Name: Un método preciso y cuantificable para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 39 s
Description: Aprenda un método preciso para recolectar hemolinfa cuantificable de artrópodos pequeños como la chinche parda del arroz. Esta técnica sencilla y económica facilita el estudio de interacciones virus-vector en investigación de arbovirus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2022YFD1401700) y por la Fundación Nacional de Ciencias de China (No. 32090013 y No. 32072385).

1. Cría de insectos
<ol><li>Elevar los SBPHs utilizados en este experimento en plántulas de arroz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plantar 20 plántulas de arroz en una incubadora (65 mm x 200 mm) y crecer a 25 °C bajo un fotoperiodo de 16 h claro/8 h oscuro.</li>
</ol>2. Disección de los SPSP para la recolección de hemolinfa
<ol><li>Coloque los SBPH en un tubo de centrífuga y colóquelos en un baño de hielo durante 10-30 minutos. NOTA: No coloque los SBPH en el baño de hielo durante menos de 10 minutos, o los insectos pueden revivir.</li>
	<li>Coloque un SBPH congelado en un portaobjetos de vidrio (consulte la Tabla de materiales) bajo un microscopio estereoscópico (consulte la Tabla de materiales) con el abdomen hacia arriba. Ajusta el enfoque en las seis patas del insecto.</li>
	<li>Prepare dos pinzas de alta precisión (consulte la Tabla de materiales) con puntas ultrafinas. Use una pinza para presionar el cuerpo del insecto para mantenerlo en su lugar, y use la otra para sacar con cuidado una de las patas del insecto. NOTA: Para insectos con una cáscara dura, se puede usar un bisturí oftálmico para cortar una de las patas.</li>
	<li>Presione suavemente el pecho del insecto con una pinza para hacer que la hemolinfa fluya a través de la herida. NOTA: La hemolinfa se presenta como gotitas transparentes sin ningún flóculo blanco visible. Deseche el lípido si hay algún flóculo blanco, que representa la contaminación del cuerpo graso.</li>
</ol>3. Recolección de hemolinfa mediante micropipetas
<ol><li>Prepara una micropipeta. Coloque un tubo capilar (ver Tabla de materiales) con un volumen de 1 μL en el bulbo de pipeta (ver Tabla de materiales). Para mediciones precisas, asegúrese de que la línea de escala sea visible. NOTA: Es necesario un pequeño orificio presente en la parte superior de la bombilla de pipeta.</li>
	<li>Al recoger la hemolinfa, sostenga el bulbo de pipeta de la micropipeta y coloque el tubo capilar cerca de la herida del insecto. Recoge la hemolinfa que exuda de la herida simplemente tocando la punta del capilar con la hemolinfa.</li>
	<li>Bloquee ligeramente el pequeño orificio en la parte superior del bulbo de pipeta con el dedo para detener el proceso de absorción cuando el líquido dentro del tubo capilar alcance la línea de escala deseada. NOTA: Recoja una muestra de 1 μL de hemolinfa incesante y rápidamente para evitar la contaminación lipídica y la obstrucción del tubo.</li>
	<li>Presione el bulbo de pipeta para descargar la hemolinfa recolectada en 100 μL de tampón PBS (137 mmol/L NaCI, 2.7 mmol/L KCI, 4.3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1.4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7.2-7.4). NOTA: El tubo capilar se inserta en el tampón PBS.</li>
	<li>Cambie a un nuevo tubo capilar cuando recoja otra muestra de 1 μL de hemolinfa.</li>
</ol>4. Tinción azul de Coomassie
<ol><li>Recolectar 3 muestras de hemolinfa con el mismo volumen (1 μL) de larvas en tercera etapa de acuerdo con los protocolos descritos en el paso 3, y descargar la hemolinfa recolectada en el tampón PBS para hacer un volumen total de 100 μL.</li>
	<li>Agregue 25 μL de tampón de carga de proteína 5x (250 mmol / L Tris-HCI [pH 6.8], 10% W / V SDS, 0.05% W / V Bromophenol Blue, 50% W / V glicerol, 5% W / V β-mercaptoetanol) en 100 μL de las muestras diluidas de hemolinfa y calor para desnaturalizar las proteínas.</li>
	<li>Cargue 20 μL de las muestras hervidas en un gel de proteína SDS-PAGE al 10% (consulte la Tabla de materiales) para separar las proteínas.</li>
	<li>Manchar el gel en una solución de Coomassie Blue (mezclar 1 g de Coomassie Brilliant Blue R-250 con 250 ml de isopropanol, 100 ml de ácido acético glacial y 650 ml deddH2O, y filtrar cualquier partícula con papel de filtro) durante 1 h a temperatura ambiente, y luego decolorar el gel durante 1 h con solución decolorante (100 ml de ácido acético, 400 mL de metanol, 500 mL deddH2O).</li>
</ol>5. Determinación de la concentración de proteínas
<ol><li>Diluir 10 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) a 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml y 0,3125 mg/ml con tampón PBS utilizando el método de dilución doble.</li>
	<li>Aspirar 5 μL de tampón PBS y cada concentración de soluciones de BSA en el paso 5.1, añadir 1 ml de 1x reactivo de colorante Bradford (ver Tabla de materiales) e incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Utilice tampón PBS en el reactivo de colorante Bradford como control, y cero en OD = 595 nm. Mida los valores de absorbancia de cada una de las concentraciones de proteína restantes y haga una curva estándar.</li>
	<li>Agregue 1 μL de hemolinfa de SBPH larvales, femeninos o masculinos en 100 μL de tampón PBS, y luego centrifugar las muestras a 1,000 x g durante 10 minutos a 4 ° C para eliminar los hemocitos.</li>
	<li>Aspirar 90 μL de sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga y medir los valores de absorbancia del sobrenadante de acuerdo con las instrucciones del paso 5.2.</li>
	<li>Calcular las concentraciones proteicas de las muestras de hemolinfa según la ecuación de regresión de la curva estándar. Incluir tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas en los experimentos.</li>
</ol>6. Detecciones microscópicas
<ol><li>Use micropipetas para recolectar hemolinfa de 10-15 SBPH en diferentes etapas del desarrollo. Agregue la hemolinfa recolectada en un tubo que contenga 20 μL de solución de paraformaldehído al 4% (ver Tabla de materiales). Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos para fijar la hemolinfa.</li>
	<li>Pipetear 20 μL de hemocitos fijos en el centro de un portaobjetos recubierto con silano (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Seque la gota en una rejilla de secado de diapositivas. NOTA: Evite el secado excesivo.</li>
	<li>Cubra la muestra con el reactivo antidecoloración de oro 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (consulte la Tabla de materiales) e inspeccione el portaobjetos bajo un microscopio invertido (consulte la Tabla de materiales).</li>
</ol>7. Cuantificación celular
<ol><li>Recolectar 1 μL de hemolinfa de los SPSB con una micropipeta y disolverlo en 20 μL de tampón PBS.</li>
	<li>Diluir las muestras de hemolinfa cinco veces con tampón PBS.</li>
	<li>Pipetear 20 μL de solución de hemolinfa en el centro de la cámara de conteo celular (ver Tabla de materiales). Cubra la gota con un cubreobjetos (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Cuente las celdas en los cinco cuadrados de la cámara de conteo de células (Figura suplementaria 1), bajo un microscopio invertido (ver Tabla de materiales). Incluye tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas en cada uno de los experimentos. Células/μL = recuento total de cinco cuadrados medios × 5 × factor de dilución × 104</li>
</ol>8. Análisis estadísticos
<ol><li>Realizar análisis estadísticos con el software correspondiente (ver Tabla de Materiales). Cree un nuevo archivo y seleccione la columna, importe los datos y genere un diagrama de dispersión con una barra.</li>
	<li>Calcule la media y la SD para cada grupo de datos mediante el uso de estadísticas de columna, y use una herramienta ANOVA unidireccional para evaluar la importancia de las diferencias entre los grupos. Determinar la media y la SD a partir de tres réplicas biológicas con tres experimentos independientes.</li>
</ol>

Recolección de hemolinfa de pequeños artrópodos

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Ray, S., Casteel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector-mediated+plant-virus-vector+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Effector-mediated plant-virus-vector interactions.</a> Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).</li>
<li>Islam, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-insect+vector-virus+interactions+under+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Plant-insect vector-virus interactions under environmental change.</a> Science of the Total Environment. 701, 135044(2020).</li>
<li>Cory, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+virus+transmission%3A+Different+routes+to+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Insect virus transmission: Different routes to persistence.</a> Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).</li>
<li>Wang, X. W., Blanc, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+transmission+of+plant+single-stranded+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses.</a> Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).</li>
<li>Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antimicrobial+peptides+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Insect antimicrobial peptides and their applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).</li>
<li>Liu, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+interaction+between+a+plant+virus+and+its+vector+insect+reveals+new+functions+of+hemipteran+cuticular+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).</li>
<li>Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bee+hemolymph+metabolome%3A+A+window+into+the+impact+of+viruses+on+bumble+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees.</a> Viruses. 13 (4), 600(2021).</li>
<li>Jia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+mediated+transmission+of+persistently+transmitted+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses.</a> Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).</li>
<li>Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+and+vertical+transmission+of+West+Nile+Virus+by+Aedes+vexans+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).</li>
<li>Gadhave, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+of+horizontal+and+vertical+transmission+of+cucurbit+leaf+crumple+virus+in+whitefly+Bemisia+tabaci+Gennadius%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius.</a> Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).</li>
<li>Logan, R. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+and+horizontal+transmission+of+cell+fusing+agent+virus+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222(2022).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+transmission+of+a+plant+virus+is+mediated+by+vitellogenin+of+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector.</a> PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949(2014).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+development+and+vitellogenin+determine+the+transovarial+transmission+of+begomoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).</li>
<li>Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antiviral+innate+immunity%3A+Pathways%2C+effectors%2C+and+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).</li>
<li>Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hepatitis+B+virus+replication+by+interferons+and+Toll-like+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).</li>
<li>Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+dengue+virus+circumvents+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How dengue virus circumvents innate immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2860(2018).</li>
<li>Gilliam, M., Shimanuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+of+hemolymph+of+the+larval+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L).</a> Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).</li>
<li>Huo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+tissue-specific+vitellogenin+facilitates+transmission+of+plant+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus.</a> PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909(2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus+ensures+viral+stability+in+the+hemolymph+of+vector+insects+through+suppressing+prophenoloxidase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation.</a> mBio. 11 (4), e01453(2020).</li>
<li>Vidano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phases+of+maize+rough+dwarf+virus+multiplication+in+the+vector+Laodelphax+striatellus+%28Fall%C3%A9n%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén).</a> Virology. 41 (2), 218-232 (1970).</li>
<li>Yu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laodelphax+striatellus+Atg8+facilitates+Rice+stripe+virus+infection+in+an+autophagy-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner.</a> Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).</li>
<li>Zhang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+monooxygenases+CYP6AY3+and+CYP6CW1+regulate+Rice+black-streaked+dwarf+virus+replication+in+Laodelphax+striatellus+%28Fallen%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen).</a> Viruses. 13 (8), 1576(2021).</li>
<li>Ribeiro, C., Brehelin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+haemocytes%3A+What+type+of+cell+is+that%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Insect haemocytes: What type of cell is that.</a> Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).</li>
<li>Butolo, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+quality+method+for+hemolymph+collection+from+honeybee+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae.</a> PLoS One. 15 (6), e0234637(2020).</li>
<li>Nesa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+potential+of+a+ponericin-like+peptide+isolated+from+Bombyx+mori+L.+hemolymph+in+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Scientific Reports. 12 (1), 15493(2022).</li>
<li>Mahmoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-injected+Musca+domestica+larval+hemolymph%3A+Cecropin+upregulation+and+potential+anticancer+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect.</a> Molecules. 27 (5), 1570(2022).</li>
<li>Patton, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((salivary+gland%2C+and+hemolymph+collection+from+Ixodes+scapularis+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3894(2012).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+amino+acid+variations+following+behavioral+and+genetic+changes+in+individual+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae.</a> Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).</li>
<li>Fiorotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosing+hemolymph+collection+and+inoculation+of+metarhizium+blastospores+into+Rhipicephalus+microplus+ticks+towards+invertebrate+pathology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59899(2019).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

La hemolinfa es el medio del sistema circulatorio en los artrópodos, y los arbovirus solo pueden invadir otros tejidos de artrópodos si son capaces de sobrevivir al ambiente hostil de la hemolinfa. La recolección de una muestra de hemolinfa de alta calidad es el primer paso para estudiar las interacciones vector-virus que ocurren en la hemolinfa. Se ha informado que la hemolinfa del insecto se puede obtener de varios sitios en el cuerpo del insecto, incluyendo una herida en la pata delantera, una incisión menor en el áre...

Tanto los virus animales como los vegetales pueden ser transmitidos por artrópodos, y estos virus representan una grave amenaza para la salud humana y causan enormes pérdidas económicas en la agricultura 1,2,3. Es importante destacar que la hemolinfa artrópodo, que sirve como sistema circulatorio y un elemento vital del sistema inmunológico en los artrópodos, juega un papel importante en la regulación de la transmisión arboviral. Los virus adquiridos a través de los intestinos de los artrópodos son transportados a otros tejidos sólo después de escapar con éxito del ambiente hemolinfático adverso 4,5,6,7. El ciclo de vida de los virus en la hemolinfa del artrópodo implica la supervivencia del virus en el plasma fluido, la entrada en el hemocito y el transporte a otros tejidos, y varios mecanismos de interacción virus-vector ocurren en la hemolinfa 8,9,10,11,12. Por ejemplo, la transmisión vertical del VRS por el SBPH depende de una interacción molecular entre la proteína vitelogenina SBPH y la proteína de la cápside13,14 del VSR (virus de la raya de arroz). Algunos virus pueden escapar de la respuesta inmune de la hemolinfa al unirse a factores vectoriales específicos15,16,17,18. Por lo tanto, investigar las interacciones vector-virus en la hemolinfa de los artrópodos es importante para desarrollar una mejor comprensión de la transmisión del arbovirus.
La hemolinfa de algunos insectos pequeños, como saltamontes, saltahojas y algunos mosquitos, es difícil de recolectar debido a su tamaño. Para abordar este problema, se han desarrollado varios métodos para recolectar hemolinfa, incluida la inserción de una aguja de jeringa directamente en el cuerpo del insecto para extraer un microvolumen de la hemolinfa, la recolección de exudado del sitio de la herida con pinzas de punta fina y la centrifugación directa. Estos métodos han permitido la medición de los niveles relativos de expresión génica y títulos virales dentro de la hemolinfa 19,20,21. Sin embargo, actualmente no se dispone de un método eficaz para cuantificar el volumen de hemolinfa, que es necesario para el recuento de hemocitos, la cuantificación de proteínas y el análisis de la actividad enzimática, para estos pequeños insectos.
El SBPH (pequeño saltaplantas marrón) es un tipo de pequeño insecto vector con una longitud corporal de aproximadamente 2-4 mm. El SBPH es capaz de transmitir una variedad de virus de plantas, incluyendo el VSR, el virus enano áspero del maíz y el virus enano rayado negro del arroz22,23,24. La interacción entre el SBPH y el VSR se ha estudiado en profundidad durante la última década. Para facilitar el trabajo con SBPH, desarrollamos un método novedoso y simple de recolección de hemolinfa. Este método, que se basa en el principio de las fuerzas capilares, utiliza un capilar con una marca de escala para adquirir la hemolinfa del insecto de una manera precisa y cuantificable. Esto nos permite recolectar un volumen específico de hemolinfa de pequeños insectos de manera eficiente y estudiar el entorno hemolinfático de pequeños vectores con más detalle.

<table><tbody><tr><td>Gel proteico SDS-PAGE al 10%</td><td>Bio-rad</td><td>4561035</td><td>Separación y detección de proteínas</td></tr><tr><td>Paraformaldehído al 4%</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>Para la fijación de las células o tejidos&nbsp;</td></tr><tr><td>Reactivo de colorante Bradford</td><td>Bio-rad 5000205 Detección de</td><td></td><td>la concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Capilar</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Para la recolección de hemolinfa</td></tr><tr><td>Cámara de recuento de células</td><td>ACMEC</td><td>AYA0810</td><td>Recuento de hemocitos</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Gitoglas</td><td>10127105A</td><td>Para sujetar insectos</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio recubierto de silano</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Para la conservación de muestras de microscopio</td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración de oro con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>Tinción de núcleos</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio</td><td>Gitoglas</td><td>10212424C</td><td>Para la observación microscópica</td></tr><tr><td>Bulbo de pipeta</td><td>Hirschmann</td><td>9000101</td><td>Para la recogida de hemolinfa</td></tr><tr><td>Software Prism 8.0</td><td>GraphPad Software</td><td>/</td><td>Análisis estadísticos</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico&nbsp;</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>Para la disección de insectos</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Tianld</td><td>P5622</td><td>Para la disección</td></tr><tr><td>de insectos Microscopio invertido Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td>Observación de hemocitos</td><td></td></tr></tbody></table>

un método preciso y cuantificable para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños

A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods

Se sabe que los artrópodos transmiten una variedad de virus de importancia médica y agrícola a través de su hemolinfa, que es esencial para la transmisión del virus. La recolección de hemolinfa es la tecnología básica para estudiar las interacciones virus-vector. Aquí, describimos un método novedoso y simple para la recolección cuantitativa de hemolinfa de pequeños artrópodos utilizando Laodelphax striatellus (el pequeño saltaplantas marrón, SBPH) como modelo de investigación, ya que este artrópodo es el principal vector del virus de la raya del arroz (VSR). En este protocolo, el proceso comienza pellizcando suavemente una pierna del artrópodo congelado con pinzas de punta fina y presionando la hemolinfa fuera de la herida. Luego, se utiliza una micropipeta simple que consiste en un capilar y un bulbo de pipeta para recoger la hemolinfa transudativa de la herida de acuerdo con el principio de fuerzas capilares. Finalmente, la hemolinfa recolectada se puede disolver en un tampón específico para su posterior estudio. Este nuevo método para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños es una herramienta útil y eficiente para futuras investigaciones sobre arbovirus e interacciones vector-virus.

Modelo de micropipeta y recolección de hemolinfa Hemos desarrollado una micropipeta simple cuya acción se basa en las fuerzas capilares del tubo capilar. La micropipeta está compuesta por un tubo capilar y un bulbo de pipeta (Figura 1A). Los tubos capilares están disponibles en diferentes tamaños de volumen que van desde 1 μL a 20 μL, y los volúmenes del tubo capilar se seleccionan de acuerdo con los requisitos. No se recomiendan tubos capilares con volúmenes más pequeños...

Describimos un método para recolectar hemolinfa cuantificable de manera eficiente de artrópodos pequeños para su posterior análisis.

Un método preciso y cuantificable para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños

Arthropods are known to transmit a variety of viruses of medical and agricultural importance through their hemolymph, which is essential for virus ...

Nuestra investigación se centra en arbovirus, insectos e interacciones con plantas. La obtención de muestras de hemolinfa de pequeños artrópodos presenta un desafío técnico para la investigación de enfermedades transmitidas por insectos. Este protocolo muestra una técnica precisa y cuantificable para contrarrestar este problema.Investigaciones recientes en la transmisión de arbovirus han descubierto que los virus pueden manipular varios factores vectoriales importantes para romper la barrera del huésped. Este protocolo es una técnica simple, rentable y valiosa que permite la cuantificación precisa de la hemolinfa. Este método también ofrece una tecnología valiosa para iniciar las interacciones entre virus y vectores.Nuestra próxima investigación se centrará en comprender los mecanismos moleculares de la transmisión de virus por insectos vectores mientras explora y mejora nuevas técnicas operativas.

a-precise-quantifiable-method-for-collecting-hemolymph-from-small

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El cangrejo de herradura de América, Limulus polyphemus, es sin duda la fuente más conveniente para grandes cantidades de sangre de cualquier invertebrado. La sangre es simple en su composición, con un solo tipo de células en la circulación general, los amebocitos granular, y sólo tres abundantes proteínas en el plasma, la hemocianina, la proteína C-reactiva, y la α2-macroglobulina. La sangre se recoge desde el corazón y las células de la sangre y el plasma se separa por centrifugación.

Extracción de sangre del cangrejo herradura de América, Limulus polyphemus

Señalización de la insulina conserva las vías se encuentran en la mosca de la...

Inyección de insulina y extracción hemolinfa para medir la sensibilidad a la insulina en adultos Drosophila melanogaster</em

Un método simplificado pero preciso para recoger y mancha hemocitos mosquito se describe. Nuestro método combina la simplicidad de la perfusión con la precisión de las técnicas de inyección de alta para aislar a los preparativos limpia de hemocitos en los mosquitos Aedes. Este método facilita el conocimiento de los estudios que requieren los tipos de hemocitos y su abundancia.

Un protocolo para la recolección y la tinción de los hemocitos del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti</em

Hemocitos Insectos llevar a cabo muchas funciones importantes, tanto inmunes y no inmunes, en todas las etapas de desarrollo del insecto. Nuestro conocimiento actual de los tipos de hemocitos y la función proviene de estudios en modelos genéticos de insectos. A continuación, se presenta un método para la extracción, cuantificación y visualización de hemocitos de larvas silvestres.

Un protocolo simple para la extracción de hemocitos de orugas silvestres

La hemolinfa de Drosophila sirve como sangre y líquido intersticial, circulando por todo el cuerpo durante las etapas de larva y adulto. En este vídeo se describe un protocolo de recogida de hemolinfa larvaria con el fin de cuantificar las células circulantes.

Disrupción de la cutícula: un método para recolectar hemolinfa de larvas de Drosophila

Este video muestra el ensayo de perturbación de hemocitos, evaluando la readhesión de hemocitos en las bolsas hematopoyéticas de las larvas de Drosophila. La alteración mecánica libera hemocitos residentes, elevando los recuentos de hemocitos circulantes. Después de la recuperación, se confirma la readherencia de los hemocitos residentes, lo que ilustra la reversibilidad.

Ensayo de alteración de hemocitos para evaluar la readhesión de hemocitos a las bolsas hematopoyéticas

Las células sanguíneas de Drosophila, o hemocitos, circulan entre los sitios residentes y la circulación.  En la larva, los hemocitos residentes (sésiles) se localizan en microambientes inductivos, las bolsas hematopoyéticas, mientras que los hemocitos circulantes se mueven libremente en la hemolinfa. El objetivo de este protocolo es el aislamiento y la cuantificación estandarizados de estas dos poblaciones de hemocitos que tienen un comportamiento distinto pero que se intercambian.

Analizando poblaciones de células sanguíneas de la<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Drosophila y sistemas hematopoyético de mamíferos comparten muchas características comunes, por lo que la Drosophila un modelo genético atractivo para estudiar la hematopoyesis. Aquí se demuestra la disección y el montaje de los principales órganos hematopoyéticos larvas para inmunohistoquímica. También describimos métodos para ensayar diversos compartimentos hematopoyéticas larvas incluyendo circulantes hemocitos y células de cristal sésiles.

Métodos para examinar los nódulos linfáticos y en los hemocitos<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Este método muestra cómo visualizar la invasión del patógeno en las células de los insectos con modelos tridimensionales (3D). Hemocitos de larvas de Drosophila estaban infectadas con patógenos virales o bacterianos, o ex vivo o en vivo. Hemocitos infectados luego fijados y teñidos para la proyección de imagen con un microscopio confocal y la posterior reconstrucción celular 3D.

Extracción de hemocitos de larvas de Drosophila melanogaster para infección microbiana y análisis

El análisis de la hemolinfa de garrapata representa una importante fuente de información sobre cómo algunos patógenos causan enfermedades y cómo las garrapatas responden inmunológicamente a esta infección. El presente estudio demuestra cómo inocular propágulos fúngicos y recolectar hemolinfa de las hembras engorgadas de rhipicephalus microplus .

Divulgar la colección hemolymph y la inoculación de Metarhizium blastosporos en las garrapatas de rhipicephalus microplus hacia los estudios de patología de invertebrados

Este protocolo describe un ensayo in vivo de fagocitosis utilizado para evaluar y cuantificar la capacidad de los hemocitos de Drosophila melanogaster jóvenes y envejecidos a las bacterias fagocitosas..

Evaluación de la capacidad fagocítica específica por edad de los hemocitos de Drosophila melanogaster adultos utilizando un ensayo de fagocitosia In Vivo

Aprenda un método preciso para recolectar hemolinfa cuantificable de artrópodos pequeños como la chinche parda del arroz. Esta técnica sencilla y económica facilita el estudio de interacciones virus-vector en investigación de arbovirus.

Un método preciso y cuantificable para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños

Explorar más videos