Name: Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende la técnica de captura de conformación cromosómica (3C) para estudiar la organización de la cromatina y su influencia en la expresión génica utilizando Caenorhabditis elegans. Este método permite a estudiantes universitarios participar activamente en investigación molecular.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la Red de Excelencia en Investigación Biomédica del Premio al Desarrollo Institucional de Rhode Island (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención P20GM103430 y el Centro Bryant de Salud y Ciencias del Comportamiento.

Captura de la conformación cromosómica (3C) para la investigación y la docencia de pregrado

<ol><li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Nalabothula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+architectural+proteins+HMGD1+and+H1+bind+reciprocally+and+have+opposite+effects+on+chromatin+structure+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation.</a> BMC Genomics. 15, 92(2014).</li>
<li>John, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+pre-determines+glucocorticoid+receptor+binding+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns.</a> Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).</li>
<li>Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+occurrence+of+a+fibrous+lamina+on+the+inner+aspect+of+the+nuclear+envelope+in+certain+cells+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates.</a> The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).</li>
<li>Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+mediated+by+repositioning+of+genes+to+the+nuclear+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina.</a> Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).</li>
<li>Finlan, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+to+the+nuclear+periphery+can+alter+expression+of+genes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells.</a> PLoS Genetics. 4 (3), e1000039(2008).</li>
<li>Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+re-organisation+of+the+Hoxb+complex+during+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.</a> Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).</li>
<li>Chambeyron, S., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+decondensation+and+nuclear+reorganization+of+the+HoxB+locus+upon+induction+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.</a> Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+active+and+inactive+genes+and+noncoding+DNA+within+chromosome+territories%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li>
<li>Li, B., Carey, M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chromatin+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of chromatin during transcription.</a> Cell. 128 (4), 707-719 (2007).</li>
<li>Chen, A., Chen, D., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+DNase-seq+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals.</a> Gene. 667, 83-94 (2018).</li>
<li>Hughes, A. L., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+nucleosome+positioning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).</li>
<li>Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+nucleosome+mapping+reveals+transcription-dependent+promoter+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging.</a> Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).</li>
<li>Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+evolutionary+approach+to+identify+determinants+of+nucleosome+positioning%3A+A+unifying+model+for+establishing+the+genome-wide+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern.</a> Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>van Berkum, N. L., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+spatial+chromatin+organization+of+large+genomic+regions+using+5C+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology.</a> Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).</li>
<li>Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+TAD+boundaries+constrain+cell-type-specific+looping+interactions+between+promoters+and+distal+elements+around+the+CFTR+locus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus.</a> American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).</li>
<li>Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+California%2C+Berkeley%22">University of California, Berkeley</a>. , PhD thesis (2012).</li>
<li>Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CTCF+is+required+for+the+enhancer+blocking+activity+of+vertebrate+insulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators.</a> Cell. 98 (3), 387-396 (1999).</li>
<li>Cuadrado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+contributions+of+cohesin-SA1+and+cohesin-SA2+to+TADs+and+polycomb+domains+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells.</a> Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).</li>
<li>Sarro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+the+three-dimensional+regulatory+topology+of+the+Pitx1+locus+results+in+overtly+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development.</a> Development. 145 (7), (2018).</li>
<li>Tolhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+polycomb+domains+are+guided+by+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture.</a> PLoS Genetics. 7 (3), e1001343(2011).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+From+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture%2C+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%26%2334%3BC%26%2334%3B+s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The three &#34;C&#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li>
<li>Hagège, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+%283C-qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li>
<li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My5C%3A+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El 3C es una técnica poderosa que tiene sus raíces en técnicas moleculares básicas. Es esta base de herramientas fundamentales lo que hace que 3C sea una técnica tan intrigante para usar con estudiantes universitarios. Con tantos estudios recientes que observan la dinámica de la cromatina a una escala tan amplia, el uso de estos resultados para diseñar un experimento enfocado en un solo gen o región genómica tiene el potencial de crear un experimento único e impactante en la investigación de pregrado. A menudo, experimentos como estos se consideran demasiado avanzados para los estudiantes universitarios, pero con una planificación cuidadosa, son fácilmente alcanzables. Es importante tener en cuenta que los ensayos diseñados para sondear las conexiones de cromatina capturadas por la biblioteca 3C pueden variar desde la PCR semicuantitativa de punto final hasta la secuenciación del genoma completo. De hecho, los datos del primer artículo 3C16 se generaron a partir de qPCR. Esta amplia gama de ensayos se puede utilizar porque todas las tecnologías 3C producen el mismo producto: una biblioteca de fragmentos de ADN que representan conexiones 3D en el núcleo.
Aquí se presenta una adaptación de un protocolo más flexible y complaciente que se ajusta mejor a los investigadores de pregrado. Los períodos de pausa enumerados anteriormente implican retrasos nocturnos; Sin embargo, estas pausas pueden extenderse durante los fines de semana y, en el caso de las células y los núcleos, durante semanas. La consideración más importante es cuándo se realizará el trabajo. A menudo, en los protocolos, hay pasos sensibles al tiempo cuando la pausa no es una opción. Fuera de algunos puntos (día 1 y día 2), hay muchos lugares para detenerse y congelar la muestra. Estos son críticos cuando se trabaja con estudiantes universitarios donde los horarios y horarios del trabajo de laboratorio deben ser flexibles. Además de diseñar estas paradas en el protocolo, se alienta a los estudiantes universitarios a trabajar en parejas o incluso en pequeños grupos de tres o cuatro. Los grupos funcionan bien para este protocolo, ya que los estudiantes pueden apoyarse mutuamente y crear un sistema de compañeros para que todos trabajen de manera segura. El trabajo de laboratorio también es más divertido con otros involucrados. Con los grupos, los estudiantes también pueden trabajar en una variedad de preguntas centradas en la organización de la cromatina mientras realizan el mismo protocolo. Por lo tanto, incluso mientras los estudiantes están trabajando en proyectos separados, el protocolo vincula sus esfuerzos y, debido a esto, pueden apoyarse mutuamente.
Otras adaptaciones están destinadas a evitar el hecho de que ciertas herramientas y equipos especializados no se encuentran necesariamente en todas las instituciones de pregrado. Estos equipos incluyen, entre otros, termocicladores qPCR, sistemas de documentación de gel y espectrómetros de nanovolumen. De hecho, estos equipos son convenientes pero no son un requisito. Aquí, el método clásico de 3C también se describe en la parte de diseño de imprimación; Esto implica identificar un locus genómico de interés y, a partir de eso, evaluar otros loci genómicos para los puntos de contacto de la cromatina más lejanos. Esta técnica también funciona bien si se utiliza un conjunto de datos publicado, como un conjunto de datos que utiliza Hi-C, donde se identifican los loci positivos (conectados) y negativos (no conectados) conocidos. El diseño de experimentos utilizando estos conjuntos de datos publicados es otra gran adaptación para los laboratorios de enseñanza, ya que la posibilidad de identificar con éxito las conexiones de la cromatina suele ser mayor. Además, el artículo de investigación puede ser discutido en clase y ser utilizado como referencia.
Este protocolo utiliza un enfoque de qPCR modificado para visualizar la formación del producto 3C. Los controles son esenciales para el éxito de la técnica 3C. Cada experimento utiliza controles de muestra y controles de cebador para determinar la finalización del procedimiento 3C. Los controles de la muestra incluyen un control no digerido (ADN genómico) y un control digerido. El control no digerido determina la señal de referencia para los juegos de cebadores y se utiliza con el control de digestión reticulado para determinar la eficiencia de digestión Se espera que haya una caída en el producto para cualquier cebador dirigido a través de un sitio de restricción. La comparación de este valor con el control no digerido proporciona una indicación de qué tan bien se digirió la muestra.
Los cebadores para la PCR incluyen un cebador de control y cebadores de prueba. El cebador de control es un conjunto de cebadores que está cerca de la región genómica que se está ensayando y no contiene un sitio de restricción. Esto proporciona la línea de base para determinar la abundancia de los productos de PCR de imprimación de prueba. Los cebadores de prueba son cebadores directos e inversos que flanquean un sitio de restricción para un locus genómico particular de interés (Figura 3). Las reacciones que utilizan estos juegos de imprimación se comparan para determinar la eficiencia de digestión, ya que la abundancia de producto debe disminuir si se ha cortado el sitio de restricción. Al determinar la organización de la cromatina, un cebador de prueba de un locus se empareja con otro cebador de prueba de un locus genómico diferente para determinar si estos dos loci están muy juntos en el espacio 3D. En ese caso, la expectativa es que un producto de PCR solo se encuentre utilizando la muestra 3C como plantilla.
Es importante tener en cuenta que incluso los cebadores validados tienen la tendencia a fallar (Figura 4: juego de cebadores r14). Además, los productos de PCR se identifican con frecuencia en reacciones de control y en reacciones en las que no se predice una conexión de cromatina (como el control digerido, ya que no está ligado). Estas instancias están secuenciadas y fallan en el control de calidad de Sanger o regresan sin una secuencia definida (Figura 5). Además, los experimentos tradicionales de 3C generan una "plantilla de control", una muestra de ADN no entrecruzada, digerida y ligada, que representa todos los posibles fragmentos ligados que se pueden producir con una cantidad dada de ADN. La "plantilla de control" juega un papel importante en la comparación de las intensidades de las señales de qPCR entre dos loci genómicos para determinar si la señal representa una verdadera interacción o simplemente una asociación aleatoria. Crear una "plantilla de control" puede ser problemático, ya que una gran parte de la cromatina que se está ensayando debe capturarse en forma de un cromosoma artificial y procesarse junto con las muestras 3C. Asegurar tal construcción puede no ser factible, y crear uno podría estar fuera del alcance de un proyecto semestral. Debido a estas dificultades, sugerimos usar un cebador de control. El manual de control no reemplaza toda la funcionalidad de la "plantilla de control", pero aún brinda la oportunidad de analizar los datos para hacer determinaciones de "presencia" o "ausencia".
Al realizar qPCR, es importante utilizar cantidades iguales de la muestra. Esto debe determinarse, incluso si se utiliza un nanoespectrofotómetro como una nanogota, generando una curva estándar a partir del ADN genómico de una concentración conocida y ajustando las muestras 3C a esa línea. Estas cantidades deben registrarse y utilizarse en PCR posteriores. La calidad de la reacción de PCR también es importante. Como la PCR se ejecuta en qPCR, la abundancia del producto se mide mediante fluorescencia y se registra. Esta grabación es accesible en la gráfica de amplificación. Una vez finalizado el programa, es importante comprobar la gráfica de amplificación y asegurarse de que las reacciones (excepto los controles sin plantilla) tienen tres fases: una línea base, una exponencial y una fase de meseta/saturación. Es importante comprobar que las reacciones tienen una fase exponencial, en particular para establecer el umbral (véase más adelante). Además, para las muestras diluidas en serie, debe haber un cambio en los valores de Ct consistente con la dilución de la muestra (la concentración más alta tendrá los valores de Ct más bajos, mientras que la concentración más baja tendrá los valores de Ct más altos). Las muestras que no reflejan este cambio en la gráfica de amplificación requieren una nueva dilución o indican un problema mayor con la formación de la muestra 3C. Finalmente, al generar la curva estándar, el software de PCR calculará la eficiencia de PCR y el valor de R2 . La eficiencia de PCR debe ser superior al 90% y el valor deR2 debe ser superior a 0,99. Si no se cumple alguna de estas condiciones, es probable que algo esté mal con la muestra o los cebadores de PCR.
Después de la qPCR, el porcentaje de digestión y la presencia de interacciones 3C se pueden calcular utilizando la qPCR Ct para cada reacción. Para determinarlos, primero, se debe establecer el umbral para la reacción de PCR. Esto se hace normalmente utilizando el software que viene con la máquina qPCR. El establecimiento del umbral definirá la concentración del producto de PCR que se utilizará para comparar los valores de Ct de la muestra. El umbral debe dividir las curvas de amplificación de las reacciones de PCR en la fase exponencial de amplificación. Solo se pueden comparar las reacciones de PCR con amplificación exponencial (en este caso, los cebadores de control y las reacciones del cebador de prueba), ya que esta es la única forma de garantizar que las reacciones amplifiquen el ADN a la misma velocidad y se puedan comparar fielmente. Al analizar los gráficos 3C, las reacciones condicionalmente positivas se identifican como aquellas con más producto sobre las muestras de control, control genómico y control de digestión (Figura 4B). Sin embargo, estas muestras deben validarse aún más mediante la secuenciación de Sanger después de la purificación en gel del producto de PCR.
Después de la secuenciación de Sanger, las muestras que pasan el control de calidad se pueden analizar utilizando Blat. El objetivo de este análisis es determinar si la muestra tiene la secuencia de ambos loci genómicos diana que flanquean el sitio de restricción (DpnII en el caso de este protocolo). Si se identifican ambas secuencias, entonces el fragmento 3C puede considerarse validado. Si los resultados del Blat no devuelven la secuencia esperada, esto puede indicar que uno o ambos cebadores no son óptimos, lo que resulta en un resultado de qPCR falso positivo. Los archivos de seguimiento para las muestras de falsos positivos tendrán picos base indefinidos, y los informes Seq contendrán principalmente "n" llamadas base.
La validación de Sanger es esencial, ya que son posibles los falsos positivos de la formación de productos de PCR artificial. Estos falsos positivos se pueden identificar cuando los productos de secuenciación no tienen la secuencia objetivo esperada o un sitio DpnII característico de un fragmento 3C adecuado (Figura 5). La secuenciación de los fragmentos de PCR también proporciona otro punto de datos para el experimento y lleva a los estudiantes a casa que la técnica 3C está identificando loci genómicos distantes que se están uniendo en el espacio 3D dentro de los núcleos.
La técnica 3C proporciona una gran cantidad de técnicas moleculares fundamentales para estudiantes universitarios en un procedimiento flexible y sencillo. Esta técnica 3C es también un punto de partida para las otras técnicas 3C que incorporan secuenciación de próxima generación (NGS). Este tipo de experimentos pueden exponer a los estudiantes universitarios a aspectos importantes de la bioinformática y se basan en los principios básicos descritos aquí. La experiencia y la participación de pregrado son clave para su éxito y desarrollo como jóvenes científicos. Al proporcionar estas oportunidades, los estudiantes universitarios pueden fortalecer su comprensión de los principios básicos mientras desarrollan su confianza para abordar técnicas y preguntas de vanguardia.

El genoma de un organismo no solo contiene todos los genes necesarios para la función, sino también todas las instrucciones sobre cómo y cuándo usarlos. Esto hace que la regulación del acceso al genoma sea una de las funciones más importantes de la célula. Hay muchos mecanismos para controlar la función de los genes; sin embargo, en su nivel base, la regulación génica se reduce a la capacidad de los factores de transcripción reguladores (transfactores) para unirse a sus secuencias específicas de ADN (secuencias reguladoras cis). Esta no es una habilidad innata; En cambio, se rige por la organización/estructura del genoma en el núcleo, que controla la disponibilidad/exposición de las secuencias cis-reguladoras a los trans-factores 1,2,3. Si los transfactores no pueden encontrar sus secuencias cis-reguladoras, entonces los trans-factores no pueden realizar sus tareas regulatorias. Esto ha hecho que comprender cómo se organizan los genomas en el núcleo sea una fuente importante de investigación.
Es ampliamente aceptado que durante la interfase, los cromosomas eucariotas en el núcleo ocupan su propio dominio anclado a la lámina nuclear y la matriz nuclear (Figura 1), lo que hace que el cromosoma se parezca más a una rebanada de pizza, en lugar de un fideo en un plato de espaguetis. Los cromosomas están parcialmente condensados por interacciones proteína-ADN (cromatina) que retuercen y refuerzan porciones del cromosoma. A través de microscopía electrónica, hibridación tridimensional de fluorescencia de ADN in situ (FISH) y técnicas de marcado de ADN (es decir, metilación de ADN fluorescente y artificial), se ha encontrado que los dominios inactivos de la cromatina están empaquetados firmemente a lo largo de la periferia nuclear 4,5,6, mientras que porciones de cromatina activa y menos condensada se encuentran en el interior del núcleo 7,8,9, 10. Estos experimentos proporcionan una visión de gran angular de la dinámica cromosómica, pero hacen poco para capturar los cambios que ocurren localmente alrededor de los promotores de genes observados en los estudios de DNasa11,12 y nucleosoma13,14,15.
La clave para desbloquear la dinámica de la cromatina de mayor resolución fue la formulación de la técnica de mapeo cromosómico 3D, 3C. La técnica 3C en sí comprende cuatro pasos principales: reticulación de la cromatina, digestión de la cromatina por enzimas de restricción, ligadura de la cromatina y purificación del ADN (Figura 2). Los nuevos fragmentos de ADN artificial generados por este proceso pueden ser caracterizados para revelar la estrecha asociación física entre piezas linealmente distantes de ADN16. La técnica 3C se convirtió en la base para la creación de múltiples técnicas derivadas que utilizan los pasos iniciales de 3C para hacer preguntas más amplias sobre todo el genoma (por ejemplo, Hi-C, 4C, ChIP-C). Esta familia de técnicas 3C ha identificado que los cromosomas están organizados en múltiples unidades discretas denominadas dominios topológicamente asociados (TADs). Los TADs están codificados en el genoma y están definidos por bucles de cromatina flanqueados por límites sin bucle16,17,18,19. Los límites de TAD son mantenidos por dos factores evolutivamente conservados y ubicuos, incluyendo el factor de unión CCCT (CTCF) y la cohesión, que evitan que los bucles dentro de TADs separadosinteractúen 16,20. Los bucles están mediados por la interacción de los transfactores con sus secuencias reguladoras, así como CTCF y cohesión21.
Aunque muchos estudios que utilizan tecnologías 3C hacen preguntas amplias sobre todo el genoma y emplean técnicas complicadas de recolección de muestras, la formulación de la técnica 3C se basa en técnicas básicas de biología molecular. Esto hace que 3C sea intrigante para su implementación tanto en la investigación de pregrado como en los laboratorios de enseñanza. La técnica 3C se puede emplear para preguntas enfocadas más pequeñas y es inherentemente flexible para escalar hacia arriba o hacia abajo (genes individuales22, cromosomas16 y / o genomas18) dependiendo del enfoque y la dirección de las preguntas formuladas. Esta técnica también se ha aplicado a una amplia gama de sistemas modelo 7,16,19,23 y ha demostrado ser versátil en su uso. Esto hace que 3C sea una excelente técnica para estudiantes universitarios, ya que los estudiantes pueden adquirir experiencia en técnicas comunes de biología molecular al tiempo que adquieren una valiosa experiencia en responder preguntas dirigidas.
Aquí se presenta un protocolo adaptado para la preparación de bibliotecas 3C basado en protocolos previamente publicados24,25,26,27. Este protocolo ha sido optimizado para aproximadamente 1 × 107 celdas, aunque ha generado bibliotecas 3C con tan solo 1 × 105 celdas. Este protocolo ha demostrado ser versátil y se ha utilizado para generar bibliotecas 3C a partir de embriones de pez cebra, líneas celulares de pez cebra y Caenorhabditis elegans (lombriz intestinal) adulta joven (YA). El protocolo también debe ser apropiado para líneas celulares de mamíferos y, con mayor adaptación, levadura.
El objetivo de estas adaptaciones es hacer que 3C sea más accesible para los estudiantes universitarios. Se ha tenido cuidado de utilizar técnicas que son similares a las que se pueden lograr en un laboratorio de enseñanza de pregrado. La técnica 3C ofrece muchas oportunidades de aprendizaje para que los estudiantes universitarios aprendan técnicas básicas de biología molecular que beneficiarán su desarrollo en el banco, en el aula y en sus esfuerzos después de la graduación.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehído&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Millapore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MP Cloroformo 215350280</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biomédico Millapore-Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Millapore-Sigma</td><td>COEDTAF-RO</td><td>mezclado a 50x en agua. Diluido a 1x en tampón de sacarosa y tampón GB fresco</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>D0632</td><td>1 M stock diluido a 500 &micro; M en Tampón de sacarosa y tampón GB fresco</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>NEB</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>glicina</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>glucógeno</td><td>Millapore-Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millapore-Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>pyronina verde metilo&nbsp; &nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>HT70116</td><td></td></tr><tr><td>MgAc2</td><td>Thermoscientific</td><td>1222530</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>fenol-cloroformo&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millapore-Sigma</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05406</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Ready mix (Phire Taq, etc)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>KCQS07</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligasa</td><td>Promega</td><td>M1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>108319</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millapore-Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

obtener una a con las 3c: captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

La captura de conformación cromosómica (3C) es una herramienta poderosa que ha generado una familia de técnicas similares (por ejemplo, Hi-C, 4C y 5C, denominadas aquí técnicas 3C) que proporcionan información detallada de la organización tridimensional de la cromatina. Las técnicas 3C se han utilizado en una amplia gama de estudios, desde el monitoreo de los cambios en la organización de la cromatina en las células cancerosas hasta la identificación de contactos potenciadores realizados con promotores de genes. Si bien muchos de los estudios que utilizan estas técnicas están haciendo grandes preguntas sobre todo el genoma con tipos de muestras intrincadas (es decir, análisis de células individuales), lo que a menudo se pierde es que las técnicas 3C se basan en métodos básicos de biología molecular que son aplicables a una amplia gama de estudios. Al abordar preguntas estrechamente enfocadas de la organización de la cromatina, esta técnica de vanguardia se puede utilizar para mejorar la investigación de pregrado y la experiencia de laboratorio de enseñanza. Este documento presenta un protocolo 3C y proporciona adaptaciones y puntos de énfasis para la implementación en instituciones principalmente de pregrado en investigación de pregrado y experiencias docentes.

Este procedimiento producirá una muestra experimental de 3C y dos muestras de control (no digeridas y digeridas). Utilizando estas tres muestras, se realizó qPCR. A partir de estos resultados, se calculó la eficiencia digestiva (ecuación 1) y se registró (Tabla 1). A partir de estos cálculos, se determinó que la muestra 3C tenía una eficiencia de digestión de aproximadamente el 88% (promedio de la Tabla 1) en los siete loci genómicos probados.
A continuación, las muestras se analizaron para detectar la presencia de contactos de cromatina de largo alcance entre los diferentes loci genómicos utilizando combinaciones de cebadores específicos de loci (Tabla 2) y qPCR. Usando estos resultados, se calcularon las abundancias de productos en relación con un conjunto de cebadores de control (ecuación 2) y se graficaron para la comparación (Figura 4). Estos datos indicaron que 8 de las 10 reacciones fueron positivas condicionales para interacciones de largo alcance.
Las reacciones de PCR se ejecutaron en un gel de agarosa. El producto de PCR esperado para los ocho positivos condicionales y una reacción negativa se purificaron en gel y se enviaron para la secuenciación de Sanger. Se muestran los resultados de reacciones representativas positivas (flecha azul, cuadro azul) y negativas (flecha roja, cuadro rojo) (Figura 5).
<img alt="Diagrama de plegamiento de proteínas; Ilustra los cambios de estructura de estados desplegados a plegados con anotaciones." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Estructura cromosómica en el núcleo. Organización cromosómica hipotética dentro del núcleo. A) Envoltura nuclear, líneas negras; B) lámina nuclear, naranja; (C) heterocromatina, líneas compactadas; (D) eucromatina, bucles sueltos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de cruce cromosómico; ilustra la recombinación genética, el proceso de intercambio de cromátidas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Esquema del protocolo 3C. Las porciones distantes de cromosomas lineales (azul, amarillo y rosa) se acercan dentro del núcleo a través de bucles reguladores. (A) Las estructuras de bucle están mediadas por factores de transcripción (círculo gris y estrella negra); Estas interacciones se conservan a través de la reticulación química. (B) Los bucles se rompen a través de la digestión enzimática (líneas negras). (C) Las piezas de cromatina distantes se unen entre sí a través de los extremos adherentes creados por la digestión. (D) El ADN se purifica a partir de proteínas. (E) La secuencia dentro de los fragmentos se identifica y se mapea de nuevo al genoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama cromosómico, sitios DpnII, datos de RepeatMacker, mapeo genético, análisis de secuencia genómica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: El esquema de cebador 3C. Los cebadores 3C están diseñados alrededor de sitios de restricción a distancias variables de la ubicación genómica de interés. Las flechas rosadas representan los conjuntos de cebadores experimentales que rodean un sitio DpnII. Los cebadores experimentales se pueden mezclar y combinar para evaluar el bucle de cromatina en la región. Las imprimaciones naranjas representan un control negativo sin un sitio DpnII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráficos de barras que comparan los niveles de cebadores de prueba en muestras de ADNg digeridas y no digeridas, resultados de 3C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Datos representativos de qPCR para un experimento 3C. Abundancia relativa de los juegos de cebadores de prueba 3C. (A) Gráfico de control que muestra la abundancia relativa del producto en la muestra de control no digerido (azul), control digerido (gris) y 3C (naranja). b) El experimento 3C; la abundancia relativa del producto a partir de combinaciones de cebadores de prueba en la muestra de control no digerido (azul), control digerido (gris) y 3C (naranja). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Resultado de electroforesis y secuenciación; análisis de fragmentos de ADN; digestión enzimática; estudio genético." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Visualización de los productos de qPCR 3C. Top, gel con los productos de punto final de qPCR con las muestras indicadas. Archivos de trazas de secuencia de Sanger representativos e inferiores para las reacciones indicadas. La muestra naranja es un ejemplo de un falso positivo (ver Figura 4, r38/34), y la muestra azul es un ejemplo de un verdadero positivo con el sitio DpnII indicado encima de la traza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Sitio</td>
			<td>% digestión</td>
		</tr><tr><td>R8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>r3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>R38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>R34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>R33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>R14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>R47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Eficiencia digestiva calculada.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre</td>
			<td colspan="3">Secuencia</td>
			<td>Loci genómicos</td>
		</tr><tr><td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>r3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>r38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr><tr><td>r38 RVS</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>r34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>r34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>r33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>r33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>r14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>r47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>r47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>r8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>Cebador de control FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>Cebador de control RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCAACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Cebadores para el experimento representativo 3C.

Aquí, presentamos una adaptación de la técnica de captura de conformación cromosómica (3C) en detalle con énfasis en la participación y el aprendizaje de pregrado.

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Nuestra investigación tiene como objetivo descubrir cómo la organización de la cromatina controla la expresión génica. La atención se centra en determinar qué factores regulan la cromatina a nivel genético para controlar la actividad génica. Actualmente, se utilizan tecnologías similares a la captura de confirmación cromosómica, o 3C, para avanzar en este campo.Las inversiones en tecnologías de recolección y secuenciación de muestras nos han empujado a lo que las técnicas 3C pueden mostrarnos. El mayor desafío experimental actualmente es recolectar muestras con una arquitectura de cromatina uniforme. La heterogeneidad en las muestras conduce a resultados confusos.En el futuro, nos centraremos en cómo los cambios en la organización de la cromatina juegan un papel en el cáncer.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El método de Hi-C permite la identificación imparcial de todo el genoma de las interacciones entre la cromatina (1). Hi-C parejas ligadura de proximidad y de secuenciación masiva en paralelo. Los datos resultantes se pueden utilizar para estudiar arquitectura genómica a diferentes escalas, los resultados iniciales identificaron características tales como los territorios de cromosomas, la segregación de la cromatina abierta y cerrada, y la estructura de la cromatina en la escala de megabase.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

Chromosomics: Detección de alteraciones numéricas y estructurales en todos los 24 cromosomas humanos de manera simultánea utilizando un nuevo ensayo FISH OctoChrome

Este trabajo describe un protocolo para la generación de alta resolución en situ Hi-C bibliotecas de bien escenifica la gastrulación Drosophila melanogaster embriones.

Generación de bibliotecas de captura de conformación de genoma cromatina desde etapas bien tempranas embriones de Drosophila

Bucles de cromatina juega un papel importante en la regulación de los genes; sin embargo, ha habido no hay avances tecnológicos que permiten la modificación selectiva y reversible de los bucles de cromatina. Aquí describimos un sistema de gran alcance para la reorganización de bucles de cromatina usando CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demostró de forma selectiva y reversible modular la expresión génica en blanco loci.

Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

La identificación de interacciones físicas entre los genes y elementos reguladores es un reto, pero ha sido facilitada por los métodos de captura de conformación de cromosoma. Esta modificación al Protocolo de 4C-seq mitiga sesgo PCR minimizando la amplificación excesiva de plantillas de PCR y maximiza el mappability de Lee mediante la incorporación de un paso de síntesis de enzima de la restricción además.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

Informamos de la aplicación de la captura cuantitativa de conformación cromosómica seguida de la secuenciación de alto rendimiento en cuerpos embrionarios generados a partir de células madre embrionarias. Esta técnica permite identificar y cuantificar los contactos entre potenciadores putativos y regiones promotoras de un gen dado durante la diferenciación de células madre embrionarias.

Identificación de contactos potenciadores-promotores en cuerpos embrionarios por captura cuantitativa de conformación cromosómica (4C)

Hi-C 3.0 es un protocolo Hi-C mejorado que combina reticulantes de formaldehído y glutarato de disuccinimidil con un cóctel de enzimas de restricción DpnII y DdeI para aumentar la relación señal-ruido y la resolución de la detección de interacción de cromatina.

Captura de la conformación cromosómica a través de escalas de longitud

Este protocolo describe el método Capture Hi-C utilizado para caracterizar la organización 3D de regiones genómicas específicas de tamaño megabasado en alta resolución, incluidos los límites de los dominios de asociación topológica (TAD) y las interacciones de cromatina de largo alcance entre los elementos reguladores y otros elementos de secuencia de ADN.

Descifrando la organización de la cromatina 3D de alta resolución a través de Capture Hi-C

Aquí se presenta un protocolo para investigar la metilación del ADN del genoma de ancho en estudios de cribado de pacientes clínicos a gran escala utilizando la secuenciación Metil-unión de captura de ADN (SEC-MBDCap o MBD-ss) la tecnología y el análisis de tuberías bioinformática posteriores.

Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

Se describe un método fácil, rápido y relativamente barato para la generación de gene-disrupted Streptococcus mutans cepas; Esta técnica puede ser adaptada para la generación de gene-disrupted cepas de varias especies.

Generación de un gen interrumpido Streptococcus mutans cepa sin gen clonación

Aprende la técnica de captura de conformación cromosómica (3C) para estudiar la organización de la cromatina y su influencia en la expresión génica utilizando Caenorhabditis elegans. Este método permite a estudiantes universitarios participar activamente en investigación molecular.

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

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