizados</tr><tr><td>Solución de poliacrilamida 30%</td><td>PanReac</td><td>A3626</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>POP-7</td><td>Applied Biosystems</td><td>4393714</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>QIAmp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina-6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4127</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>SspI New</td><td>England Biolabs</td><td>R3132</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina/penicilina</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>P14030B</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td></td></tr></tbody></table>

generación cíbrida transmitocondrial utilizando líneas celulares cancerosas

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

En los últimos años, el número de estudios dedicados a determinar la conexión entre las mitocondrias y el cáncer ha aumentado significativamente. Sin embargo, aún se necesitan más esfuerzos para comprender completamente el vínculo que implica alteraciones en las mitocondrias y la tumorigénesis, así como para identificar fenotipos mitocondriales asociados a tumores. Por ejemplo, para evaluar la contribución de las mitocondrias en los procesos de tumorigénesis y metástasis, es esencial comprender la influencia de las mitocondrias de las células tumorales en diferentes entornos nucleares. Para este propósito, un posible enfoque consiste en transferir mitocondrias a un fondo nuclear diferente para obtener las llamadas células cíbridas. En las técnicas tradicionales de cibridización, una línea celular que carece de ADNmt (ρ0, célula donante nuclear) se repoblina con mitocondrias derivadas de células enucleadas o plaquetas. Sin embargo, el proceso de enucleación requiere una buena adhesión celular a la placa de cultivo, una característica que se pierde parcial o completamente en muchos casos en las células invasivas. Además, otra dificultad encontrada en los métodos tradicionales es lograr la eliminación completa del ADNmt endógeno de la línea celular receptora mitocondrial para obtener fondos de ADN nuclear y mitocondrial puro, evitando la presencia de dos especies diferentes de ADNmt en el cíbrida generado. En este trabajo, presentamos un protocolo de intercambio mitocondrial aplicado a células cancerosas de crecimiento en suspensión basado en la repoblación de células pretratadas con rodamina 6G con mitocondrias aisladas. Esta metodología nos permite superar las limitaciones de los enfoques tradicionales, y por lo tanto puede ser utilizada como una herramienta para ampliar la comprensión del papel mitocondrial en la progresión del cáncer y la metástasis.

Después de seguir el protocolo presentado anteriormente, se debe obtener una línea celular ciclaria homoplásmica con un fondo nuclear conservado pero con un nuevo genotipo mitocondria, como se representa en los esquemas de la Figura 1 y la Figura 2. La pureza del ADN mitocondrial y nuclear presente en los cíbridos puede confirmarse mediante RFLP, como se muestra en la Figura 3, y mediante análisis de genotipado de ADN nuclear, como ...

Este protocolo describe una técnica para la generación cíbrida a partir de células cancerosas en suspensión como una herramienta para estudiar el papel de las mitocondrias en el proceso tumorigénico.

Generación cíbrida transmitocondrial utilizando líneas celulares cancerosas

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Esta investigación tiene como objetivo comprender mejor la contribución de las mitocondrias en la progresión del cáncer y la metástasis. La generación cíbrida transmitocondrial puede ayudarnos a dilucidar cómo y a qué nivel los genotipos mitocondriales están implicados en la agresividad de una célula tumoral. Una de las tecnologías para obtener información sobre el papel mitocondrial en el cáncer es la generación cíbrida.Combinamos esta herramienta con una variedad de otros métodos que incluyen electroforesis donativa, análisis de respiración y otros ensayos funcionales mitocondriales, citometría de flujo, proteómica, etc. La plasticidad de las células cancerosas junto con las redes de interacción entre genes nucleares y mitocondriales, aumenta la complejidad de nuestros experimentos y la interpretación de datos. Esta es una de las razones por las que es necesario desarrollar nuevos enfoques experimentales.Uno de los hallazgos más emocionantes de nuestra investigación ha sido el descubrimiento de dos mutaciones de ADN mitocondrial asociadas con el desprendimiento de células del plato de juego que se asemejan a la generación de metástasis y hacen que las células dependan completamente de la glucólisis aeróbica, y también las hacen más tumorigénicas y metastásicas en modelos in vivo. Este protocolo de intercambio de mitocondrias se puede aplicar a la suspensión de células cancerosas en crecimiento. La cronología puede superar las limitaciones de los enfoques tradicionales donde el proceso de nucleación y la eliminación completa del ADN mitocondrial de las líneas celulares receptoras mitocondriales a menudo se convierten en un verdadero desafío.

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