Name: Evaluación del tamaño y la fusión de gotas de lípidos en células hepáticas bovinas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a evaluar el tamaño y la fusión de gotas de lípidos en células hepáticas bovinas mediante tinción con Oil Red O e imagen celular en vivo. Este método reproducible permite analizar la dinámica de lípidos en estudios de metabolismo celular.

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Esta investigación fue apoyada conjuntamente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U1904116).

Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con los estándares éticos del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Agrícola de Henan (provincia de Henan, China).
1. Cultivo de células de hepatocitos bovinos
<ol><li>Descongelar las células de hepatocitos primarios17 y centrifugar 400 x g durante 4 min a temperatura ambiente. NOTA: Las células hepatocitos primarias fueron cultivadas y mantenidas después de un informe previamente publicado17.</li>
	<li>Deseche la solución de almacenamiento congelada con una pipeta y suspenda con 1 ml de medio que contenga 10% de suero bovino fetal (FBS) y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). A continuación, utilice una cámara de conteo de células para calcular el número de células por mililitro, y luego calcule la concentración de la suspensión celular anterior y ajuste la concentración de células a 1 x 107 células / ml.<ol><li>Añadir la suspensión celular en una placa de cultivo celular de 60 mm que contenga 3 ml del medio anterior. Cultivar las células e incubarlas a 37 °C y 5% deCO2 durante 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuando las células crezcan hasta el 80%, deseche el medio y enjuague con solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego agregue 750 μL de tripsina al 0.25% para digerir las células. Incubar las células a 37 °C durante 3 min, luego neutralizarlas con la misma cantidad de FBS al 10%. Recoger la suspensión de la celda para centrifugar a 200 x g durante 4 min a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Tinción de O rojo aceite
<ol><li>Agregue 800 μL de medio de cultivo que contenga 10% de FBS y DMEM en cada pocillo de la placa de cultivo celular de 24 pocillos que contiene cubreobjetos de vidrio. Tome 50 μL de la suspensión celular (obtenida en el paso 1.3) y agréguela a 950 μL de PBS para mezclar. Use una cámara de conteo de celdas para calcular el número de celdas por mililitro y luego calcule la concentración de la suspensión celular anterior. Finalmente, ajustar la concentración celular a 4 x 104/mL en cada pocillo e incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 24 h.</li>
	<li>Después de 24 h, desechar el medio de cultivo y lavar con PBS. Suspender con 800 μL de medio de inducción DMEM que contenga 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (ASC).</li>
	<li>Disolver un total de 100 μL de LA (ver Tabla de materiales) en 900 μL de etanol anhidro y preparar una solución patrón (100 mmol/L). Agregue un gradiente de 0 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L y 200 μmol/L LA en la placa de 24 pocillos. Repita cada tratamiento cuatro veces. Incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 24 h.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo y lave las células con PBS tres veces. Fijar con 400 μL de paraformaldehído al 4% durante 20 min. Deseche la solución fijadora y lávela con PBS tres veces.</li>
	<li>Incubar las células con alcohol isopropílico al 60% durante 5 minutos, luego desecharlo. Agregue la solución de trabajo de aceite rojo O recién preparada (consulte la Tabla de materiales) (proporción 3: 2 de aceite rojo O: agua) durante 20-30 minutos y deseche la solución de tinción. Lave las células con PBS de dos a cinco veces hasta que no haya exceso de solución de colorante.</li>
	<li>Añadir 300 μL de solución de tinción de hematoxilina (relación hematoxilina:agua de 1:10) y volver a teñir el núcleo durante 1-2 min. Deseche la solución de colorante y lave las células con PBS de dos a cinco veces. Saque los cubreobjetos de vidrio de la placa de 24 pocillos y colóquelos en portaobjetos microscópicos (el lado con las celdas hacia abajo) después de dejar caer 10 μL de sellador de tabletas (consulte la Tabla de materiales) sobre el portaobjetos.</li>
	<li>Después del sellado, observe y obtenga imágenes de los LD de las células bajo la lente de aceite del microscopio óptico (consulte la Tabla de materiales). Mida el diámetro de los LD con el software cellSens y analice el número y el tamaño de los LD.</li>
</ol>3. Medición del tamaño y número de LD
<ol><li>Capturar imágenes: Encienda el interruptor de la computadora y el microscopio sucesivamente, coloque la diapositiva en la plataforma de carga, abra el software de análisis de imágenes (consulte Tabla de materiales) y conecte la computadora para ver la imagen.<ol><li>Encuentre las imágenes a baja potencia y gotee una cantidad adecuada de aceite de cedro en la diapositiva de imágenes. Ajuste el factor de observación a 100x, establezca la exposición automática y capture las imágenes ajustando el campo de visión adecuado. Seleccione tres portaobjetos de celdas teñidas para cada grupo para obtener imágenes.</li>
	</ol></li>
	<li>Medición del diámetro: seleccione aleatoriamente 60 LD para cada imagen para medir los diámetros. Después de la medición de cada imagen, guarde las imágenes y envíe los resultados de la medición en una tabla para el posterior análisis del tamaño promedio y la relación de distribución de los LD.</li>
	<li>Medición de cantidad: seleccione tres imágenes para cada diapositiva teñida y fotografiada, y seleccione aleatoriamente tres celdas para la medición de cantidad en cada imagen. Cuente y analice el número de LD alrededor de la célula, y calcule el número promedio de LD en la célula.</li>
</ol>4. Observación dinámica de la fusión LD
<ol><li>Siga los pasos del cultivo celular como se menciona en los pasos 1.1-1.3. Cuando las células crezcan al 80%, deseche el medio y enjuague con PBS, luego digiera con 750 μL de tripsina durante 3 min. A continuación, agregue 750 μL del medio, centrifugar a 200 x g durante 4 minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Suspender las células en 1 ml de medio de cultivo, contar y ajustar la concentración celular a 5 x 105 células/ml en una placa de 35 mm. Cultivo a 37 °C y 5%CO2 durante 24 h.</li>
	<li>Cuando las células hayan crecido al 80%, cambie el medio a DMEM + 150 μmol/L LA durante 24 h, y continúe el cultivo en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 para acumular los LDs.</li>
	<li>Después de 24 h, retire el medio de cultivo. Lave las células adherentes con PBS e incubarlas con una sonda fluorescente neutra BODIPY 493/503 de 10 μg/ml (consulte la Tabla de materiales) en la oscuridad durante 30 min. Después de la incubación, lave las células en la placa de cultivo con PBS tres veces y agregue DMEM + 150 μmol / L LA. NOTA: Evite la exposición a la luz durante y después de la tinción BODIPY de 10 μg/ml; 1 mg/ml de BODIPY se diluyó con PBS (1:100).</li>
	<li>Coloque la placa de cultivo en la ranura del microscopio de la estación de células vivas (consulte la Tabla de materiales) para observar los cambios dinámicos de los LD. Encienda la alimentación de la estación de trabajo de células vivas de acuerdo con la secuencia inicial y evite la luz.<ol><li>Encienda la alimentación, la fuente de luz de transmisión, la fuente de alimentación del microscopio, la fuente de luz fluorescente de la lámpara de mercurio, la fuente de alimentación de la cámara del dispositivo de carga acoplada (CCD), la fuente de alimentación del host de la computadora, la válvula de CO 2 y la incubadora de CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Agregue agua destilada a la ranura en la plataforma de carga, asegurándose de no pasar por la salida de aire.</li>
	<li>Encienda la computadora y ejecute "NIS-Elements". Primero, encuentre el campo de visión apropiado en la lente del objetivo 4x, luego ajústelo a la lente del objetivo 40x sucesivamente. Seleccione E100 para observar la muestra en el microscopio y L100 para previsualizar y fotografiar la muestra en el ordenador. NOTA: E100 y L100 son botones de ajuste del microscopio en la estación de trabajo de celda viva (consulte la Tabla de materiales), que representan el ocular y la pantalla de la computadora, respectivamente.</li>
	<li>Diseñe los parámetros como el canal de fluorescencia (por ejemplo, Ph-40x, isotiocianato de fluoresceína [FITC], obturador) y el tiempo de disparo esperado para el experimento. Establezca el tiempo de disparo en el tiempo, incluido el tiempo de intervalo de disparo de 5 minutos entre cada dos imágenes y un tiempo de disparo total de 6 h. NOTA: El disparo prolongado debe utilizar la función de estabilización de enfoque del sistema de enfoque perfecto (PFS). Para esto, primero ajuste el campo de visión y la longitud del enfoque, luego haga clic en PFS en la pantalla de la computadora y finalmente ajuste la espiral de enfoque fino.</li>
	<li>Seleccione diferentes modos de canal, un solo canal o todos, seleccione un campo de visión diferente, haga clic en vista previa, ajuste el campo de visión, establezca estos parámetros y haga clic en comenzar a ejecutar para comenzar a disparar. Tome una foto de prueba durante 5 minutos primero; Puede tomar mucho tiempo después de que la operación sea normal.</li>
	<li>Después de realizar la grabación, elija Archivo > Guardar como > Guardar tipo > formato avi para exportar los datos a un video en formato 'avi'. Utilice el formato de imagen '.nd2' para guardar el programa de datos y exportar las fotos.</li>
	<li>Para apagar la máquina, apáguela en orden inverso.</li>
</ol>5. Estadísticas y análisis de resultados
<ol><li>Analice los datos con ANOVA unidireccional. Notifique los resultados como la media ± error estándar.</li>
</ol>

Obtención de imágenes de células vivas del tamaño de las gotas de lípidos y la fusión utilizando aceite rojo O y BODIPY

<ol><li>Fujimoto, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+just+fat%3A+the+structure+and+function+of+the+lipid+droplet%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Not just fat: the structure and function of the lipid droplet.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838(2011).</li>
<li>Grasselli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+potential+translational+value%3A+The+effects+of+3%2C5-L-diiodothyronine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine.</a> Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).</li>
<li>Herdt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruminant+adaptation+to+negative+energy+balance%3A+Influences+on+the+etiology+of+ketosis+and+fatty+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).</li>
<li>Pino-de la Fuente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+regulation+of+hepatic+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism.</a> Life Sciences. 298, 120522(2022).</li>
<li>O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mega-stokes+pyrene+ceramide+conjugates+for+STED+imaging+of+lipid+droplets+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells.</a> Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+droplet+fusion+and+growth+by+CIDE+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).</li>
<li>Tütüncü Konyar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+insoluble+polysaccharides+and+neutral+lipids+in+the+developing+anthers+of+an+endangered+plant+species%2C+Pancratium+maritimum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Systematics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum.</a> Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).</li>
<li>Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+BODIPY+%28493%2F503%29+to+visualize+intramuscular+lipid+droplets+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358(2011).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li>
<li>Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+characterization+of+intracellular+lipids+in+situ+by+Nile+Red+red%2Fyellow+emission+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio.</a> Micron. 39 (7), 819-824 (2008).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+polarity-sensitive+fluorescent+dyes+based+on+the+BODIPY+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Dyes+and+Pigments%22%5BJournal%5D)">The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore.</a> Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).</li>
<li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42(2015).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials. 11 (9), 1768(2018).</li>
<li>Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases%2C+reproductive+performance%2C+and+changes+in+milk+production+associated+with+subclinical+ketosis+in+dairy+cows%3A+A+meta-analysis+and+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review.</a> Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).</li>
<li>Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+elevated+nonesterified+fatty+acids+and+%CE%B2-hydroxybutyrate+concentrations+with+early+lactation+reproductive+performance+and+milk+production+in+transition+dairy+cattle+in+the+northeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States.</a> Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).</li>
<li>Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+experimental+steatosis+in+vitro%3A+hepatocyte+cell+culture+in+lipid+overload-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62543(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nonesterified+fatty+acids+on+the+synthesis+and+assembly+of+very+low+density+lipoprotein+in+bovine+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).</li>
<li>Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+their+interactions+with+other+organelles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937(2021).</li>
<li>Sanjabi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+hypertrophy%3A+a+crucial+determining+factor+in+insulin+regulation+by+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes.</a> Scientific Reports. 5, 8816(2015).</li>
<li>Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subtle+balance+between+lipolysis+and+lipogenesis%3A+a+critical+point+in+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis.</a> Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).</li>
<li>Yang, A., Mottillo, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+lipolysis%3A+from+molecular+mechanisms+of+regulation+to+disease+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics.</a> Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).</li>
<li>Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+liver+disease%3A+from+basic+biology+to+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).</li>
<li>Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+myocellular+fat+stores%3A+lipid+droplet+dynamics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).</li>
<li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cis-and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626(2020).</li>
<li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).</li>
<li>Fei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphatidic+acid+in+the+formation+of+%26%2334%3Bsupersized%26%2334%3B+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A role for phosphatidic acid in the formation of &#34;supersized&#34; lipid droplets.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002201(2011).</li>
<li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+fluorescent+dye+BODIPY+in+the+study+of+lipid+dynamics+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecules. 23 (7), 1594(2018).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Dependiendo de los estados patológicos, los LD hepáticos experimentan cambios tremendos en su tamaño y número. Las LD están ampliamente presentes en las células hepatocitos y desempeñan un papel clave en la salud y enfermedad hepática18. La cantidad y el tamaño de las LD son la base de la investigación actual sobre la biogénesis de las LD19. El tamaño y el número de LD para células y tejidos reflejan su capacidad para almacenar y liberar energía. Los cambios dinámicos de la...

La acumulación de gotitas de lípidos (LD) en los hepatocitos es la característica típica de la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), que puede progresar a fibrosis hepática y carcinoma hepatocelular. Se ha encontrado que la manifestación más temprana de la enfermedad del hígado graso es la esteatosis, caracterizada por la acumulación de LD en el citoplasma del hepatocito1. La esteatosis hepática se asocia invariablemente con un aumento del número y/o tamaño expandido de LDs2. Se cree que los LD se generan a partir del retículo endoplásmico (RE), que consiste en triglicéridos (TG) como núcleo, y están rodeados de proteínas y fosfolípidos3. Como orgánulo subcelular responsable del almacenamiento de TG, los LD exhiben diferentes características en cuanto a su tamaño, número, composición lipídica, proteínas e interacción con otros orgánulos, todos los cuales afectan la homeostasis de la energía celular4. El nivel de TG se correlaciona positivamente con el tamaño de los LD, y un mayor contenido de TG intracelular podría formar LDs más grandes5. Los LD aumentan de tamaño a través de la síntesis local de TG, la incorporación de lípidos en el RE y la fusión de múltiples LD6. Las células (adipocitos, hepatocitos, etc.) que contienen LD grandes tienen un mecanismo especial para aumentar eficientemente el almacenamiento de lípidos por fusión de LD. Los cambios dinámicos de los LD reflejan los diferentes estados del metabolismo energético de la célula. Es crucial desarrollar metodologías que permitan la observación y el análisis de los diversos LD hepáticos en células sanas y anormales.
Los principales colorantes no fluorescentes para LD son Sudan Black B y oil red O. Sudan Black B tiñe lípidos neutros, fosfolípidos y esteroides7. El aceite rojo O se utiliza principalmente para teñir LDs de músculo esquelético, cardiomiocitos, tejido hepático, células adiposas, etc.8., y se considera una herramienta estándar para la detección cuantitativa de esteatosis hepática en ratones y humanos9. El cambio dinámico de LDs se lleva a cabo principalmente por teñido fluorescente. El rojo del Nilo y el BODIPY son colorantes lipídicos fluorescentes de uso común10,11. En comparación con el rojo del Nilo, BODIPY tiene una permeabilidad tisular más fuerte y se une mejor con LD12. Los LD marcados con BODIPY se pueden utilizar para teñir células vivas y colocalizar con otros orgánulos13.
La incidencia de hígado graso es significativamente mayor en animales rumiantes que en animales monogástricos14. Durante el período de transición, las vacas lecheras experimentan un estado de balance energético negativo3. Grandes cantidades de ácidos grasos no esterificados (ácido palmítico, ácido oleico, ácido linoleico, etc.) se sintetizan en TG en hepatocitos bovinos, lo que conduce a una anomalía funcional hepática y reduce en gran medida la calidad de los productos lácteos y la eficiencia de la producción15. El presente estudio tiene como objetivo proporcionar un protocolo para analizar el tamaño y el número de LD, así como para monitorear la dinámica de fusión LD. Construimos un modelo de formación de LD agregando diferentes concentraciones de ácido linoleico (LA) en hepatocitos16 y observamos los cambios en el tamaño y el número de LDs durante el proceso al teñir LDs con O rojo aceite. Además, el proceso de fusión rápida de LDs también se observó mediante tinción con BODIPY 493/503.

<table><tbody><tr><td>0,25% tripsina</td><td>Reactivo 25200072 Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído al 4%</td><td>Reactivo Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>2295015</td></tr><tr><td>reactivo Aceite de cedro</td><td>Solarbio</td><td>C7140</td><td>reactivo</td></tr><tr><td>Equipo</td>de cámara <td></td><td></td> de<td>recuento de células</td></tr> placa de <tr><td>cultivo celular</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>material cell sens software&nbsp;</td><td>Software Olympus IX73</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Equipo Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td>reactivo</td></tr><tr><td>Fetal Bovino Suero</td><td>Gibco</td><td></td><td>2492319</td></tr><tr><td>hematoxilina</td><td>Reactivo DingGuo</td><td>AR0712</td><td>Vista</td></tr> de <tr><td>imagen</td><td></td><td></td><td>Análisis de imagen Soptare</td></tr><tr><td>ácido linoleico</td><td>Reactivo Solarbio</td><td>SL8520</td><td></td></tr><tr><td>Estación de celda viva Nikon</td><td>A1 HD25</td><td></td><td>equipo</td></tr><tr><td>NIS-Elements&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>aceite rojo O</td><td>Solarbio</td><td>G1260</td><td>reactivo</td></tr><tr><td>microscopio óptico</td><td>equipo Olympus IX73</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina & Estreptomicina 100 veces;</td><td>NCM Biotech</td><td>Reactivo CLOOC5</td><td></td></tr><tr><td>Salino tamponado con fosfato</td><td>Reactivo HyClone</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Equipo</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agente de sellado</td><td>Reactivo Solarbio</td><td>S2150</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación del tamaño y la fusión de gotas de lípidos en células hepáticas bovinas

Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells

Las gotitas de lípidos (LD) son orgánulos que desempeñan un papel importante en el metabolismo de los lípidos y el almacenamiento de lípidos neutros en las células. Se asocian con una variedad de enfermedades metabólicas, como la obesidad, la enfermedad del hígado graso y la diabetes. En las células hepáticas, los tamaños y el número de LD son signos de enfermedad del hígado graso. Además, la reacción de estrés oxidativo, la autofagia celular y la apoptosis a menudo se acompañan de cambios en los tamaños y números de LDs. Como resultado, las dimensiones y la cantidad de LD son la base de la investigación actual sobre el mecanismo de la biogénesis de LD. Aquí, en células hepáticas bovinas inducidas por ácidos grasos, describimos cómo usar el aceite rojo O para teñir LD e investigar los tamaños y números de LDs. La distribución de tamaño de los LD se analiza estadísticamente. El proceso de fusión de LD pequeños en LD grandes también se observa mediante un sistema de imágenes de células vivas. El trabajo actual proporciona una manera de observar directamente la tendencia de cambio de tamaño de las LD bajo diferentes condiciones fisiológicas.

La tinción de las LD celulares se muestra en la Figura 1. Los puntos rojos reflejan las LD de las celdas, y los puntos azules reflejan los núcleos. Se puede ver que el tamaño y el número de LD en cada imagen son diferentes bajo el tratamiento de LA.
Con el aumento en la dosis de LA, el diámetro promedio y el número de LD mostraron una tendencia significativamente creciente, dependiendo de la concentración de LA (Figura 2). Como se mue...

El presente protocolo describe cómo usar O rojo aceite para teñir gotas de lípidos (LD), calcular el tamaño y el número de LD en un modelo de hepatocitos grasos inducido por ácidos grasos, y usar BODIPY 493/503 para observar el proceso de pequeños LD que se fusionan en LD grandes mediante imágenes de células vivas.

Evaluación del tamaño y la fusión de gotas de lípidos en células hepáticas bovinas

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...

Nuestra investigación se centra en el número de gotas de lípidos y el tamaño inducido por el ácido linoleico en las células hepáticas. Además, nuestro objetivo es proporcionar información sobre el mecanismo del hígado graso. Los avances recientes en este campo de investigación, sugieren que la colina, CCT alfa, autofagia inducida establecida, puede regular el tamaño de las gotas de lípidos en las células hepáticas bovinas.Además, las observaciones de la estación de trabajo de células vivas han demostrado que los fosfolípidos tienen un efecto considerable sobre la fusión de gotas de lípidos. Actualmente, la ayuda génica, la pinza de fluorescencia, la cromatografía líquida, el análisis ómico, la cromatografía simple, la citometría de flujo y otras tecnologías se están utilizando para agrupar la vasta investigación en este campo. El método experimental tiene algunas limitaciones.Por ejemplo, el fenómeno de campos limitados solo se puede observar para los campos de gotas lipídicas y bajo un cierto vuelo de desechos. La tinción Oil Red O es más conveniente, menos costosa y más ampliamente utilizada para medir el tamaño aparente de las gotas de lípidos que la tinción de fluorescencia de

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Dos técnicas para aislar las gotas de lípidos celulares de 1) las células de levadura y 2) se presentan placentas humanas. La pieza central de ambos procedimientos es la centrifugación en gradiente de densidad, donde la capa flotante resultante que contiene las gotas puede ser visualizado fácilmente por el ojo, se extrae, y se cuantifica por análisis de Western Blot para la pureza.

El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

De la lipogénesis de novo y la oxidación de ácidos grasos β-constituyen vías metabólicas claves en los hepatocitos, las vías que son perturbados en varios trastornos metabólicos, incluyendo la enfermedad de hígado graso. Aquí se demuestra el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón y describimos cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β-y la lipogénesis.

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Este Protocolo establece un método novedoso de aislamiento de gotas de lípido y purificación de hígado de ratón, usando un kit de aislamiento de retículo endoplásmico bien establecida.

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

En este estudio, describimos un protocolo detallado para inducir esteatosis vesicular hepática en células HepaRG diferenciadas con el oleato de sodio de sal de ácido graso y empleamos métodos para la detección y cuantificación de la acumulación de lípidos, incluyendo anti-Stokes coherentes Microscopía de dispersión Raman (CARS), análisis citofluorimétrico, tinción O de color rojo aceite y qPCR.

Inducir y caracterizar la esteatosis vesicular en células hepa-repartidas diferenciadas

En este documento, demostramos un protocolo optimizado basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la caracterización de gotas de lípidos en el tejido hepático. Mediante el uso de proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, el fluoróforo permite una discriminación exitosa entre esteatosis microvesicular y macrovesicular y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos para la evaluación de esteatosis hepática.

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Aprende a evaluar el tamaño y la fusión de gotas de lípidos en células hepáticas bovinas mediante tinción con Oil Red O e imagen celular en vivo. Este método reproducible permite analizar la dinámica de lípidos en estudios de metabolismo celular.

Evaluación del tamaño y la fusión de gotas de lípidos en células hepáticas bovinas

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