Name: Un implante de accionamiento ligero para grabaciones crónicas de tetrodos en ratones jóvenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprende a realizar grabaciones crónicas de tetrodos en ratones juveniles usando un microimplante ligero. Este método permite registrar hasta 16 regiones cerebrales bilaterales simultáneamente para estudiar redes neuronales en desarrollo.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) y F99NS12053 (L.D.Q.) y el Premio de Dotación UT SOUTHWESTERN GSO (R.J.P. y L.D.Q.). Los autores agradecen a Jenny Scaria (Facultad de Farmacia del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Tecnológica de Texas) por su asistencia técnica y al Dr. Brendon Watson (Universidad de Michigan) por sus sugerencias metodológicas.

Implante Micro-Drive para el registro de la actividad neuronal diaria en ratones juveniles

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<li>Voigts, J., Newman, J. P., Wilson, M. A., Harnett, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy-to-assemble%2C+robust%2C+and+lightweight+drive+implant+for+chronic+tetrode+recordings+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">An easy-to-assemble, robust, and lightweight drive implant for chronic tetrode recordings in freely moving animals.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026044(2020).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los experimentos modernos que exploran la función del circuito neuronal in vivo en roedores a menudo utilizan electrofisiología extracelular a través de electrodos implantados permanentemente para monitorear la actividad de neuronas individuales (es decir, unidades individuales) o poblaciones locales (a través de potenciales de campo local, LFP), pero tales métodos rara vez se aplican a ratones jóvenes debido a desafíos técnicos. Este manuscrito describe un método para obtener registros electrofisiológicos in vivo en ratones a través de las ventanas críticas para el desarrollo de p20 a p60 y más allá. Esta metodología implica un proceso de fabricación para la impresión y construcción de un implante de micro-drive, un procedimiento de implantación quirúrgica y una estrategia de recuperación postoperatoria, todos los cuales están diseñados específicamente para su uso en ratones jóvenes. Varias consideraciones influyeron en el desarrollo de este protocolo, incluido el pequeño tamaño y la debilidad relativa de los ratones jóvenes en comparación con sus contrapartes adultas, así como la osificación reducida del cráneo de ratón juvenil al que se necesitaba unir el microimpulso.
Dos métodos principales comúnmente utilizados para realizar electrofisiología in vivo son matrices de electrodos (por ejemplo, tetrodos) y sondas de silicio. Las sondas de silicio son ligeras, pueden proporcionar un gran número de sitios de registro por unidad de peso y se han utilizado previamente en ratas jóvenes25. Sin embargo, las sondas de silicio son relativamente caras por unidad. En contraste, el micro-drive descrito en este manuscrito se puede construir utilizando menos de $ 50 USD en materias primas, lo que lo convierte en una opción rentable para la grabación in vivo . Además, las sondas de silicio a menudo deben implantarse en líneas fijas, lo que prohíbe el registro de regiones cerebrales espacialmente diversas. En contraste, el diseño de micro-drive descrito en este manuscrito utiliza tetrodes ajustables independientemente para acomodar grabaciones simultáneas en hasta 16 ubicaciones diferentes sin prácticamente ninguna restricción en la relación espacial entre esas ubicaciones. Este diseño de microaccionamiento se puede modificar fácilmente para permitir apuntar a ubicaciones diferentes a las descritas aquí moviendo las extrusiones de orificios de cánula a cualquier ubicación anterior / posterior y medial / distal deseada. Cuando se dirige a áreas cerebrales alternativas, es importante tener en cuenta que, si bien los tetrodes a menudo viajan rectos, es posible que estos cables delgados se desvíen ligeramente a medida que salen de la cánula de micro-drive. Por lo tanto, cuanto más pequeña o más ventral sea una región del cerebro, más difícil será apuntar con éxito al área con tetrodos.
El implante de micro-drive descrito en este manuscrito es fundamentalmente similar a varios diseños anteriores de micro-drive basados en tetrode 23,32,33,34,35 en que los tetrodes individuales están fijados a tornillos, que permiten el control fino de la profundidad de grabación de cada tetrode. Si bien varias características del diseño actual de micro-drive son únicas, incluida la facilidad de dirigirse a áreas cerebrales distribuidas espacialmente, la principal novedad del manuscrito actual es la descripción de la implantación quirúrgica y las estrategias de recuperación postoperatoria, que permiten estudios crónicos de la actividad de la red en ratones juveniles aún en desarrollo. De hecho, las metodologías de cirugía y recuperación descritas aquí podrían adaptarse para soportar otros implantes en ratones jóvenes.
Para mantener un registro consistente durante varios días, los cables o sondas deben fijarse rígidamente al cráneo. Mientras que la estructura general del cráneo del ratón sufre sólo cambios menores después de p20, el cráneo se engrosa considerablemente entre las edades de p20 y p4536. De hecho, el cráneo en p20 no es lo suficientemente rígido como para soportar un implante conectado sin dañarse. Para superar esta limitación biológica, este protocolo engrosa artificialmente el cráneo a través de cianoacrilato durante la cirugía de implantación. La implantación en ratones menores de p20 es probablemente posible utilizando esta estrategia, pero el cráneo del ratón sufre cambios considerables de tamaño y forma hasta aproximadamente p2036. Por lo tanto, no se recomienda la implantación durante períodos prolongados en ratones menores de p20, ya que el cianoacrilato y los tornillos óseos fijos en el cráneo aún en desarrollo pueden afectar significativamente el crecimiento natural del cráneo y el desarrollo del tejido cerebral subyacente. Es importante destacar que, en este estudio, no se observó ningún impacto en las mediciones brutas del tamaño del cráneo o del cerebro después de la implantación crónica a partir de p20 (Figura 5C).
Un paso crítico en el método descrito en este manuscrito es la estrategia de recuperación postoperatoria; De acuerdo con esta estrategia, el peso del implante debe contrarrestarse continuamente a medida que el ratón madura y se somete al desarrollo del sistema muscular y musculoesquelético. Poco después de la implantación, los ratones no pueden soportar con éxito el peso del implante sin el contrapeso, lo que lleva a la desnutrición y la deshidratación, ya que el ratón no puede alcanzar adecuadamente las fuentes de alimentos y agua en su jaula. El sistema de contrapeso es fácil y económico de construir, trivial de implementar, y permite a los ratones de cualquier edad implantable explorar libremente la totalidad de su jaula doméstica, asegurando así una nutrición e hidratación adecuadas. A medida que los ratones envejecen, la cantidad de contrapeso puede reducirse hasta que pueda eliminarse por completo en ratones adultos; Sin embargo, se recomienda el uso continuado del sistema de contrapeso durante la duración del experimento con al menos un contrapeso nominal unido en todo momento. Mientras que un ratón adulto puede ser capaz de soportar el tamaño y el peso del micro-drive con el tiempo, el movimiento natural continuo durante el comportamiento libre sin contrapeso de mejora produce torsión y fuerza de cizallamiento en los tornillos óseos que anclan el micro-drive en el cráneo, lo que hace que sea cada vez más probable que se desprenda, especialmente durante experimentos crónicos más largos.
Dos limitaciones importantes son de destacar para el presente estudio. Primero, para evaluar el impacto de la implantación en p20 en el desarrollo del cráneo y el cerebro, varias cohortes de ratones fueron sacrificadas después de una implantación prolongada (Figura 5C). Si bien estos análisis no revelaron un impacto significativo de la implantación en el tamaño de la cavidad craneal o la masa cerebral (Figura 5C), el estudio actual no examinó el tamaño del cráneo o la masa cerebral en múltiples puntos de tiempo durante el período de desarrollo temprano de p20-p60. Si bien el trabajo previo demuestra que el desarrollo de la cavidad cerebral se completa en p2036, es posible que la implantación en esta ventana temprana pueda producir cambios imprevistos que se corrigen o compensan con las edades adultas que se evaluaron aquí. En segundo lugar, los experimentos que produjeron los datos electrofisiológicos que se muestran en la Figura 3 y la Figura 4 no fueron diseñados para maximizar el rendimiento celular. Por lo tanto, si bien los datos presentados aquí demuestran registros estables y crónicos y unidades individuales bien aisladas, no deben tomarse como representativos del rendimiento potencial máximo para este dispositivo.
Muchos trastornos neurológicos y psiquiátricos humanos se manifiestan durante períodos de desarrollo temprano o durante la adolescencia, incluido el autismo y la esquizofrenia. Sin embargo, se sabe poco sobre la disfunción a nivel de circuito que puede subyacer a estas enfermedades, a pesar de la gran cantidad de modelos de ratón disponibles. La identificación de estos cambios iniciales en la red es fundamental para crear estrategias de detección temprana y paradigmas de tratamiento. Sin embargo, debido a los desafíos técnicos, no está claro cómo se interrumpe la función de la red a través del desarrollo en modelos de ratón de enfermedades neuropsiquiátricas. La estrategia de microimpulso y recuperación descrita aquí está diseñada para apoyar las investigaciones sobre el desarrollo de redes cerebrales multirregionales en el cerebro del ratón y, por lo tanto, permitir a los investigadores medir el desarrollo cerebral saludable, así como identificar alteraciones en ese desarrollo en modelos de enfermedad de ratón.

El cerebro sufre cambios a gran escala durante las ventanas críticas del desarrollo de la infancia y la adolescencia 1,2,3. Muchas enfermedades neurológicas y psiquiátricas, incluyendo el autismo y la esquizofrenia, se manifiestan por primera vez conductual y biológicamente durante este período de desarrollo cerebral juvenil y adolescente 4,5,6. Si bien se sabe mucho sobre los cambios celulares, sinápticos y genéticos que ocurren a través del desarrollo temprano, comparativamente se sabe poco sobre cómo cambian los procesos a nivel de circuito o red a lo largo de esta ventana de tiempo. Es importante destacar que la función cerebral a nivel de circuito, que en última instancia subyace a comportamientos complejos, memoria y cognición, es una propiedad emergente no predecible de la función celular y sináptica 7,8,9,10. Por lo tanto, para comprender completamente la función cerebral a nivel de red, es necesario estudiar directamente la actividad neuronal a nivel de un circuito neuronal intacto. Además, para identificar cómo se altera la actividad cerebral a lo largo de la progresión de los trastornos neuropsiquiátricos, es fundamental examinar la actividad de la red en un modelo de enfermedad válido durante la ventana temporal específica cuando se manifiestan los fenotipos conductuales de la enfermedad y rastrear los cambios observados a medida que persisten en la edad adulta.
Uno de los organismos modelo científicos más comunes y poderosos es el ratón, con un gran número de cepas genéticas únicas que modelan trastornos del neurodesarrollo con inicio dependiente de la edad de los fenotipos conductuales y / o mnemotécnicos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Si bien es difícil correlacionar puntos de tiempo de desarrollo precisos entre los cerebros de humanos y ratones, las comparaciones morfológicas y de comportamiento indican que los ratones p20-p21 representan las edades humanas de 2-3 años, y los ratones p25-p35 representan las edades humanas de 11-14 años, con ratones que probablemente alcancen el equivalente de desarrollo de un adulto humano de 20 años en p603, 22. Por lo tanto, para comprender mejor cómo se desarrolla el cerebro juvenil e identificar cómo las redes neuronales del cerebro se vuelven disfuncionales en enfermedades como el autismo o la esquizofrenia, sería ideal monitorear directamente la actividad cerebral in vivo en ratones de 20 días a 60 días de edad.
Sin embargo, un desafío fundamental en el monitoreo de la actividad cerebral a través del desarrollo temprano en ratones es el pequeño tamaño y la debilidad relativa de los ratones jóvenes. La implantación crónica de electrodos, que es necesaria para estudios longitudinales del desarrollo cerebral, generalmente requiere una carcasa grande y voluminosa para proteger los cables finos de los electrodos y las placas de interfaz23,24, y los implantes deben estar firmemente unidos al cráneo del ratón, que es más delgado y menos rígido en ratones jóvenes debido a la osificación reducida. Por lo tanto, prácticamente todos los estudios de fisiología de roedores in vivo se han realizado en sujetos adultos debido a su tamaño relativo, fuerza y grosor del cráneo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios que exploran la fisiología cerebral de roedores juveniles in vivo se han realizado en ratas juveniles de tipo salvaje, lo que necesariamente limita la capacidad de monitorear experimentalmente la función cerebral juvenil en un modelo de comportamiento libre de un trastorno humano 25,26,27,28,29,30.
Este manuscrito describe el nuevo alojamiento del implante, un procedimiento de implantación quirúrgica y una estrategia de recuperación posterior a la cirugía para estudiar crónicamente la función cerebral in vivo a largo plazo (hasta 4 o más semanas) de ratones jóvenes a través de una ventana de tiempo crítica para el desarrollo (p20 a p60 y más allá). El procedimiento de implantación permite la fijación fiable y permanente de los electrodos a los cráneos de ratones jóvenes. Además, el diseño de micro-drive es ligero, ya que este micro-drive pesa ~ 4-6 g cuando está completamente ensamblado, y debido al contrapeso mínimo requerido para compensar el peso del implante, no afecta el rendimiento conductual de ratones jóvenes durante los paradigmas de comportamiento típicos.

<table><tbody><tr><td>LED de seguimiento de vídeo de 10 V</td><td>Neuralynx</td><td>HS-LED-Rojo/Verde-omni-10V</td><td>Para usar con preamplificadores de cabecera que contienen tomas de LED para fines de seguimiento de movimiento</td></tr><tr><td>Placa EIB 16TT</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36-16TT</td><td>Placa de interfaz electrónica- conector omnetics</td></tr><tr><td>Preamplificador de cabecera 16TT</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36-LED</td><td>Amplificador de señal Omnetics de 44 zócalos entre la placa EIB y el cable de sujeción para aplicaciones de grabación; Incluye conectores para LEDs de cabecera para el seguimiento del movimiento</td></tr><tr><td>Hemostático Baby-Mixter</td><td>FST</td><td>13013-14</td><td>Hemostático curvado fino</td></tr><tr><td>Tornillo de anclaje óseo</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>Se utiliza para fijar la placa EIB al cuerpo de la transmisión principal</td></tr><tr><td>Burpenorphine</td><td>ZooPharm</td><td>Lote #BERLAB0.5-221207</td><td>Burpenorfina (0,5 mg/mL) 5mL cantidad</td></tr><tr><td>Correa de cable</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36 Litz Correa</td> de <td>alambre blindada ligera para cabeceras omnéticas; opciones de longitud de 1 m/2 m/3 m/5 m</td></tr><tr><td>Carprofeno/Rimadyl</td><td>Bio-Serve</td><td>MD150-2</td><td>Agente antiinflamatorio postoperatorio</td></tr><tr><td>Resina transparente v4</td><td>Formlabs</td><td>FLGPGR04</td><td>Resina líquida fotopolimerizada por impresora 3D durante el proceso de impresión 3D</td></tr><tr><td>Tornillo personalizado (lanzadera)</td><td>Advanced Machining and Tooling, Inc.</td><td>Tornillos</td><td>personalizados mecanizados y roscados a medida</td></tr><tr><td>Componente líquido acrílico dental</td><td>Material de la dentadura postiza Teets</td><td>Lote# 329801</td><td>líquido&nbsp; componente del material de la dentadura postiza (ver arriba)Componente de</td></tr> <tr><td>polvo acrílico dental</td> Material de la <td>dentadura postiza Teets</td><td>Lote# 583987</td> <td>material de dentadura postiza de "curado en frío", metacrilato de metilo; mezclado con componente líquido para su aplicación para asegurar el dispositivo de grabación en su lugar</td></tr><tr><td>DietGel Boost</td><td>ClearH2O</td><td>72-04-5022</td><td>Suplemento dietético alto en calorías para ratones jóvenes/en recuperación</td></tr><tr><td>Digital Lynx 16SX</td><td>Neuralynx</td><td>DigitalLynx 16SX Base</td><td>Aparato de grabación principal con 16 ranuras para tableros combinados para hasta 512 canales de grabación</td></tr><tr><td>Tijeras de disector: cuchillas pesadas</td><td>FST</td><td>14082-09</td><td>Varios</td></tr><tr><td>Pinzas recubiertas de cerámica Dumont #5</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td>Tetrode de manipulación/roscado/fijación</td></tr><tr><td>Pinza de #5SF Dumont</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Uso de montaje polivalente</td></tr><tr><td>Pinza de #5SF Dumont</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Uso quirúrgico polivalente</td></tr><tr><td>Pinza fina Dumont #7 (curvada)</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>Varios</td></tr><tr><td>Pinza fina Dumont #7 (curvada)</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>Uso quirúrgico polivalente</td></tr><tr><td>EIB-36 adaptador de galvanoplastia</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36 adaptador de</td><td>galvanoplastia/uso de montaje</td></tr><tr><td>EIB-36 adaptador de galvanoplastia</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36</td><td>Accesorio estereotáctico para bajar el accionamiento sobre el cráneo durante la cirugía</td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>Pentobarbital sódico para la eutanasia</td></tr><tr><td>Tijeras Bonn extrafinas</td><td>FST</td><td>14083-38</td><td>Varios</td></tr><tr><td>Extrafinos pinza de graefe</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td>Pinza dentada recta pequeña</td></tr><tr><td>Pinza de graefe extrafina</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td>Pinza dentada recta pequeña</td></tr><tr><td>Hemostáticos finos</td><td>FST</td><td>13006-12</td><td>Hemostáticos finos</td></tr><tr><td>Tijeras finas - CeramaCut</td><td>FST</td><td>14958-09</td><td>Corte Tetrode</td></tr><tr><td>Tijeras finas- ToughCut</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td>Varios</td></tr><tr><td>Form 3+</td>Impresora 3D <td>PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC</td> de <td>Formlabs</td><td>para la fabricación de todas las piezas/materiales impresos; Impresora 3D de estereolitografía de baja fuerza (LFS)</td></tr><tr><td>Superpegamento en gel</td><td>Loctite</td><td>1363589</td><td>Varios pasos</td></tr><tr><td>Pinzas Graefe</td><td>FST</td><td>11049-10</td><td>Pinzas dentadas en ángulo pequeñas</td></tr><tr><td>Cable de tierra</td><td>A-M Systems</td><td>Lote# 582335</td><td>Alambre desnudo de acero inoxidable, .005" de diámetro, recocido, 100 pies</td></tr><tr><td>Gel depilatorio</td><td>Genérico</td><td>Disponible comercialmente</td><td>Para la eliminación preoperatoria del vello de la parte superior de la cabeza del ratón</td></tr><tr><td>Pistola de calor</td><td>Dewalt</td><td>D26960K</td><td>Tetrode Fusión después del centrifugado Kit de</td></tr><tr><td>cauterización a alta temperatura</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>Para usar con cera de hueso si corresponde</td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas calientes</td><td>FST</td><td>18000-45</td><td>Aparato de esterilización eléctrica para la esterilización ad hoc de instrumentos durante procedimientos quirúrgicos</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Covetrus</td><td>11695067771</td><td>Anestesia líquida de isoflurano estándar para uso en vaporizadores de isoflurano hasta un máximo de 5%</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico 91%</td><td>Genérico</td><td>Disponible comercialmente</td><td>Para el procedimiento de esterilización preoperatoria estándar</td></tr><tr><td>Tornillo de joyería (tornillos óseos para ratones juveniles)</td><td>Suministro de componentes co.</td><td>MX-000120-02SFL</td><td>Tornillo de metal S/S #000-120 x 1/8'' cabeza de filister, accionamiento ranurado</td></tr><tr><td>Tijeras LaGrange</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>Varios</td></tr><tr><td>Tubo de poliimida grande Nordson</td><td>medical</td><td>Lote # 13564</td><td>Tubo de poliimida: diámetro interior 0,0071"; diámetro exterior 0,0115"; longitud 36"</td></tr><tr><td>Súper pegamento líquido</td><td>Loctite</td><td>1365882</td><td>Varios pasos</td></tr><tr><td>Micro taladro</td><td>Foredom</td><td>K.1070</td><td>K.1070 kit de micromotor rotativo de alta velocidad; con caja de control, pinza de 3/32", control de pie de velocidad variable, cuna para pieza de mano; ajustable estereotácticamente; 100&ndash; 115 V uso</td></tr><tr><td>Micro fresa de perforación (0,5 mm +)</td><td>FST</td><td>19007-05/07/09</td><td>Craneotomía</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>Pcode 1002076577; M5904-500mL</td><td>Varios pasos</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>Pcode 1002076577; M5904-500mL</td><td>Para usar manteniendo abiertos los orificios de craneotomía</td></tr><tr><td>Destornillador de cabeza plana en miniatura</td><td>FST</td><td>30051-10</td><td>Inserción/apriete de tornillos óseos</td></tr><tr><td>Neosporin Pomada Antibiótica Triple</td><td>Johnson & Johnson</td><td>512373700</td><td>ungüento antibiótico</td></tr><tr><td>Omnetics 4 socket nano conector</td><td>Neuralynx</td><td>Neuralynx parte #A70427-801</td><td>ARTÍCULO NO ESTÁNDAR- omnetics 44 socket (hembra) doble fila de conector nano de pierna recta con 2 pines guía (macho) para usar con aparatos de contrapeso hechos a medida</td></tr><tr><td>Alambre de platino 10% iridio Alambre fino</td> de <td>California</td><td>MO# M374710</td><td>Alambre de grabación fino hilado en tetrodos para su uso durante la grabación mediante el uso de la estación de ensamblaje de terodos y el spinner 2.0 (ver más abajo); CAPA DE UNIÓN HML NATRL VG; TAMAÑO .0007 X 200FT</td></tr><tr><td>Solución de recubrimiento negro de platino</td><td>Neuralynx</td><td>Solución de recubrimiento negro de platino</td><td>Enchapado Fondo</td></tr><tr>de<td>jaula de policarbonato</td><td>Thomas Scientific/Maryland plastics</td><td>1113M35; n.m. E0270</td><td>Fondo de jaula estándar; se puede equipar con un aparato de malla de alambre en la parte superior que contiene comida + botella de agua para ratones no implantados</td></tr><tr><td>Tapa de jaula de policarbonato con microfiltro N10</td><td>Ancare</td><td>N/A</td><td>Parte superior de la jaula estándar para ser modificada con tubo de PVC para aparatos de contrapeso</td></tr><tr><td>Povidona yodada 10%</td><td>Genérico</td><td>Disponible comercialmente</td><td>Para el procedimiento de esterilización preoperatoria estándar Tubo de</td></tr><tr><td>PVC</td><td>Tubo Charlotte</td><td>N/A</td><td>1/2" x 600 PSI Tubo de PVC blanco cédula 40; para uso/montaje en aparatos de contrapeso durante la recuperación del ratón</td></tr><tr><td>Hojas de bisturí- #4</td><td>FST</td><td>10060-00</td><td>Incisión uso</td></tr><tr><td>Mango de bisturí - #4 anatomía macroscópica</td><td>FST</td><td>10060-13 Uso de</td><td>incisión</td></tr> Pinza de tornillo de clavija <tr><td>y hueso</td><td>FST</td><td>26100-00</td><td>Soporte para tornillos de hueso y tierra mientras se insertan en el cráneo</td></tr><tr><td>Clavijas EIB pequeñas</td><td>Neuralynx</td><td>Clavijas EIB pequeñas</td><td>Fijación de cables de tetrodo a la placa EIB Tubo de</td></tr><tr><td>poliimida pequeño Nordson</td><td>medical</td><td>Lote # 19102423</td><td>Tubo de poliimida- diámetro interior 0,004''; diámetro exterior 0,0044''; longitud 36"</td></tr> <tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systèmes</td><td></td><td>Programa CAD SolidWorks 3D para el diseño de microaccionamientos</td></tr><tr><td>Espátula y sonda</td><td>FST</td><td>1090-13</td><td>Aplicador para vaselina/aceite mineral + uso opcional para enderezamiento ad hoc de tetrodo</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte - 8 mm</td><td>FST</td><td>15024-10</td><td>Tijeras para incisiones de tejido craneal</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte - 8 mm</td><td>FST</td><td>15024-10</td><td>Incisiones iniciales</td></tr><tr><td>Pinzas de patrón estándar</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td>Pinzas dentadas grandes</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas- afiladas-romas</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>Varios</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas- ToughCut</td><td>FST</td><td>14054-13</td><td>Varios Estación</td></tr><tr><td>de montaje Tetrode</td><td>Neuralynx</td><td>Estación de montaje Tetrode</td><td>Montaje Tetrode Montaje Tetrode</td></tr><tr><td>spinner Tetrode 2.0</td><td>Neuralynx</td><td>Tetrode spinner 2.0</td><td>Tetrode</td></tr><tr><td>Assembly Epoxi de dos partes</td><td>de la marca Gorilla 4200102</td><td></td><td>Varios pasos</td></tr></tbody></table>

un implante de accionamiento ligero para grabaciones crónicas de tetrodos en ratones jóvenes

A Lightweight Drive Implant for Chronic Tetrode Recordings in Juvenile Mice

La electrofisiología in vivo proporciona una visión sin precedentes de la dinámica del circuito de subsegundo nivel del cerebro intacto y representa un método de particular importancia para estudiar modelos de ratón de trastornos neuropsiquiátricos humanos. Sin embargo, tales métodos a menudo requieren implantes craneales grandes, que no se pueden usar en ratones en puntos de tiempo de desarrollo tempranos. Como tal, prácticamente no se han realizado estudios de fisiología in vivo en ratones bebés o jóvenes que se comportan libremente, a pesar del hecho de que una mejor comprensión del desarrollo neurológico en esta ventana crítica probablemente proporcionaría información única sobre los trastornos del desarrollo dependientes de la edad, como el autismo o la esquizofrenia. Aquí, se describe un diseño de micro-drive, procedimiento de implantación quirúrgica y estrategia de recuperación postoperatoria que permiten grabaciones crónicas de campo y de una sola unidad de múltiples regiones cerebrales simultáneamente en ratones a medida que envejecen desde el día postnatal 20 (p20) hasta el día postnatal 60 (p60) y más allá, una ventana de tiempo que corresponde aproximadamente a las edades humanas de 2 años hasta la edad adulta. El número de electrodos de registro y los sitios de registro final se pueden modificar y ampliar fácilmente, lo que permite un control experimental flexible del monitoreo in vivo de las regiones cerebrales relevantes para el comportamiento o la enfermedad a lo largo del desarrollo.

El protocolo descrito anteriormente se utilizó para registrar señales de potencial de campo local y unidades individuales de múltiples áreas cerebrales simultáneamente en ratones, con registros diarios realizados en los mismos ratones de p20 a p60. Aquí se informan registros electrofisiológicos representativos de dos ratones e histología posterior al experimento que demuestran las ubicaciones finales de registro.
Implantación quirúrgica del micro-drive en ratones p20 Se construyó un microaccionamiento (Figura 1) (Figura 2) y se implantó quirúrgicamente en un ratón p20, como se describió anteriormente. Inmediatamente después de la cirugía, el ratón se conectó al sistema de contrapeso (Figura 2G-I) y se le permitió recuperarse. Una vez que el ratón estaba completamente móvil, el micro-drive se conectó a un sistema de registro de electrofisiología in vivo. Los cables que conectaban el microaccionamiento al equipo de grabación estaban suspendidos sobre el ratón. Se obtuvieron grabaciones electrofisiológicas (32 kHz) en todos los canales durante 1 h mientras el ratón se comportaba naturalmente en su jaula doméstica. Después de la grabación, el ratón se desenchufó del sistema de grabación, se volvió a conectar al sistema de contrapeso y se devolvió al vivero con acceso gratuito al agua y a la comida.
Registro diario de la actividad neuronal Los registros electrofisiológicos se obtuvieron diariamente durante varias semanas para permitir el monitoreo crónico de la misma región del cerebro a través de las ventanas críticas de desarrollo de p20-p60. En la Figura 3A, C se muestran los potenciales de campo local (LFP) brutos de muestra de los registros crónicos. Se obtuvieron simultáneamente unidades individuales aisladas de múltiples tetrodes (Figura 3B). Se identificaron unidades con formas de onda similares a lo largo de varios días (Figura 3B, centro y derecha), pero debido a la posible deriva del electrodo de registro, no fue posible afirmar definitivamente que la misma unidad se estaba identificando a lo largo de los días. En un ratón separado implantado en p20 y registrado diariamente durante varias semanas, la actividad neuronal se examinó en un tetrodo dirigido al área dorsal CA1. Se identificaron ondulaciones de gran amplitud y unidades individuales bien aisladas en cada día de la grabación (Figura 4). Estos datos indican que las grabaciones electrofisiológicas in vivo estables y de alta calidad podrían provenir del mismo ratón a lo largo del desarrollo temprano.
Confirmación histológica de los sitios de registro y el impacto en el desarrollo de la implantación crónica Después del último día de grabación, el ratón fue completamente anestesiado mediante anestesia con isoflurano seguido de una inyección letal de pentobarbital sódico, y se pasó una corriente a través de las puntas de los electrodos para producir pequeñas lesiones en los sitios de registro. La sección histológica posterior al experimento del cerebro del ratón permitió la visualización de los sitios de registro final (Figura 5A, B). En una cohorte separada, tres ratones machos y tres hembras fueron implantados quirúrgicamente en p20 como se describió anteriormente. Un número igual de compañeros de camada se dejaron sin implantar y se mantuvieron en condiciones de alojamiento idénticas. Los ratones fueron sacrificados en p62 (6 semanas después de la cirugía para la cohorte implantada). Los cráneos se limpiaron cuidadosamente y se tomaron medidas externas de la distancia de bregma a lambda (Figura 5C, arriba a la izquierda) y el ancho máximo externo del cráneo en lambda (Figura 5C, arriba a la derecha). Se hizo una incisión a lo largo de la línea media del cráneo, y se extrajo la mitad del cráneo para extirpar el cerebro para la medición de masa (Figura 5C, abajo a la derecha). La altura de la cavidad craneal en bregma se midió a partir de la mitad intacta del cráneo (Figura 5C, abajo a la izquierda). Ninguna medida fue significativamente diferente entre las cohortes implantadas y no implantadas (prueba de suma de rangos de Wilcoxon), lo que indica que la implantación a largo plazo, a partir de p20, no tiene un impacto bruto en el desarrollo natural del cráneo o el volumen cerebral.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig01.jpg"> Figura 1: Componentes de microaccionamiento. Representaciones tridimensionales del (A) cuerpo de microaccionamiento, (B) cánula, (C) cono, (D) tapa, (E) accesorios de tornillo y (F) tornillo de avance de tetrode. Se indican las características críticas de cada componente. Los detalles de medición se pueden extraer de los archivos de modelo disponibles en https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig02.jpg"> Figura 2: Construcción de microaccionamientos . (A) Vista lateral y (B) superior del tornillo de avance tetrodeo con los accesorios de tornillo superior e inferior conectados. (C) Vista lateral y (D) superior del microaccionamiento con el cuerpo y la cánula unidos y el tubo grande de poliimida que atraviesa cada orificio de la cánula y se recorta a la parte inferior de la cánula. (E) Vista lateral del microaccionamiento con los tornillos y el pequeño tubo de poliimida en su lugar. La parte superior de los pequeños tubos de poliimida se recorta inmediatamente antes de la carga del tetrodo. (F) Micro-drive completado conectado al aparato estereotáxico. El cono protector que normalmente rodearía el micro-drive se ha eliminado con fines de visualización. Tenga en cuenta que algunos de los accesorios de tornillo se imprimieron en una resina negra para este micro-drive. (G) Sistema de apoyo de contrapeso. (H) Vista lateral y (I) superior de una jaula para ratón con el sistema de soporte de contrapeso conectado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig03.jpg"> Figura 3: Registros electrofisiológicos representativos. A un ratón p20 se le implantó un micro-drive como se describió anteriormente. A partir de p21 y todos los días a partir de entonces durante 2 semanas, el ratón se conectó al aparato de registro y se registró la actividad neuronal durante al menos 1 h. (A) Registros de potencial de campo local bruto (LFP) del bilateral (L = izquierda; R = derecha) corteza cingulada anterior (ACC), área del hipocampo CA3 (CA3) y área del hipocampo CA1 (CA1). Los datos fueron recolectados todos los días; Para mayor claridad, solo se muestran los datos de los días impares. Todos los rastros fueron tomados durante períodos de inmovilidad en la jaula del hogar. Barra de escala: 1 mV, 2 s. (B) Unidades individuales representativas aisladas del área del hipocampo CA3 (izquierda) y CA1 (derecha) para las grabaciones en el panel A. Todas las formas de onda en bruto en cada electrodo se muestran en negro; El promedio está en rojo. Barra de escala: 50 μV, 0,2 ms. (C) Trazas representativas de LFP en bruto para cada 10º día hasta el último día de grabación en p60 para un segundo ratón implantado en p20. Los datos fueron recolectados todos los días; Para mayor claridad, solo se muestran los datos de cada 10º día. Todos los rastros fueron tomados durante períodos de inmovilidad en la jaula del hogar. Barra de escala: 1 mV, 2 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig04.jpg"> Figura 4. Estabilidad de las grabaciones crónicas. Un ratón p20 fue implantado con un micro-drive, como se describió anteriormente. A partir de p21 y posteriormente durante 4 semanas, el ratón se conectó al aparato de registro y se registró la actividad neuronal durante al menos 1 h. Se muestran datos de los tetrodes dirigidos al hipocampo dorsal CA1. (A) LFP sin procesar (arriba) y filtrado por ondulación (abajo) para eventos de ondulación identificados en p21, p30 y p40. Para identificar eventos de ondulación, el LFP bruto se filtró de paso de banda entre 125 Hz y 300 Hz, y los eventos de ondulación se identificaron como aumentos transitorios en la potencia de la banda de ondulación superiores a 3 desviaciones estándar por encima de la media. El comienzo y el final de cada ondulación se definieron como el punto en que la potencia de la banda de ondulación regresó a la media. Las ondulaciones identificadas se muestran en rojo. Barra de escala: 100 ms, de arriba a abajo: 1.000 μV, 140 μV, 1.800 μV, 180 μV, 9.000 μV, 1.200 μV, 10.000 μV, 1.000 μV. (B) Una sola unidad representativa de cada día del tetrodo dirigido a CA1 para las grabaciones en el panel A. Todas las formas de onda en bruto en cada electrodo se muestran en negro; El promedio está en rojo. Barra de escala 0,2 ms, de arriba a abajo: 50 μV, 100 μV, 100 μV. (C) Autocorrelograma de todos los picos para unidades individuales en el panel B. Estos datos demuestran la colocación estable de electrodos dentro de la capa piramidal del hipocampo durante varias semanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig05.jpg"> Figura 5: Histología representativa e impacto en el desarrollo del cráneo. Un ratón p20 fue implantado con un micro-drive, como se describió anteriormente. Después del último día de grabación en p60, se produjeron lesiones electrolíticas en los sitios de registro, y el cerebro se perfundió con paraformaldehído al 4%. Para identificar los sitios de grabación, se produjeron secciones de 50 μm. (A) Lesiones en CA1 y CA3 del hipocampo. La punta de flecha denota el sitio de grabación CA3; la punta de flecha doble indica el sitio de grabación CA1. Barra de escala: 0,5 mm. (B) Lesiones en el CCA bilateral. Las puntas de flecha denotan los sitios de grabación ACC. Barra de escala: 0,5 mm. (C) Medidas del tamaño del cráneo y la masa cerebral de ratones p62 implantados con un micro-drive en p20 (gris) y compañeros de camada no implantados (blanco). El valor p de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon se informa para cada medición. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, describimos un diseño de micro-impulso, procedimiento de implantación quirúrgica y estrategia de recuperación postoperatoria que permiten grabaciones crónicas de campo y de una sola unidad de múltiples regiones cerebrales simultáneamente en ratones juveniles y adolescentes a través de una ventana crítica de desarrollo desde el día postnatal 20 (p20) hasta el día postnatal 60 (p60) y más allá.

Un implante de accionamiento ligero para grabaciones crónicas de tetrodos en ratones jóvenes

In vivo electrophysiology provides unparalleled insight into the sub-second-level circuit dynamics of the intact brain and represents a method of ...

Estamos interesados en comprender cómo funciona el cerebro a nivel de red. Este método es nuestro intento de explorar el desarrollo de redes cerebrales para identificar alteraciones del desarrollo en enfermedades dependientes de la edad como el autismo, la esquizofrenia o el trastorno bipolar. La tecnología de sonda de silicio proporciona un método más simple y consistente para registrar la actividad de la red in vivo.Pero a pesar de esto, las grabaciones tetra crónicas ofrecen algunas ventajas sobre las sondas de silicio, como el registro simultáneo sobre una distribución espacial más amplia de las regiones cerebrales. Las grabaciones crónicas plantean un desafío único para la electrofisiología in vivo debido a varios factores, incluida la gliosis en los sitios de registro, el movimiento del sitio de grabación a lo largo del tiempo o la falla del método de fijación. Nuestro trabajo reciente demostró que los barridos codificados por la oscilación theta del hipocampo durante el movimiento activo del animal cada cien milisegundos más o menos giran iterativamente hacia adelante, evaluando prospectivamente posibles estados futuros y hacia atrás evaluando retrospectivamente acciones previas.Realizar estas grabaciones in vivo en ratones jóvenes plantea varios desafíos de ingeniería debido al pequeño tamaño de los ratones, su debilidad relativa y la falta de desarrollo en su cráneo. Nuestra metodología supera estas limitaciones y nos permite registrar crónicamente la actividad diaria a nivel de red en el cerebro del ratón en desarrollo. Además de registrar crónicamente en ratones jóvenes, nuestro método nos permite registrar hasta 16 regiones cerebrales bilaterales distintas, independientemente de la relación espacial de esas regiones.Estos desarrollos nos permitirán identificar cómo las redes establecen la comunicación funcional a través de los desarrollos, tanto en el cerebro sano como en modelos de ratón de trastornos del neurodesarrollo, como los trastornos del espectro autista.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este protocolo, se muestra cómo fabricar una serie de micro-disco de crónica registros electrofisiológicos en las ratas.

Micro-array de unidades de crónicos In vivo Grabación: Unidad de Fabricación

En este protocolo, se muestra cómo fabricar y tetrodos condición para su uso con una amplia micro-drive, que fue diseñado para la crónica registros electrofisiológicos en las ratas. Además, se ilustran las etapas finales de construcción de micro-array de unidad, que incluye la instalación de cables de tierra y un cono de protección.

Micro-array de unidades de crónicos In vivo Grabación: Tetrodo Asamblea

El diseño, la fabricación y el montaje de un microdrive ultraligero motorizado se describe. El dispositivo proporciona una solución rentable y fácil de usar para las grabaciones crónicas de unidades individuales en pequeños animales que se comportan.

Diseño y montaje de un Microdrive ultraligero motorizado para crónicos Grabaciones neuronales en Pequeños Animales

Se describe el diseño y montaje de microdrives en registros electrofisiológicos in vivo de las señales del cerebro del ratón. Uniendo paquetes de microelectrodos a los transportistas accionables resistentes, estas técnicas permiten grabaciones neuronales a largo plazo y estable. El diseño ligero permite un rendimiento conductual sin restricciones por el animal después de la implantación en coche.

Construcción de Matrices Microdrive para grabaciones neuronales crónicas en Awake Ratones Behaving

Presentamos la construcción de un hiperimpulsor 3D imprimibles con dieciocho tetrodos independientemente ajustables. El hiperimpulsor está diseñado para registrar la actividad cerebral en comportarse libremente las ratas durante un período de varias semanas.

Construcción de un hiperimpulsor mejorado del tetrodo múltiples de grabación Neural a gran escala en comportarse ratas

Este protocolo describe la construcción de una matriz híbrida de micromotores que permite la implantación de nueve tetrodios ajustables de forma independiente y una sonda de optosilicio ajustable en dos regiones cerebrales en ratones que se mueven libremente. También se ha demostrado un método para recuperar y reutilizar de forma segura la sonda de optosilicio para múltiples propósitos.

Sistema microdrive híbrido con sonda de optosilicio recuperable y tetroda para grabación de alta densidad de doble sitio en ratones en movimiento libre

Aquí, presentamos un implante único imprimible en 3D para ratas, llamado TD Drive, capaz de registros simétricos de electrodos de alambre bilaterales, actualmente en hasta diez áreas cerebrales distribuidas simultáneamente.

El TD Drive: un implante paramétrico de código abierto para registros electrofisiológicos multiárea en ratas que se comportan y duermen

Aquí, presentamos un sistema de implante de sonda liviano y rentable para electrofisiología crónica en roedores optimizado para la facilidad de uso, la recuperación de la sonda, la versatilidad experimental y la compatibilidad con el comportamiento.

El implante DREAM: un sistema de implantes ligero, modular y rentable para la electrofisiología crónica en ratones de cabeza fija y de comportamiento libre

La preparación de cortes de cerebro de agudos de hipocampo aislado, así como los registros simultáneos electrofisiológicas de los astrocitos y las neuronas...

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Se describe el diseño y montaje de los auriculares miniaturizados adecuados para la sustitución de retroalimentación auditiva natural de un pájaro cantor con una señal acústica manipulado. Online hardware de procesamiento de sonido se utiliza para manipular la salida canción, introducir en tiempo real de los errores en la retroalimentación auditiva a través de los auriculares, e impulsar el aprendizaje motor vocal.

Un peso ligero, Auriculares basada Sistema de Manipulación de retroalimentación auditiva en Songbirds

Aprende a realizar grabaciones crónicas de tetrodos en ratones juveniles usando un microimplante ligero. Este método permite registrar hasta 16 regiones cerebrales bilaterales simultáneamente para estudiar redes neuronales en desarrollo.

Un implante de accionamiento ligero para grabaciones crónicas de tetrodos en ratones jóvenes

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