Name: Un procedimiento para la criosección de ganglios de la raíz dorsal de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 20 s
Description: Aprende a obtener secciones de criostato de ganglios de la raíz dorsal de ratón de alta calidad e intactas usando este protocolo paso a paso. Este método facilita estudios de inmunohistoquímica en neurociencia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Para el presente estudio, los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la UCSF y se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Aquí se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6 adultos de 8 a 12 semanas de edad (criados en casa).
1. Preparación de la muestra de DRG
<ol><li>Anestesiar a los ratones con avertina al 2,5% (ver Tabla de Materiales). Asegurar una anestesia adecuada por la falta de respuesta a la estimulación dolorosa. Perfundir a los animales por vía transcárdica con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x seguida de formaldehído al 4%, como se describió anteriormente14,15,16.</li>
	<li>Diseccionar el tejido DRG de la médula espinal, como se describió anteriormente14,15,16.</li>
	<li>Fijar posteriormente los GRD disecados en formaldehído al 4% durante 3 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Poner los GRD en sacarosa al 30% en PBS a 4 °C durante la noche.</li>
	<li>Preparación de la temperatura óptima de corte de la base (OCT)<ol><li>Agregue el compuesto OCT (consulte la Tabla de materiales) para cubrir la superficie superior del bloque de aluminio y congele a -20 °C durante 5-10 minutos (Figura 1A).</li>
		<li>Corte la parte superior de la OCT con el criostato (ver Tabla de Materiales) a 30 μm de espesor hasta que su superficie sea plana como la OCT base (Figura 1B).</li>
		<li>Haga una marca en la parte inferior (posición de las seis en punto) de la OCT base para marcar su orientación, antes de quitar el bloque de aluminio del criostato (Figura 1C).</li>
		<li>En los siguientes pasos, mantenga la marca en la posición de las seis en punto para mantener la misma orientación, lo que puede llevar a obtener más secciones de la muestra de DRG. NOTA: Si se pierde la orientación y la muestra de DRG se corta en un ángulo diferente, la muestra de DRG no se puede cortar completamente de arriba a abajo, lo que dejará algunas muestras en la OCT base y se desperdiciarán, ya que la OCT base se encontrará al intentar cortar la muestra de DRG (Figura 1C).</li>
	</ol></li>
	<li>Realización de la incrustación de OCT de DRG<ol><li>Seque el pañuelo DRG antes de colocarlo en la OCT.<ol><li>Antes de agregar el DRG al bloque, asegúrese de eliminar la solución de sacarosa/PBS al 30% alrededor de la muestra.</li>
			<li>Seque la muestra de DRG colocándola en una placa de Petri seca (Figura 2A) y moviéndola de un lugar a otro dos o tres veces con pinzas secas (Figura 2B).</li>
			<li>Seque las pinzas con un pañuelo sin pelusa antes de mover otra muestra de DRG (Figura 2C).</li>
		</ol></li>
		<li>Coloque el DRG seco en la OCT base.<ol><li>Con pinzas secas, coloque el DRG seco en la OCT base en la posición de las 12 en punto (Figura 1D).</li>
			<li>Mantenga al menos 5 mm entre el borde superior del DRG y el borde superior de la OCT base.</li>
			<li>Coloque la parte dorsal del GRD en la posición de las 12 en punto y la parte ventral en la posición de las seis en punto (Figura 1D).</li>
		</ol></li>
		<li>Incruste el tejido DRG con OCT.<ol><li>Agregue más OCT para cubrir toda la muestra de DRG en forma redonda u ovalada, con el DRG en el centro (Figura 1E).</li>
			<li>Asegúrese de que el borde superior de la OCT cubra el DRG en el borde superior de la OCT base (Figura 1F), ya que esto facilita la transferencia de la sección al portaobjetos de vidrio (Figura 3A). NOTA: Si la OCT de cubierta está en el medio de la OCT base, el borde superior de la OCT base bloqueará el portaobjetos de vidrio para recoger la sección (Figura 3B).</li>
			<li>Congele la muestra de OCT y DRG de la cubierta a -20 °C durante otros 5 minutos (Figura 1G). No recorte la OCT alrededor de la muestra de DRG.</li>
			<li>Corte la parte superior de la OCT de la cubierta con un grosor de 30 μm hasta que el DRG sea visible.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Crioseccionamiento del GRD
<ol><li>Cambie el grosor de la sección del criostato a 12 μm para cortar secciones de DRG en el portaobjetos (Figura 1H).</li>
	<li>Sujete la sección OCT en la parte inferior con un pincel pequeño enfriado a -20 °C. NOTA: Es importante no cortar toda la sección por completo, sino dejar 1-3 mm sin cortar (Figura 1I).</li>
	<li>Use el extremo de una pinza a temperatura ambiente para tocar suavemente la parte inferior (posición de las seis en punto) de la sección para que se adhiera a la superficie de la plataforma (Figura 1J). Esto evita que la sección se curve hacia atrás en un rollo, lo que dificulta la recogida de la sección en el portaobjetos. NOTA: Cuando la parte inferior de la sección se adhiere a la superficie de la plataforma, y la parte superior de la sección aún se conecta con el OCT de la cubierta, la sección tiene una forma plana (Figura 1K), lo que facilita mucho la recolección de la sección en el portaobjetos.</li>
	<li>Tome un portaobjetos de vidrio cargado (consulte la Tabla de materiales) y coloque lentamente el portaobjetos sobre la sección. Tan pronto como la sección comience a pegarse a la guía, tire suavemente de la guía hacia atrás (Figura 1L).</li>
	<li>Siga el mismo proceso para colocar más secciones de DRG en la diapositiva sin superponer las secciones (Figura 1M). Asegúrese de que no se coloque una nueva sección de DRG sobre la OCT de otra sección de DRG (Figura 4), ya que dicha sección no puede permanecer bien en el portaobjetos y puede lavarse durante el proceso de tinción inmunoquímica.</li>
</ol>3. Tinción Nissl de la sección DRG en el portaobjetos de vidrio
<ol><li>Lavar las secciones durante 10 min en PBS más 0,1% Triton X-10. Luego, lave las secciones dos veces con PBS.</li>
	<li>Aplique un tinte de Nissl 1:300 (consulte la Tabla de materiales) al portaobjetos e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave la sección con PBS más 0.1% Triton X-100. Luego, lave las secciones dos veces con PBS durante 5 minutos y luego durante 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aplique 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) fluoromount-G (ver Tabla de Materiales) para cubrir las secciones con un cubreobjetos.</li>
</ol>

Criosección de ganglios de la raíz dorsal de ratón

<ol><li>Guan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injured+sensory+neuron-derived+CSF1+induces+microglial+proliferation+and+DAP12-dependent+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+root+ganglion+macrophages+contribute+to+both+the+initiation+and+persistence+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain.</a> Nature Communications. 11 (1), 264(2020).</li>
<li>Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+its+role+in+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).</li>
<li>Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profile+of+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+study+of+oxytocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression.</a> Molecular Brain. 15 (1), 44(2022).</li>
<li>Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuro-immune+interactions+in+chronic+pain%3A+implications+for+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain+Research%22%5BJournal%5D)">The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice.</a> Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).</li>
<li>Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+characteristics+of+the+dorsal+root+ganglion+as+a+target+for+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Medicine%22%5BJournal%5D)">Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation.</a> Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).</li>
<li>Chen, X. J., Sun, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+circuit+mechanisms+of+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Central circuit mechanisms of itch.</a> Nature Communications. 11 (1), 3052(2020).</li>
<li>Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporary+views+on+inflammatory+pain+mechanisms%3A+TRPing+over+innate+and+microglial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways.</a> F1000Research. , (2016).</li>
<li>Boadas-Vaello, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroplasticity+of+ascending+and+descending+pathways+after+somatosensory+system+injury%3A+reviewing+knowledge+to+identify+neuropathic+pain+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets.</a> Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).</li>
<li>Guha, D., Shamji, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsal+root+ganglion+in+the+pathogenesis+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain.</a> Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).</li>
<li>Shorrock, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBA1%2FGARS-dependent+pathways+drive+sensory-motor+connectivity+defects+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy.</a> Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).</li>
<li>Sleigh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trk+receptor+signaling+and+sensory+neuron+fate+are+perturbed+in+human+neuropathy+caused+by+Gars+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).</li>
<li>Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+somatosensory+neuron+involvement+in+the+SOD1%28G93A%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model.</a> Scientific Reports. 12 (1), 7600(2022).</li>
<li>Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+for+rapid+dissection+of+mouse+dorsal+root+ganglia+from+defined+spinal+levels%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels.</a> BMC Research Notes. 13 (1), 302(2020).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).</li>
<li>Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+dorsal+root+ganglion+neuron+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184(2020).</li>
<li>Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+transcriptional+signatures+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Common transcriptional signatures of neuropathic pain.</a> Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).</li>
<li>Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+dorsal+root+ganglia+following+peripheral+nerve+injury%3A+roles+in+inflammation%2C+cell+death+and+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception.</a> Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).</li>
<li>Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+and+chemokine+regulation+of+sensory+neuron+function%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+outgrowth%2C+neuropeptides+expression+and+receptors+tyrosine+kinase+phosphorylation+in+3D+organotypic+cultures+of+adult+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia.</a> PLoS One. 12 (7), e0181612(2017).</li>
<li>Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+nature+of+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+Linking+structure+with+polarity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiolology%22%5BJournal%5D)">The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function.</a> Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).</li>
<li>Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+sensory+afferent+compartments+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The structure of sensory afferent compartments in health and disease.</a> Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).</li>
<li>Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomic+analysis+of+human+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons.</a> eLife. 10, e71752(2021).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li>
<li>Hunt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRGquant%3A+A+new+modular+AI-based+pipeline+for+3D+analysis+of+the+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG.</a> Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497(2022).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona un procedimiento sencillo paso a paso para el seccionamiento por criostato del DRG del ratón para obtener secciones de DRG de alta calidad en portaobjetos de forma fiable. Hay cuatro pasos críticos en este protocolo. Primero, la muestra de DRG y las pinzas deben estar secas antes de colocar la muestra de DRG en la OCT base. Cualquier líquido que rodee la muestra de DRG formará una capa de hielo a su alrededor, lo que hará que las secciones de DRG se separen de la OCT y se curven hacia arriba. E...

El ganglio de la raíz dorsal (DRG) contiene las neuronas sensoriales primarias, los macrófagos tisulares y las células satélite que rodean a las neuronas sensoriales primarias 1,2,3,4. Es una estructura anatómica clave en el procesamiento de señales inocuas y nocivas, y desempeña un papel fundamental en el dolor, la picazón y diversos trastornos de los nervios periféricos 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Aunque se han desarrollado varios métodos para diseccionar el tejido de DRG de la médula espinal del ratón14,15,16, la criosección del tejido de DRG sigue siendo un desafío, ya que el tejido de DRG es bastante pequeño y las secciones de criostato de las muestras de DRG tienden a curvarse en rollos, lo que dificulta la transferencia adecuada de las secciones de criostato a portaobjetos de vidrio. Sin embargo, la criosección adecuada del tejido DRG es crucial para los estudios de inmunohistoquímica y la estructura de las neuronas sensoriales DRG 17,18,19,20,21,22,23. Además, dado que los resultados de la secuenciación del ARN de una sola célula han revelado la notable heterogeneidad de las neuronas sensoriales DRG tanto en humanos24 como en ratones25, la criosección adecuada del tejido DRG es fundamental para investigar el papel funcional de diferentes células DRG en diversas condiciones fisiológicas y patológicas.
Aunque la técnica de limpieza de tejidos se ha aplicado para investigar la reconstrucción 3D del DRG26 como una técnica alternativa de criosección del DRG, la técnica de limpieza de tejidos requiere tiempo y trabajo. En comparación, la criosección de la GRD es rápida y relativamente fácil de realizar, por lo que sigue siendo una técnica clave para los estudios de inmunohistoquímica y estructura de la GRD y otras regiones del sistema nervioso central. Sin embargo, la obtención de secciones de criostato de alta calidad, intactas y planas en portaobjetos de vidrio sigue siendo un desafío en la investigación neurocientífica debido al pequeño tamaño de la muestra de tejidos, como el DRG y ciertas regiones del cerebro, y no hay ningún artículo que describa el protocolo óptimo en este momento para crioseccionar muestras de tejido de pequeño tamaño, como los DRG de ratón.
Este protocolo proporciona una técnica fácil y paso a paso para el corte de criostato del DRG del ratón para obtener de manera confiable la mayor cantidad de secciones de DRG de alta calidad en los portaobjetos para estudios posteriores de DRG. Si bien está diseñada específicamente para crioseccionar muestras de DRG, esta técnica puede usarse potencialmente para crioseccionar otros tejidos con un tamaño de muestra pequeño.

<table><tbody><tr><td>Avertin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td>Anestesiar animal</td></tr><tr><td>Epredia&nbsp; Cryotome Cryostato Criocassettes, 25 mm de diámetro. </td><td>Fisherbrand</td><td>1910</td><td>Sombreado Sostenga la sección OCT en la parte inferior&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinzas ergonómicas</td><td>Fisherbrand</td><td>S95310</td><td>Usando el extremo de una pinza para tocar suavemente la parte inferior (6 o' reloj) de la sección para que se adhiera a la superficie de la plataforma para evitar que la sección se curve hacia atrás en un rollo&nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td>Para recoger la sección DRG&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotuladores</td><td>Fisherbrand 133794</td><td></td><td>&nbsp; Marque la orientación de la base OCT</td></tr><tr><td>Scigen&nbsp; Compuesto Tissue-Plus O.C.T. Fisherbrand</td><td></td><td>&nbsp; 23730571</td><td>Medio de inclusión para muestras de tejido congelado para garantizar una temperatura de corte óptima (O.C.T.).</td></tr></tbody></table>

un procedimiento para la criosección de ganglios de la raíz dorsal de ratón

A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

Las secciones de criostato de ganglios de la raíz dorsal (DRG) de ratón de alta calidad son cruciales para la tinción inmunoquímica adecuada y los estudios de ARNoscopio en la investigación del dolor inflamatorio y neuropático, la picazón y otras afecciones neurológicas periféricas. Sin embargo, sigue siendo un desafío obtener consistentemente secciones de criostato de alta calidad, intactas y planas en portaobjetos de vidrio debido al pequeño tamaño de la muestra del tejido DRG. Hasta el momento, no existe ningún artículo que describa un protocolo óptimo para la criosección de DRG. Este protocolo presenta un método paso a paso para resolver las dificultades frecuentes asociadas con la criosección de DRG. El artículo presentado explica cómo eliminar el líquido circundante de las muestras de tejido de DRG, colocar las secciones de DRG en el portaobjetos mirando hacia la misma orientación y aplanar las secciones en el portaobjetos de vidrio sin curvarse hacia arriba. Aunque este protocolo se ha desarrollado para la criosección de las muestras de DRG, se puede aplicar para la criosección de muchos otros tejidos con un tamaño de muestra pequeño.

El estudio actual recolectó alrededor de 16 secciones de DRG continuas y de alta calidad de un DRG L4 de ratón. Las secciones obtenidas no tenían ninguna distorsión. La Figura 1 muestra el procedimiento paso a paso para la criosección. La eliminación del exceso de líquido de las secciones de tejido se muestra en la Figura 2. El proceso de inclusión de los tejidos por OCT se destaca en la Figura 3. La Figura 4</s...

Aquí se presenta el desarrollo para la adquisición consistente de secciones de criostato de ganglios de raíces dorsales de alta calidad.

Un procedimiento para la criosección de ganglios de la raíz dorsal de ratón

High-quality mouse dorsal root ganglion (DRG) cryostat sections are crucial for proper immunochemistry staining and RNAscope studies in the research of ...

Sigue siendo un desafío obtener consistentemente secciones de criostato de ganglio de la raíz dorsal de ratón de alta calidad, intactas y planas. La investigación tiene como objetivo responder cómo adquirir la sección ideal de criostato del ganglio de la raíz dorsal del ratón. Este protocolo proporciona una técnica sencilla paso a paso para la sección de criostato del DRG de ratón a secciones de criostato de DRG de ratón plano y de alta calidad, intactas.Este artículo presentado explica cómo eliminar el líquido circundante del tejido de muestra de DRG del ratón, colocando las secciones de DRG en los portaobjetos orientados hacia la misma orientación, y aplanar las secciones de DRG sin curvarse hacia arriba. Un desafío importante es que las secciones OCT del DRG del ratón tienden a curvarse en un rollo, lo que dificulta su colocación en el portaobjetos de vidrio. También es difícil adquirir suficientes secciones de una muestra debido al pequeño tamaño del DRG del ratón.

a-procedure-for-mouse-dorsal-root-ganglion-cryosectioning

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se presenta un método de inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal. El enfoque puede ser utilizado para identificar sitios específicos de factor de transcripción vinculante y la modificación epigenética de las histonas y el ADN importantes para la regeneración de los axones dañados, tanto en el sistema nervioso periférico y central.

Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal

Este video muestra un protocolo libre de enzimas para aislar macrófagos del ganglio de la raíz dorsal del ratón (DRG) utilizando una técnica de disociación mecánica. Tras la homogeneización del tejido DRG recién recolectado, se utilizan anticuerpos contra los receptores de la superficie celular en los macrófagos para marcar las células con fluorescencia, seguido de la realización de citometría de flujo para confirmar la presencia de macrófagos en la muestra.

Aislamiento de macrófagos del ganglio de la raíz dorsal del ratón mediante disociación mecánica

Este video muestra un método para recolectar neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). La DRG de la columna vertebral de una rata se aísla, se trata con enzimas y luego se disocia mecánicamente para obtener una suspensión unicelular. Las neuronas se separan de las células gliales mediante centrifugación en gradiente de densidad y se cultivan en un medio de crecimiento.

Una técnica para recolectar y disociar ganglios de la raíz dorsal para cultivos neuronales

Aquí, presentamos un protocolo para la extrusión hidráulica de la médula espinal, así como la identificación y el aislamiento de ganglios específicos de la raíz dorsal (DRG) en el mismo roedor. En comparación con los métodos estándar de aislamiento de la médula espinal, este método es significativamente más rápido y reduce el riesgo de daño tisular.

Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

Aquí presentamos un protocolo de disociación mecánica para aislar rápidamente los macrófagos del ganglio de la raíz dorsal para el fenotipado y el análisis funcional.

Aislamiento rápido de macrófagos de ganando de raíz dorsal

Se presenta un método de perfusión conveniente alimentado por gravedad para el análisis histológico del sistema nervioso central del ratón. La detección inmunofluorescente de α-sinucleína fosforilada se demuestra en un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson. Este trabajo también describe exhaustivamente los pasos de perfusión transcárdica, disección, congelación / incrustación de tejidos y seccionamiento congelado.

Un método de perfusión transcárdica alimentado por gravedad para el análisis histológico del sistema nervioso central del ratón

Este artículo describe un protocolo de inmunopanopanización para los ganglios de la raíz dorsal del ratón adulto. Al adherir anticuerpos a las placas de cultivo, podemos seleccionar y eliminar negativamente las células no neuronales. Mostramos que los cultivos se enriquecen para las neuronas utilizando este protocolo, lo que permite un estudio en profundidad de las respuestas neuronales a la manipulación.

Enriquecimiento de cultivos de neuronas de ganglios de la raíz dorsal de ratones adultos mediante inmunopanización

Este protocolo describe la exposición quirúrgica del ganglio de la raíz dorsal (GRD) seguida de GCaMP3 (indicador de Ca2+ codificado genéticamente; Proteína fluorescente verde-Calmodulina-M13 Proteína 3) Imagen de Ca2+ de los conjuntos neuronales utilizando ratones Pirt-GCaMP3 mientras se aplica una variedad de estímulos a la pata trasera ipsilateral.

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

En este artículo se presenta una manipulación para el tratamiento de la compresión crónica del ganglio de la raíz dorsal en ratas mediante terapia de Tuina, junto con un método para evaluar su efectividad basado en el comportamiento del dolor y los resultados histopatológicos.

Efecto Analgésico de Tuina en Modelos de Ratas con Compresión del Dolor del Ganglio de la Raíz Dorsal

El presente protocolo describe una estrategia práctica para acelerar la etapa de verificación de las coordenadas de inyección estereotáxica antes de realizar el rastreo viral utilizando tintes y secciones congeladas.

Validación preliminar de las coordenadas de inyección estereotáxica mediante criosección

Los ganglios de la raíz dorsal (DRG) contienen cuerpos celulares de neuronas sensoriales primarias y transmiten señales sensoriales periféricas a la médula espinal. Este protocolo describe un método para la disección por DRG en ratón que permite el aislamiento estandarizado de ganglios estructuralmente intactos, la identificación anatómica segmentaria, una guía intuitiva para usuarios principiantes y la reducción de lesiones tejidulares procedimentales.

Disección y aislamiento de los ganglios dorsales de la raíz del ratón

Aprende a obtener secciones de criostato de ganglios de la raíz dorsal de ratón de alta calidad e intactas usando este protocolo paso a paso. Este método facilita estudios de inmunohistoquímica en neurociencia.

Un procedimiento para la criosección de ganglios de la raíz dorsal de ratón

Explorar más videos