Name: Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 47 s
Description: Aprenda un método de montaje completo a base de metanol para investigar células ganglionares de la retina. Esta técnica permite el almacenamiento a largo plazo de muestras sin inmunotinción inmediata.

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Este trabajo fue financiado por el Proyecto de Apertura de Hubei Key Laboratories (subvención no. 2021KFY055), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hubei (subvención no. 2020CFB240) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (subvención no. 2042020kf0065).

Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Todos los ratones C57BL / 6J utilizados se obtuvieron del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Wuhan, y todos los experimentos relacionados fueron aprobados por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Wuhan. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los ratones.
1. Enucleación y fijación de los ojos
<ol><li>Eutanasia a los ratones con asfixia de dióxido de carbono y enuclear el globo ocular suavemente usando pinzas sin dientes.</li>
	<li>Enjuague el globo ocular una vez en solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Perfore el globo ocular con una aguja de jeringa en la córnea bajo un microscopio (ocular WF: 10x/22; objetivo de aumento continuo: 0.67x-4.5x) para acelerar la fijación en el globo ocular y mejorar la eficiencia de fijación.</li>
	<li>Transfiera a una placa de 24 pocillos que contenga 4% de paraformaldehído (PFA).</li>
	<li>Fije el globo ocular en PFA al 4% durante 45 minutos y luego transfiéralo a 1x PBS para eliminar el exceso de PFA (lavar tres veces, 5 minutos / vez) inmediatamente.</li>
</ol>2. Aislamiento y aplanamiento de la retina
<ol><li>Transfiera el globo ocular a un portaobjetos de vidrio y colóquelo bajo un microscopio de disección (ocular WF: 10x/22; objetivo de aumento continuo: 0.67x-4.5x).</li>
	<li>Sostenga los fórceps en una mano y úselos para sujetar el margen de la córnea para evitar el movimiento del globo ocular. Use la otra mano para sostener las tijeras de disección y corte alrededor de la córnea a aproximadamente 1 mm de profundidad a través del limbo corneoescleral. Retire el cristalino y el cuerpo vítreo.</li>
	<li>Sostenga el disco óptico en el centro y, utilizando tijeras de disección, corte la retina radialmente a lo largo de los cuatro cuadrantes, alcanzando aproximadamente 2/3 del radio de la retina.</li>
	<li>Sujete uno de los bordes esclerales con pinzas dentadas. Con la otra mano, sostenga el borde de la esclerótica con pinzas sin dientes y muévase desde donde la esclerótica está fijada por las pinzas dentadas hacia la base de la esclerótica. Pelar cuidadosamente la retina.</li>
	<li>Extraiga PBS usando una pipeta (200 μL) para enjuagar y humedecer la retina, y luego retire cualquier exceso de PBS con un pequeño trozo de papel absorbente. Si es necesario, aplanar suavemente la retina con un cepillo de cerdas pequeñas.</li>
	<li>Pipetear lentamente metanol frío (preenfriado en un congelador de -20 °C) gota a gota sobre la superficie interna de la retina (el volumen de metanol no es fijo, siempre y cuando la retina pueda estar completamente cubierta por el metanol). La retina se vuelve blanca y desarrolla una mayor tenacidad.</li>
	<li>Aplanar suavemente la retina y eliminar las impurezas como las membranas pigmentarias residuales y el cuerpo vítreo con pequeños cepillos de cerdas. Invierta la retina con pequeños cepillos de cerdas y repita el proceso mencionado anteriormente.</li>
	<li>Transfiera la retina tratada con metanol a un pocillo de una placa de 24 pocillos y manténgala empapada en metanol.</li>
	<li>Guárdelo a -20 °C durante 1-2 h para la inmunotinción inmediata, o deje la retina en metanol y guárdelo a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Retire el metanol de la placa de 24 pocillos y enjuague la retina con 1x PBS.</li>
</ol>3. Tinción inmunofluorescente de las CGR
<ol><li>Transfiera cuidadosamente la retina a una placa de hemaglutinación de 24 pocillos con una pipeta plástica de Pasteur y bloquee en un 5% de PBS-TX-BSA (5 g de polvo de albúmina de suero bovino disuelto en 100 ml de 1x solución de PBST; el PBST se forma agregando 10 ml de Triton X-100 a 2,000 ml de 1 x PBS) a temperatura ambiente durante 4 h o durante la noche a 4 °C. Mantenga el lado ganglionar hacia arriba.</li>
	<li>Extraer el PBS-TX-BSA e incubar la retina a 4 °C durante 48-96 h, añadiendo 100 μL del anticuerpo primario seleccionado (anticuerpo anti-RBPMS de cobaya) mediante una dilución 1:400.</li>
	<li>Retire el anticuerpo primario y enjuague la retina tres veces (20 minutos cada una) con 1x PBS, agitando a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar la retina con agitación suave durante la noche a 4 °C con 100 μL del anticuerpo secundario correspondiente (ver Tabla de materiales), cianina Cy3 affiniPure burro anti-cobaya IgG (H+L), utilizando una dilución 1:400.</li>
	<li>Enjuague la retina con 1x PBS tres veces (20 minutos cada una).</li>
	<li>Coloque la retina plana sobre el portaobjetos con la capa de células ganglionares hacia arriba, deje caer una cantidad adecuada de agente antifluorescente alrededor de la retina con una pipeta y cubra el portaobjetos con un cubreobjetos (tenga cuidado de no tener burbujas). NOTA: Para determinar la cantidad adecuada de calmante antifluorescente, asegúrese de que cubra toda la retina. Después de eso, cubra el portaobjetos sin permitir que la retina flote y se mueva fácilmente.</li>
	<li>Selle la corredera alrededor con un agente de sellado para evitar que se mueva. Almacene las muestras a -20 ° C y protéjalas de la luz.</li>
	<li>Imagen de la retina con un microscopio fluorescente/confocal.</li>
</ol>

Aislamiento de retina de ratón y tratamiento con metanol para el estudio de las células ganglionares de la retina

<ol><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+types+of+retinal+ganglion+cells%3A+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%2C+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070(2022).</li>
<li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma%3A+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li>
<li>Vidal-Sanz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+glaucomatous+damage%3A+anatomical+and+functional+data+from+ocular+hypertensive+rodent+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).</li>
<li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31(2020).</li>
<li>Nadal-Nicolás, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moniliform+deformation+of+retinal+ganglion+cells+by+formaldehyde-based+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).</li>
<li>Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+methods+for+three-dimensional+reconstructions+from+confocal+images%3A+I.+Tissue+shrinking+and+axial+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).</li>
<li>Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+a+wide-ranging+panel+of+antigens+in+the+rat+retina+by+immunohistochemistry%3A+Comparison+of+Davidson%27s+solution+and+formalin+as+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).</li>
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<li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin%3A+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59(2012).</li>
<li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine%2C+conjunctiva%2C+and+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260(2022).</li>
<li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li>
<li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Morphologica%22%5BJournal%5D)">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
<li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li>
<li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li>
<li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen conocimiento de ninguna afiliación, membresía, financiamiento o tenencia financiera que pueda afectar la objetividad de este estudio.

La fijación es un paso esencial para preservar la retina, lo que puede afectar cualquier investigación posterior de RGC basada en la morfología. La fijación exitosa captura rápidamente la estructura y el estado de las retinas en el momento de exponerlas al medio de fijación, lo cual es crítico para un análisis posterior. Aunque el formaldehído ha sido considerado como uno de los agentes fijadores más comunes para la fijación y preservación de tejidos y células, el formaldehído por sí solo no siempre funciona bien como fi...

Las células ganglionares de la retina (CGR) son las únicas neuronas de proyección en la retina, e integran y transmiten información visual externa al cerebro1. Muchas enfermedades neurodegenerativas como el glaucoma y la neuropatía óptica traumática se caracterizan por daño irreversible y pérdida de CGR 2,3. El análisis de los cambios morfológicos y cuantitativos de las CGR es un paso crucial para determinar cómo se desarrollan y avanzan las enfermedades neurodegenerativas 4,5.
El ensayo de inmunofluorescencia indirecta es un método ampliamente aceptado para monitorear la distribución de proteínas y el recuento celular. En el laboratorio, la inmunotinción retiniana de montaje completo se utiliza comúnmente en estudios experimentales sobre CGR para evaluar las condiciones fisiológicas y patológicas de la retina6. Los marcadores más comunes utilizados para la cuantificación de RGC en toda la retina incluyen Brn3a, proteína de unión a ARN con empalme múltiple (RBPMS), y así sucesivamente 7,8. La caracterización de la cantidad y distribución de las CGR requiere inmunotinción retiniana de montaje completo de alta calidad. Generalmente, en los protocolos de inmunotinción, la retina se sumerge en fijadores químicos antes de ser incubada en anticuerpos. Los fijadores ideales no deben cambiar la forma de las células, la accesibilidad o afinidad de los epítopos por los anticuerpos, o las dimensiones lineales del tejido 9,10.
Debido a la compleja estructura de la retina, problemas como la fragilidad retiniana y el plegamiento, así como algunas dificultades comunes, como la contracción celular y los núcleos poco claros, son propensos a ocurrir cuando se hace un parche retiniano de montaje completo, lo que tiene un impacto negativo en la investigación experimental. Además, no todas las retinas se inmunotiñen inmediatamente, especialmente cuando se trata de las retinas de ratones transgénicos con precios caros que son de origen precioso, lo que requiere la preservación de las muestras de retina adicionales para su uso posterior.
La solución fijadora adecuada puede fijar el tejido rápidamente, evitar la autólisis tisular, preservar la morfología y estructura normales de las células tisulares y mantener la antigenicidad de las proteínas y otras sustancias10. En la actualidad, la fijación a base de formaldehído se ha utilizado ampliamente en diversos tejidos, incluyendo retinas separadas, oculares hemisecados y globos oculares enteros10. La contracción del tejido y la alteración morfológica de las células son los dos desafíos críticos encontrados después de la inmersión en formaldehído11. Además, las formulaciones de fijación modificada están emergiendo cada vez más para maximizar la retención de las propiedades originales de la retina y las células diana 9,10. Diferentes tratamientos de fijación retiniana pueden afectar la estructura retiniana, la inmunogenicidad de proteínas, la excitación fluorescente y el ciclo de enfriamiento de atenuación de manera diferente12,13. Las retinas fijadas con la solución de Davidson están más morfológicamente intactas en comparación con las fijadas con formalina, pero la solución de Davidson es menos compatible con algunos anticuerpos, como la molécula adaptadora de unión al calcio ionizada del marcador microglial 112. Teniendo en cuenta la naturaleza frágil de las retinas, los investigadores naturalmente se preguntarían si la integridad de la retina, así como las propiedades y la morfología de las células diana, cambiarán después del almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, rara vez se han informado los posibles efectos de la solución de fijación sobre la morfología de las células retinianas y RGC después del almacenamiento durante varios meses. La optimización de la fijación retiniana es crítica para la evaluación y preservación de las CGR.
Proporcionamos una descripción detallada de un método confiable y técnicamente sencillo que utilizamos para la tinción retiniana murina de montaje completo. Nuestro método enfatiza la preparación y almacenamiento adecuados de las retinas para la investigación de RGC, teniendo en cuenta la necesidad de almacenamiento a largo plazo del tejido retiniano, así como aspectos específicos de la formación o degradación de fluoróforos.

<table><tbody><tr><td>Clúster de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>Costar</td><td></td><td>Fijación del globo ocular</td></tr><tr><td>placa de hemaglutinación de 24 pocillos</td><td>Labedit Company</td><td></td><td>Anticuerpo de incubación</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de adhesión</td><td>Citotest</td><td></td><td>O similar</td></tr><tr><td>Montaje de enfriamiento antifluorescente</td><td>Servicebio</td><td>G1401</td><td>Ralentización del enfriamiento por fluorescencia</td></tr><tr><td>BSA (albúmina sérica bovina)</td><td>Servicebio</td><td>GC305010</td><td>Reactivo de bloqueo</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td>Apply Lente de objetivo de 40x</td></tr><tr><td>Tijeras curvas</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Herramientas de disección</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>RWD Life science Co.,LTD&nbsp;</td><td>77001S Herramientas de</td><td>disección</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Herramientas de disección</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>20210624</td><td>GC&ge; 99.5%</td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>SecheVite</td><td></td><td>Agente sellador</td></tr><tr><td>Agujas&nbsp;</td><td>Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.</td><td></td><td>Acelere la fijación</td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>Fijación del globo ocular</td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato pH 7,4)</td><td>Servicebio</td><td>G0002</td><td>Enjuague el globo ocular&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario: proteína de unión al ARN anti-ARN de conejillo de indias con empalme múltiple (RBPMS)</td><td>PhosphoSolutions</td><td>Cat. #1832-RBPMS</td><td>Para inmunofluorescencia. Utilizado a 1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario: Cy3 affiniPure burro anti-cobaya IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-165-148</td><td>Para inmunofluorescencia. Utilizado en 1:400</td></tr><tr><td>Tijeras rectas</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Herramientas de disección</td></tr></tbody></table>

preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Las células ganglionares de la retina (CGR), que son las neuronas de proyección de la retina, propagan información visual externa al cerebro. Los cambios patológicos en las CGR tienen una estrecha relación con numerosas enfermedades degenerativas de la retina. La inmunotinción retiniana de montaje completo se utiliza con frecuencia en estudios experimentales sobre CGR para evaluar las condiciones de desarrollo y patológicas de la retina. En algunas circunstancias, algunas muestras valiosas de retina, como las de ratones transgénicos, pueden necesitar ser retenidas durante un largo período sin afectar la morfología o el número de CGR. Para obtener resultados experimentales creíbles y reproducibles, es esencial utilizar un medio de conservación eficaz. Aquí, describimos el efecto del metanol como un medio fijo auxiliar para preparaciones retinianas de montaje completo y almacenamiento a largo plazo. En resumen, durante el proceso de aislamiento, el metanol frío (-20 ° C) se pipetea sobre la superficie de la retina para ayudar a fijar los tejidos y facilitar su permeabilidad, y luego las retinas se pueden almacenar en metanol frío (-20 ° C) antes de ser inmunoteñidas. Este protocolo describe el flujo de trabajo de aislamiento de retina y el protocolo de almacenamiento de muestras de tejido, que es útil y práctico para la investigación de CGR.

Después de la disección, la retina debe verse como un trébol plano de cuatro hojas. En este estudio, mediante el uso del protocolo descrito anteriormente, la retina se volvió blanca después de que se agregó metanol (Figura 1). Mientras tanto, la retina cambió de suave a flexible y plana. A continuación, los RGC fueron etiquetados con anti-RBPMS8. Se tomaron cuatro campos de imagen en toda la retina de montaje (n = 3) utilizando un microscopio confocal (ocular: 10x; ob...

El metanol se puede utilizar como medio fijo auxiliar para preparaciones retinianas de montaje completo y almacenamiento a largo plazo, lo que es útil para la investigación de las células ganglionares de la retina.

Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

La investigación tiene como objetivo proporcionar un flujo de trabajo de aislamiento de retina modificado y un protocolo de almacenamiento de muestras de tejido, que es útil y práctico para investigar las CGR. Las retinas son frágiles y se pliegan, lo que limita la investigación experimental al hacer un parche retiniano de montaje completo. Además, todas las retinas no requieren inmunotinción inmediata.A veces, las muestras de retina adicionales necesitan preservación para su uso posterior. Proporcionamos una descripción detallada de un método confiable y técnicamente sencillo de tinción de retina de montaje completo que enfatiza la preparación adecuada y la necesidad del almacenamiento a largo plazo de retinas para la investigación de RGC. Continuaremos trabajando en la investigación básica de las neuropatías ópticas degenerativas.Además, se explorará el mecanismo molecular de la lesión del nervio óptico y la regeneración de accidentes y los posibles objetivos clínicos para diagnosticar y tratar enfermedades neurodegenerativas.

methanol-based-whole-mount-preparation-for-investigation-retinal

Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Este artículo proporciona una descripción de cómo analizar y record de la preparación aislada de la retina en el ratón. En particular, se describe la forma de registrar las respuestas de la luz de una población de células ganglionares marcados con fluorescencia y, posteriormente, identificar y analizar su morfología.

Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas

Fuente: Laboissonniere, et. al. Secuenciación de ARN unicelular de subconjuntos definidos de células ganglionares de la retina. J. Vis. Exp. (2017).  Este video muestra una técnica de trazado fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares de la retina (RGC) en la retina de un ratón transgénico. El proceso consiste en asegurar la retina aislada en una cámara de registro, mantener la viabilidad celular con perfusión oxigenada y dirigirse a las RGC marcadas con fluorescencia...

Identificación de subtipos de células ganglionares de la retina de ratón mediante trazado fluorescente

Este artículo de vídeo ilustra los set-up, los procedimientos para remendar los cuerpos celulares y cómo implementar clamp grabaciones dinámicas de las células ganglionares de todo el montaje del ratón retinas. Esta técnica permite la investigación de la contribución precisa de entradas sinápticas excitatorias e inhibitorias, y su magnitud relativa y el momento para spiking neuronal.

Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en...

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Protocolos de inmunohistoquímica se utilizan para estudiar la localización de una proteína específica en la retina. Se emplean técnicas de imagen de calcio para estudiar la dinámica del calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio para clasificar los tipos de células neuronales antes del aislamiento y para la posterior caracterización de los transcriptomas de una sola célula. Este protocolo optimiza la preparación de muestras para el éxito de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y describe una metodología diseñada específicamente para la mejora de la comprensión de la diversidad celular.

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

Este protocolo describe los pasos detallados de la microscopía inmunoelectrónica previa a la incorporación, con un enfoque en la exploración de los circuitos sinápticos y la localización de proteínas en la retina.

Investigación de circuitos retinianos y localización molecular mediante microscopía inmunoelectrónica previa a la inclusión

Este protocolo describe el procedimiento para aislar la retina de ratón de montaje completo y realizar inmunotinción para marcar todas las células ganglionares de la retina (RGC). Al proceso le siguen las imágenes y el recuento automático de las RGC mediante un software basado en IA, lo que proporciona un método sencillo, rápido y preciso para cuantificar las RGC en toda la retina del ratón.

Inmunotinción de montaje completo y recuento automático de células ganglionares de la retina de ratón

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido &lt; 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las...

En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

Aquí, describimos el uso de un método de marcado de fosfatasa alcalina (AP) dirigido genéticamente para investigar las características anatómicas y los fenotipos de las retinas de ratón bajo excitotoxicidad inducida por NMDA. Junto con varias líneas reporteras específicas del subtipo de células ganglionares de la retina (RGC), descubrimos nuevos fenotipos en RGC moribundas a lo largo del proceso degenerativo.

Examen de las características anatómicas de las células ganglionares de la retina bajo excitotoxicidad inducida por ácido N-metil-D-aspártico (NMDA)

Aprenda un método de montaje completo a base de metanol para investigar células ganglionares de la retina. Esta técnica permite el almacenamiento a largo plazo de muestras sin inmunotinción inmediata.

Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina

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