Síntesis directa de nanopartículas de oro EM-visibles en células para análisis de localización de proteínas con ultraestructura bien conservada
28 de abril de 2023
El presente protocolo describe una tecnología de etiquetado de microscopía electrónica clonable para detectar proteínas marcadas con metalotioneína en células utilizando una nueva técnica de síntesis de nanopartículas de oro basada en el mecanismo de supresión de autonucleación.
La detección y localización de proteínas son esenciales en la investigación biológica. Nuestro protocolo describe una novedosa tecnología de etiquetado EM utilizando etiquetas codificadas genéticamente que permite la visualización de una sola molécula in situ con una ultraestructura bien conservada. Es crucial evitar la fijación excesiva.
El método de etiquetado se basa en la actividad de las cisteínas en las etiquetas, que son altamente sensibles a la reticulación de aldehído. Nuestro protocolo evita el uso de fijadores de aldehído y preserva la actividad de la etiqueta y la ultraestructura. al mismo tiempo.
El etiquetado EM siempre ha sido un desafío, sufriendo de una morfología deficiente o un etiquetado ineficiente. Nuestros protocolos sintetizan nanopartículas in situ directamente en proteínas individuales para proporcionar una localización clara y precisa de las proteínas objetivo, con una alta relación señal-ruido, alta eficiencia y especificidad. Hasta ahora hemos logrado un excelente etiquetado en proteínas aisladas, células de E. coli, células de levadura y células HeLa.
Exploraremos y optimizaremos el método para su aplicación a muestras de tejido. La combinación de las tecnologías crio-FIB y crio-EM prevalecientes nos permitirá abordar importantes cuestiones biológicas.
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Resumen
Este estudio presenta una tecnología novedosa de marcado mediante microscopía electrónica (EM) diseñada para detectar proteínas marcadas con metalotioneína dentro de las células. Mediante un mecanismo para suprimir la autonucleación, el método permite la visualización precisa de moléculas individuales al tiempo que conserva la ultraestructura celular.
Componentes Principales del Estudio
Área de Investigación
- Biología celular
- Microscopía
- Localización y detección de proteínas
Antecedentes
- La detección y localización de proteínas es fundamental para diversas aplicaciones de investigación biológica.
- Los métodos tradicionales de marcado en microscopía electrónica a menudo comprometen la morfología y la eficiencia.
- Las etiquetas codificadas genéticamente pueden mejorar la sensibilidad y especificidad de la detección de proteínas.
Métodos Utilizados
- Una tecnología novedosa de marcado mediante microscopía electrónica que evita el uso de fijadores a base de aldehídos para preservar la actividad de las proteínas.
- Aplicación en proteínas aisladas, E. coli, células Easter y células HeLa.
- Combinación de las tecnologías criomicrotomía con haces iónicos focalizados (cryo-FIB) y microscopía electrónica criogénica (cryo-EM) para mejorar la obtención de imágenes.
Resultados principales
- Síntesis exitosa de nanopartículas de oro directamente sobre proteínas individuales.
- Se logró una localización clara y precisa con una alta relación señal-ruido.
- Se validó la eficiencia y especificidad del método en diversas muestras biológicas.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un avance significativo en las tecnologías de detección de proteínas.
- El método tiene potencial para abordar preguntas biológicas fundamentales a nivel molecular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La localización precisa de proteínas a resolución ultraestructural es un punto crítico para la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. La síntesis directa de nanopartículas de oro visibles por microscopía electrónica sobre etiquetas codificadas genéticamente permite la visualización de moléculas individuales in situ, lo que refuerza la confianza predictiva respecto a la interacción con la diana y el mapeo de rutas metabólicas. Esta capacidad fortalece la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la investigación preclínica, al preservar la arquitectura celular nativa.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofarmacia
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la cartografía de alta resolución de la localización proteica para aclarar la biología del blanco.
- Apoya la validación funcional de etiquetas modificadas en sistemas tanto procariotas como eucariotas.
- Facilita la eliminación de riesgos mecanicistas al preservar la ultraestructura durante la detección.
- Mejora la confianza predictiva para la interacción con el blanco y la asignación de rutas metabólicas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una marcación robusta y reproducible para la detección cuantitativa de proteínas en ensayos basados en células.
- Normaliza la generación de sondas para microscopía electrónica mediante el uso de etiquetas clonables para flujos de trabajo escalables.
- Ofrece señales con alta relación señal-ruido, lo que permite una evaluación confiable de compuestos en campañas de cribado.
- Prepara sistemas biológicos validados para análisis posteriores basados en microscopía electrónica.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los datos de localización proteica con contextos ultraestructurales relevantes para la enfermedad.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento a nivel celular hasta la validación preclínica a nivel de tejido.
- Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la aportación de evidencia ultraestructural del acoplamiento del blanco terapéutico.
- Facilita la correlación de biomarcadores mediante un mapeo subcelular preciso.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Esta tecnología de marcado por microscopía electrónica integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos líderes y la investigación preclínica, apoyando la comprobación de hipótesis y la validación mecanicista.
- Biología del Descubrimiento: Avanza en la interrogación basada en hipótesis de la función y localización de proteínas en entornos celulares nativos.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de microscopía electrónica para el desarrollo de ensayos y la selección de compuestos.
- Análisis: Ofrece marcado eficiente y altamente específico de nanopartículas para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta la detección de moléculas individuales con modelos ultraestructurales de enfermedades para la validación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma para la generación estandarizada de sondas de microscopía electrónica en diversos programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de la detección de proteínas basada en microscopía electrónica.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar evidencia ultraestructural.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de muestras para microscopía electrónica y en el diseño de etiquetas codificadas genéticamente.
- Necesita acceso a congelación a alta presión, sustitución por congelación y equipos avanzados de microscopía electrónica.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de fijación y etiquetado para garantizar la reproducibilidad.
- La adaptación a muestras de tejidos y a diversos sistemas modelo puede requerir una optimización adicional.
- La sensibilidad de la etiqueta a los fijadores a base de aldehídos exige un estricto cumplimiento del protocolo para preservar su actividad.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
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Introduction
1:31
Preparing Sapphire Discs for Cell Culture
2:48
High‐Pressure Freezing (HPF),Freeze‐Substitution Fixation (FSF),and Rehydration of Sapphire Disc‐Carrier Assembly
6:02
Gold Nanoparticle Synthesis for Mammalian Cells Using Sapphire Discs
