Name: Un nuevo método de inyección celular con una invasión mínima (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:25:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprende un método de trasplante de cardiomiocitos con mínima invasión tisular para medicina regenerativa cardíaca usando células pluripotentes inducidas. Esta técnica mejora la integración del injerto y reduce la inflamación.

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Este estudio contó con el apoyo de una subvención de JSPS KAKENHI (Subvención Nº 23390072 y 19K07335) y AMED (Subvención Nº A-149).

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas de la Universidad de Medicina de Kansai para experimentos con animales y fueron aprobados por los comités de ética (número de aprobación: 23-104). Todos los animales fueron criados bajo un ciclo constante de luz-oscuridad en un ambiente específico libre de patógenos. Todas las herramientas quirúrgicas esterilizadas, como tijeras, fórceps y retractores, se esterilizaron en autoclave y se secaron completamente.
1. Preparación de las bolas de cardiomiocitos de rata neonatal
<ol><li>Colección de corazón de rata neonatal<ol><li>Para la extracción del corazón, se debe seguir un procedimiento similar al descrito en un informe anterior7.</li>
		<li>Sumergir secuencialmente a las ratas Sprague-Dawley (SD) neonatales (0-2 días después del nacimiento) en soluciones de povidona yodada y etanol al 70%, y luego transferirlas a un estuche hermético lleno de isoflurano vaporizado (la concentración debe ser superior al 10% v/v) para anestesia profunda.</li>
		<li>Después de la confirmación de la inconsciencia por una pérdida de actividad locomotora, decapitar a la rata mientras sostiene el cuerpo desde la espalda con la mano, y luego cortar 2-4 mm de tejido desde el centro frontal de la caja torácica hasta la caudal y luego en dirección rostral con tijeras afiladas.</li>
		<li>Agarra la piel de la espalda para abrir el corte y empujar el corazón hacia afuera de la caja torácica. Cortar los ventrículos con unas tijeras y sumergirlos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio (PBS(−)).</li>
	</ol></li>
	<li>Dispersión de los cardiomiocitos de ratas neonatas<ol><li>Picar los ventrículos recolectados dispersos en una cantidad mínima de tampón Ads (tampón Ads: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO 4, 5,6 mM glucosa, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35) en una cristalería cóncava esterilizada en autoclave en trozos pequeños (1 mm x 1 mm) con unas tijeras curvas.</li>
		<li>Transfiera los tejidos picados y un agitador micromagnético a un tubo de centrifugación de 50 ml y disperse los tejidos en células individuales con colagenasa al 0,1 %, tripsina al 0,1 %, 20 μg/ml de DNasa I y éster metílico de tetrametilrodamina de 50 nM en tampón Ads a 37 °C agitando durante 30 min.</li>
		<li>Separe los agregados y las células dispersas a través de la sedimentación natural, recoja solo las células dispersas en un tubo y digiera los agregados celulares residuales nuevamente con el mismo medio de digestión.</li>
		<li>Continúe este procedimiento hasta que todas las células estén completamente disociadas. Para confirmar la dispersión completa de las células, observe los tubos bajo un microscopio (lente de objetivo 4x).</li>
		<li>Recoja las células dispersas mediante centrifugación a 150 x g durante 5 min y disocie en 1-2 mL de tampón Ads.</li>
	</ol></li>
	<li>Clasificación celular activada por fluorescencia de cardiomiocitos<ol><li>Analice las células mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando filtros de paso de banda de 556-601 nm para detectar señales de fluorescencia roja.</li>
		<li>Realice cuidadosamente la pre-compuerta para eliminar las fracciones dobletes14. La configuración de la puerta para la eliminación de dobletes debe ser según las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Establezca la dispersión hacia adelante en el eje x y la señal de fluorescencia roja en el eje y. Se observaron tres poblaciones: una población inferior que contenía eritrocitos y células muertas, una población media que contenía no cardiomiocitos, incluyendo fibroblastos y células endoteliales, y una población superior que contenía cardiomiocitos ventriculares puros7.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de bolas de cardiomiocitos marcadas con fluorescencia roja<ol><li>Clasificar selectivamente los cardiomiocitos y centrifugar durante 5 min a 150 x g. Disolver completamente los gránulos celulares en 1 ml de medio esencial mínimo alfa modificado (alfa-MEM) que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor.</li>
		<li>Mida la concentración celular con un hemocitómetro y diluya la solución de suspensión celular a 3.000 células/ml con alfa-MEM 10% FBS.</li>
		<li>Distribuirlos en placas celulares no adhesivas de 96 pocillos (100 μL por pocillo), centrifugar durante 5 min a 100 x g y cultivar durante 2-3 d en una incubadora de cultivo celular con 5% de CO2 a 37 °C.</li>
		<li>Antes de los experimentos de inyección, extraiga una bola de cardiomiocitos de cada pocillo mediante aspiración con el medio de cultivo utilizando una pipeta de 1.000 μL y recójalos en un tubo de 15 ml.</li>
		<li>Tiñir con PKH26 siguiendo las instrucciones del fabricante para el seguimiento después del injerto.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparaciones para el método de inyección lenta
<ol><li>Preparación de la solución madre de gelatina<ol><li>Pesa la gelatina, disuélvela en tampón Ads para producir una solución al 10% p/v y autofócala en autoclave.</li>
	</ol></li>
	<li>Producción de un dispositivo de inyección celular<ol><li>Diseño general del dispositivo: Prepare el aparato que se muestra en la Figura 1. Este sistema se combina con un aparato de enfriamiento de jeringa y un aparato de inyección principal.</li>
		<li>Prepare el aparato de inyección principal que se describe a continuación:<ol><li>Para una inyección neonatal en bola de cardiomiocitos, utilice una aguja de 29 G y 50 mm de largo equipada con una jeringa.</li>
			<li>Conecte una jeringa de transferencia de energía (18 G, 1 ml) espalda con espalda con una jeringa de inyección celular (Figura 1). Conecte la aguja de la jeringa de transferencia de potencia a un tubo delgado de polipropileno con baja capacidad de expansión de lúmenes.</li>
			<li>Luego, conecte el otro lado del tubo de transferencia de energía a la aguja de la misma jeringa (18 G, 1 ml) y colóquelo en una bomba de jeringa. Llene las dos jeringas y tubos de transferencia de energía con agua sin burbujas de aire. NOTA: Cuando se empuja un émbolo de la jeringa de transferencia de potencia, la presión se transfiere directamente a la otra jeringa y el émbolo sobresale.</li>
		</ol></li>
		<li>Configure el sistema de enfriamiento de la jeringa de inyección como se describe a continuación.<ol><li>Enrolle un tubo de cobre (diámetro externo = 1 mm; diámetro interno = 0,3 mm; grosor = 0,35 mm) firmemente alrededor de la parte de la jeringa de inyección celular que contiene la celda, dejando 10 mm de tubo sobrante en ambos extremos.</li>
			<li>Conecte el tubo de cobre a un tubo de plástico flexible. Además, conecte los otros extremos de la tubería de plástico a una bomba externa, llene la línea con agua de enfriamiento y enfríe el agua sumergiendo el exceso de tubo de cobre en hielo picado (Figura 1). NOTA: Este sistema de enfriamiento mantiene la solución de suspensión de celdas en el cilindro a aproximadamente 2 °C.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. Desarrollo de un modelo de infarto de miocardio en ratas por oclusión obtusa de la arteria coronaria
<ol><li>Anestesiar ratas desnudas macho inmunodeficientes (F344/Njcl-rnu/rnu) con aire que contenga 3% de isoflurano. Inserte una cánula en la tráquea y conéctela al respirador.</li>
	<li>Conecte una cánula a un vaporizador de isoflurano con un controlador para mantener una concentración de isoflurano del 3% y, por lo tanto, mantener suficiente anestesia. Confirmar que no hay respuesta a los estímulos de dolor. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad.</li>
	<li>Fije las extremidades con cintas quirúrgicas cortadas en una placa quirúrgica calentada a 40 °C. Gira el cuerpo de la rata hacia la derecha del eje del cuerpo y usa la axila izquierda como campo quirúrgico.</li>
	<li>Eliminar el vello en el campo quirúrgico con una crema depilatoria y limpiar la piel con povidona yodada. Con unas tijeras afiladas, haga una incisión de 1,5 cm en la piel y el músculo pectoral mayor.</li>
	<li>Confirme el tercer espacio intercostal y rasgue los músculos intercostales y la pleura costal con micropinzas con puntas romas. Mantenga el cofre abierto usando un retractor. Retire suavemente el pericardio delgado con unas pinzas.</li>
	<li>Para construir un modelo de infarto de la pared lateral del corazón, encuentre la posición 1 mm caudal a la punta de la aurícula izquierda para identificar la arteria coronaria obtusa, pase una sutura de seda 7-0, recoja tejido de 2,5 mm de ancho y 2,5 mm de profundidad desde la dorsal hasta la ventral, y lige el tejido con fuerza.</li>
	<li>Confirme el éxito de la ligadura por la débil contracción distal de la ligadura. Después de retirar suavemente el retractor, coloque una sutura de seda 5-0 entre el segundo y el cuarto espacio intercostal, y cierre la toracotomía.</li>
	<li>Disminuya la concentración de isoflurano al 1%. Suturar suavemente el músculo y la piel con seda 5-0. Disminuya la concentración de isoflurano al 0% y espere aproximadamente 5 minutos hasta que comience la respiración espontánea.</li>
	<li>Aplique tópicamente 2 mg/ml de lidocaína en solución salina a la incisión. Administrar 1 ml de solución salina mediante una inyección subcutánea. Aplique ungüento veterinario por vía tópica para prevenir infecciones.</li>
	<li>Retire a la rata del tubo de intubación y devuélvala a la jaula del animal; Luego, cría a las ratas en jaulas individuales durante 1 semana.</li>
	<li>Analizar los cambios en la función de la bomba sistólica cardíaca mediante ecocardiografía. NOTA: La función cardíaca se verá reducida debido al infarto lateral de miocardio.</li>
</ol>4. Trasplante percutáneo de células ecoguiado mediante el método de inyección lenta
<ol><li>Precalentar el caldo de gelatina al 10% a 37 °C hasta que se vuelva líquido.</li>
	<li>Diluir el caldo de gelatina al 10% con tampón Ads precalentado para obtener la solución de gelatina inyectable final al 5% p/v (se requieren 100 μL por animal).</li>
	<li>Suspender 96 bolas de cardiomiocitos (total: 28.800 cardiomiocitos/animal) en 100 μL de solución inyectable precalentada.</li>
	<li>Cargue la suspensión preparada en el paso 4.3 en la jeringa de inyección celular, evitando la aspiración del exceso de aire.</li>
	<li>Para eliminar las burbujas en la jeringa, sujétela verticalmente con la aguja hacia arriba, golpee la jeringa y recoja las burbujas en la cresta superior de la jeringa. NOTA: Durante este paso, observe cómo las bolas de cardiomiocitos se asientan gradualmente en el sello de goma del émbolo.</li>
	<li>Mantenga la posición vertical de la jeringa, empuje el émbolo hacia arriba lentamente y deseche las burbujas y el exceso de solución de suspensión celular hasta que queden 20 μL de la suspensión celular en la jeringa. Empuje el émbolo con cuidado a una velocidad constante para que la bola de cardiomiocitos permanezca apoyada en el sello de goma del émbolo.</li>
	<li>Sumerja la jeringa tapada directamente en un baño de hielo durante 5 minutos.</li>
	<li>Coloque una jeringa enfriada en el aparato de inyección. Fije firmemente el aparato de jeringa de inyección colocado en un dispositivo de movimiento fino en el escenario del animal usando una abrazadera hecha a mano ajustable en posición X-Y-Z. El dispositivo de movimiento fino puede mover la posición de la aguja utilizando el deslizamiento de 20 mm en dirección x, el balanceo en dirección y los movimientos de arco en dirección z.</li>
	<li>Anestesiar a las ratas en una caja sellada llena de aire que contiene un 3% de isoflurano. Confirmar la anestesia por no responder a los estímulos dolorosos. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad.</li>
	<li>Fije las extremidades con cintas quirúrgicas cortadas en una placa de eco calentada a 40 °C. Para mantener suficiente anestesia, asegúrese de que el aire inhalado contenga una concentración de aproximadamente el 3% de isoflurano.</li>
	<li>Retirar el vello en el campo de inyección (2 cm de diámetro) y el pecho con crema depilatoria y limpiar la piel con povidona yodada.</li>
	<li>Aplique ecogel en el pecho y sonda de eco. Coloque la sonda de eco cerca del tórax a lo largo de los ejes craneal y caudal y comience a obtener una ecocardiografía en modo B siguiendo el manual del fabricante.</li>
	<li>Avance la punta de la aguja de inyección en el miocardio en la vista frontal (Figura 2 y Video complementario 1).</li>
	<li>Para activar la bomba de jeringa principal, presione el botón de inicio y gire el dial para ajustarlo a un número predeterminado para una velocidad de inyección de aproximadamente 0,02 μL/s. Aplique el ungüento veterinario tópicamente alrededor de la posición de punción para prevenir infecciones. NOTA: Es necesario determinar el número de marcación apropiado para la velocidad de inyección prevista utilizando una solución de inyección. Después de la inyección, retire la aguja de inyección utilizando un sistema de movimiento ejemplar.</li>
	<li>Disminuya la concentración de isoflurano al 0% y espere aproximadamente 5 minutos hasta que el animal recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.</li>
</ol>5. Evaluación de la función cardíaca
<ol><li>Anestesiar a las ratas en una caja sellada llena de aire que contiene un 3% de isoflurano. Confirmar la anestesia por no responder a los estímulos dolorosos. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad.</li>
	<li>Aplique crema electrizante para la adquisición de ECG en las puntas de las extremidades. Fije las extremidades con cintas quirúrgicas cortadas en una placa de eco calentada a 40 °C. Utilice un sistema de monitorización fisiológica para detectar el ECG y la frecuencia cardíaca en tiempo real.</li>
	<li>De acuerdo con las instrucciones del fabricante, primero determine el ángulo del eje largo utilizando la imagen de eco en modo B que muestra el vértice del ventrículo izquierdo hasta el tracto de salida y, a continuación, gire la sonda de eco 90° para cambiar a la vista de eje corto.</li>
	<li>Usando solo el sistema de movimiento fino del eje caudal al rostral de la etapa animal, ajuste la vista del eje corto al nivel del músculo papilar. A continuación, cambie el modo de imagen al modo M pulsando el botón M-mode y grabe un vídeo durante 5 s pulsando el botón Cine-loop .</li>
	<li>Para analizar y calcular el acortamiento de la fracción con el software, presione el botón Medir y una herramienta de línea vertical para definir las dimensiones internas del ventrículo izquierdo al final de la sistólica y al final de la diastólica. El software calcula automáticamente el porcentaje de acortamiento de la fracción (FS).</li>
	<li>Disminuya la concentración de isoflurano al 0% y espere aproximadamente 5 minutos hasta que el animal recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.</li>
</ol>6. Inmunohistoquímica
<ol><li>Fije el cuerpo eutanasiado (realice la eutanasia como en el paso 1.1.3) sobre la mesa utilizando las cintas quirúrgicas cortadas, extirpe los corazones, lávelos con PBS y sumérjalos en paraformaldehído/PBS al 4%.</li>
	<li>Diseccionar los corazones en tres secciones, sumergirlos en sacarosa al 40% para crioprotección, incrustarlos en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y congelarlos a -80 °C.</li>
	<li>Fije los tejidos crioseccionados (8 μm de grosor) a portaobjetos de vidrio recubiertos de aminosilano. Después de un secado suficiente con viento no calentado generado por un secador de pelo general, sumerja los portaobjetos de vidrio en solución salina tamponada con tris que contenga 0,2% de Tween-20 (TBS-T).</li>
	<li>Sumérgelos en una solución de bloqueo durante 30 min a 25 °C. Vierta 100 μL de la solución bloqueante primaria que contiene anticuerpos en el portaobjetos e incube durante la noche a 4 °C con sellado de parafina para mantener la solución de anticuerpos esparcida en el tejido. NOTA: La concentración de anticuerpos se muestra en la Tabla de Materiales.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos horizontalmente en una caja de alta humedad hecha a mano utilizando el vapor natural del papel húmedo para evitar la evaporación. Lave los portaobjetos tres veces con TBS-T.</li>
	<li>Tratar con el agente bloqueador secundario que contiene anticuerpos durante 1 h a 25 °C de la misma manera que el anticuerpo primario. Después de tres lavados, observe las señales de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia y un microscopio láser confocal. NOTA: La concentración de anticuerpos se muestra en la Tabla de Materiales.</li>
	<li>Análisis estadístico: Para la comparación del volumen de la celda, como se muestra en la Figura 3A, realice una prueba t no apareada; Para evaluar la recuperación funcional cardíaca después de la administración de cardiomiocitos mediante el método de inyección lenta, como se muestra en la Figura 4A, utilice una prueba t pareada. En este trabajo, las diferencias se consideraron estadísticamente significativas con P < .01. Las barras de error representan la desviación estándar.</li>
</ol>

Un nuevo método de inyección lenta mínimamente invasivo para reducir la lesión tisular

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</ol>

El autor no tiene nada que revelar.

Uno de los puntos críticos en el desempeño exitoso del método de inyección lenta es la preparación de un sistema de inyección efectivo utilizando una potente bomba de jeringa y un fuerte tubo de transferencia de presión. Se requiere un sistema de alta presión para empujar el gel desde la punta de una aguja fina. El segundo punto crítico es la estabilización del corazón. El latido del corazón contra una aguja de inyección introducida en el miocardio puede lesionar el tejido. En este estudio, se realizó una inyección ecoguiada para evitar que los animales sufrieran una segunda lesión torácica abierta y para administrar la inyección celular en un corazón estabilizado con los pulmones inflados. Además, en algunas aplicaciones para animales más grandes o humanos, algunos dispositivos de inyección conectados al corazón deben considerarse como parte del diseño estratégico de la aplicación. Para las inyecciones torácicas abiertas en el corazón de animales pequeños, se recomienda el uso de una aguja larga y flexible dada su frecuencia cardíaca más alta.
En este trabajo, el método de inyección lenta aumentó significativamente el volumen de cardiomiocitos supervivientes en comparación con el método de inyección normal. La inyección normal causa daño celular a través del esfuerzo cortante15. Por el contrario, el método de inyección lenta no causa tal estrés teóricamente porque utiliza una solución no newtoniana además de la inyección lenta.
En cuanto a la fibrosis local, el espacio intersticial alrededor de los cardiomiocitos supervivientes inyectados normalmente mostró un depósito fuerte y generalizado de colágeno tipo I. Por el contrario, las señales de colágeno tipo I alrededor de los cardiomiocitos injertados mediante el método de inyección lenta eran mucho más débiles y limitadas. Esto sugiere que el método de inyección lenta causó un daño significativamente menor. La inyección lenta de cardiomiocitos neonatales en el miocardio adulto mejoró significativamente la función contráctil del corazón infartado. Los análisis histológicos sugirieron que el injerto de los cardiomiocitos mediante el método de inyección lenta dio lugar a conexiones directas y acoplamiento funcional con los cardiomiocitos del huésped. Este fenómeno explica el mecanismo de recuperación funcional del miocardio del huésped. Hasta donde sabemos, este es el primer informe de cardiomiocitos neonatales injertados con conexiones perfectas a gran escala con los cardiomiocitos adultos del huésped. Las conexiones funcionales con el miocardio del huésped a través del acoplamiento eléctrico y mecánico pueden hacer que los cardiomiocitos injertados maduren y les permitan actuar como miocitos funcionales que contribuyen a la función cardíaca del huésped. Las interacciones de fuerza física a largo plazo entre el huésped y los cardiomiocitos del injerto son cruciales para la maduración completa. Por lo tanto, podrían ser necesarios 2 meses después de la inyección para la recuperación funcional del corazón infartado. La recuperación dependiente del tiempo de la función cardíaca del paciente puede ser un fenómeno esperado en aplicaciones terapéuticas, y esto puede ser un sello distintivo del establecimiento exitoso del acoplamiento funcional de novo y la integración entre el huésped y los cardiomiocitos injertados.
El método de inyección lenta se puede realizar durante la cirugía de tórax abierto. Además, este método se puede aplicar a ratones. Para futuras aplicaciones en terapia humana, todavía tenemos que resolver varios problemas. La velocidad de inyección debe optimizarse teniendo en cuenta la capacidad tampón del flujo de fluido intersticial en cada órgano diana humano. Se deben aplicar materiales libres de xeno, como gelatina humana o materiales sintéticos biodegradables. Deben desarrollarse aparatos clínicos de inyección lenta de grado GMP, como herramientas desechables compactas específicas para órganos o un aparato reutilizable aplicable a órganos anchos.

La administración y el reemplazo de células son estrategias terapéuticas novedosas y prometedoras para órganos muy dañados. Entre estas novedosas estrategias terapéuticas, la medicina regenerativa cardíaca ha atraído una atención considerable. Sin embargo, la inflamación causada por las lesiones media la formación de cicatrices en varios órganos 1,2,3,4. El corazón humano está formado por aproximadamente 10o 10 cardiomiocitos; por lo tanto, teóricamente5,6, debe ser tratada con más de 109 cardiomiocitos. La administración de un gran número de cardiomiocitos a través de métodos de inyección tradicionales puede provocar lesiones tisulares significativas7. Este método proporciona un nuevo método de inyección celular con una invasión mínima de tejidos.
La administración de células en el parénquima del órgano requiere inyecciones. Sin embargo, existe una discrepancia en el sentido de que la inyección en sí misma puede provocar lesiones en los tejidos. La lesión tisular causa inflamación local y cicatrices incurables en órganos y tejidos, así como deterioro de la capacidad regenerativa 8,9,10. El corazón de los mamíferos tiene una propensión extremadamente alta a desarrollar cicatrices en lugar de regenerarse, ya que requiere una reparación inmediata de la lesión para soportar la presión arterial alta causada por su función de bombeo continuo11. La terapia de ablación utiliza esta alta propensión a la formación de cicatrices y bloquea el circuito que probablemente sufra la formación de cicatrices mediante arritmia12. En un estudio previo, se observó que el tejido cicatricial aislaba los cardiomiocitos inyectados en el miocardio del huésped. Por lo tanto, este representa el siguiente problema objetivo que debe superarse para obtener una mayor eficacia terapéutica en medicina regenerativa cardíaca.
El flujo de líquido intersticial tisular desempeña un papel vital en el transporte de oxígeno y nutrientes a las células y en la eliminación de los desechos excretados de las células. La velocidad fisiológica del flujo de líquido intersticial en cada tejido/órgano es diferente (el rango es de 0,01-10 μm/s)13. Hasta donde sabe el autor, no hay datos sobre la capacidad de los tejidos/órganos individuales para soportar cantidades adicionales de líquido sin edema patológico; Sin embargo, este experimento intenta utilizar una velocidad de inyección lenta para reducir posiblemente la lesión tisular, y los resultados se pueden utilizar para determinar la practicidad de este concepto.

<table><tbody><tr><td>aguja de calibre 18 y tuberculina, 1 mL</td><td>Terumo&nbsp;</td><td>NN1838R, SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de calibre 29 de 50 mm de largo</td><td>Ito Corporation, Tokio, Japón</td><td>14903 Tipo-A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Un tubo de cobre</td><td>Proveedor general diámetro</td><td></td><td>exterior, 1 mm; diámetro interior, 0,3 mm; espesor, 0,35 mm</td></tr><tr><td>Tampón de anuncios</td><td>Cada ingrediente fue comprado a Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japón</td><td></td><td>Hecho a mano, Composición: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO4, 5,6 mM glucosa, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35</td></tr><tr><td>alfa-MEM</td><td>Película Fuji Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japón</td><td>051-07615</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anticolágeno tipo I para conejos (H+L)</td><td>Proteintech</td><td>14695-1-AP</td><td>con dilución 1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-conexina-43 para conejos (H+L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6219</td><td>con dilución 1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-conejo IgG (H+L) para donley-AlexaFluo488&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21206</td> con solución de bloqueo de <td>dilución 1:300</td></tr><tr><td>(Blocking One)</td><td>Nacalai Tesque, Kioto, Japón</td><td>03953-95&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>colagenasa</td><td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japón</td><td>034-22363</td><td></td></tr><tr><td>microscopio láser confocal</td><td>Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Alemania</td><td>LSM510 META</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria III</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>BioWest, FL, EE. UU.</td><td>Dispositivo de movimiento fino S1820-500</td><td></td></tr><tr><td>(Micromanipulador)</td><td>Narishige Co., Ltd., Tokio, Japón</td> Microscopio de fluorescencia <td>M-44</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Nikon Instruments, Tokio, Japón</td><td>Eclipse Ti2</td><td></td></tr><tr><td>gelatina de piel bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9382</td><td>que se disuelve en PBS (-) al 10% y se esteriliza en autoclave</td></tr><tr><td>Ratas neonatales Sprague-Dawley (SD)</td><td>Japón SLC Inc., Shizuoka, Japón</td><td></td><td>0&ndash; 2 días después del nacimiento</td></tr><tr><td>placas no adhesivas de 96 pocillos (placa esféloide)</td><td>Baquelita Sumitomo, Tokio, Japón</td><td>MS-0096S</td> Temperatura óptima de <td></td></tr><tr><td>corte (OCT) Compuesto&nbsp;</td><td>Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA</td><td>Tissue-Tek OCT</td> bomba peristáltica compuesta <td></td></tr><tr><td>(para sistema de refrigeración)</td><td>As One Co., Osaka, Japón</td><td>SMP-23AS</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>Barra agitadora, Micro, Magnética, PTFE, Longitud x Diámetro en mm: 5 x 2</td><td>Chemglass life sciences LLC, NJ, EE. UU</td>. <td>Jeringa CG-2003-120</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Ito Corporation, Tokio, Japón</td> Bomba de jeringa <td>MS-N25</td><td></td></tr><tr><td>con control remoto</td><td>As One Co., Osaka, Japón</td><td>MR-1, CT-10</td><td></td></tr><tr><td>tetrametilrodamina éster metílico</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>tripsina</td><td>DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japón</td><td>167-11515</td><td></td></tr><tr><td>ungüento veterinario</td><td>&nbsp; Fujita Farmacéutica Co., Ltd.</td><td>Pomada Hibikusu&nbsp; #WAK-95832</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen Vevo 2100</td><td>Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canadá</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 Software del sistema de imagen versión 1.0.0</td><td>Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canadá</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Aguja débilmente curvada con hilo oftálmico</td><td>Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokio, Japón</td><td>C7-70</td><td></td></tr></tbody></table>

un nuevo método de inyección celular con una invasión mínima

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

La inyección directa de células en los tejidos es un proceso necesario en la administración celular y/o en la terapia de reemplazo. La inyección celular requiere una cantidad suficiente de solución en suspensión para permitir que las células entren en el tejido. El volumen de la solución en suspensión afecta al tejido, y esto puede causar una lesión invasiva importante como resultado de la inyección celular. Este artículo informa sobre un nuevo método de inyección celular, llamado inyección lenta, que tiene como objetivo evitar esta lesión. Sin embargo, empujar las células desde la punta de la aguja requiere una velocidad de inyección suficientemente alta de acuerdo con la ley de fuerza de cizallamiento de Newton. Para resolver la contradicción anterior, en este trabajo se utilizó un fluido no newtoniano, como una solución de gelatina, como solución de suspensión celular. La solución de gelatina es sensible a la temperatura, ya que su forma cambia de gel a sol a aproximadamente 20 °C. Por lo tanto, para mantener la solución de suspensión celular en forma de gel, la jeringa se mantuvo enfriada en este protocolo; Sin embargo, una vez que la solución se inyectó en el cuerpo, la temperatura corporal la convirtió en un sol. El flujo de líquido tisular intersticial puede absorber el exceso de solución. En este trabajo, la técnica de inyección lenta permitió que las bolas de cardiomiocitos entraran en el miocardio del huésped y se injertaran sin fibrosis circundante. Este estudio empleó un método de inyección lenta para inyectar cardiomiocitos de ratas neonatales purificados y en forma de bola en un área remota de infarto de miocardio en el corazón de la rata adulta. A los 2 meses después de la inyección, los corazones de los grupos trasplantados mostraron una mejora significativa de la función contráctil. Además, los análisis histológicos de los corazones inyectados lentamente revelaron conexiones perfectas entre el huésped y los cardiomiocitos del injerto a través de discos intercalados que contenían conexiones de unión de brecha. Este método podría contribuir a las terapias celulares de próxima generación, particularmente en medicina regenerativa cardíaca.

Efectos de la inyección lenta sobre la supervivencia celular y la deposición de colágeno Se inyectaron bolas de cardiomiocitos de rata neonatal marcadas con PKH26 en miocardio de rata desnuda normal utilizando un método de inyección normal o lento. Los resultados mostraron que el método de inyección lenta aumentó significativamente el volumen celular injertado (Figura 3A) y disminuyó significativamente la deposición de colágeno tipo I en el sitio (Figura 3B).
Efectos de la inyección lenta sobre la eficacia del tratamiento en un modelo de infarto de rata Se utilizó el método de inyección lenta guiada por ecocardiógrafo para inyectar bolas de cardiomiocitos de rata neonata o PBS(−) en los corazones infartados de ratas modelo. El grupo al que se le inyectaron células por sí solo mostró una mejoría significativa en la función de contracción cardíaca después de 2 meses (Figura 4A). Los análisis inmunohistoquímicos revelaron una conexión perfecta entre las células injertadas y los miocitos del huésped a través de discos intercalados que contienen uniones gap (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de todo el sistema de inyección. (A) Aparato principal de inyección. (B) Sistema de enfriamiento de la jeringa de inyección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig02.jpg"> Figura 2: Inyección lenta percutánea guiada por ecocardiografía . (A) Ajuste del animal, la sonda de eco y el aparato de inyección. (B) Vista ecocardiográfica de la jeringa inyectante y del corazón. Tenga en cuenta que las imágenes de la izquierda y la derecha son las mismas, pero se ha agregado una línea amarilla para indicar la posición de la aguja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig03.jpg"> Figura 3: Efecto del método de inyección lenta sobre el volumen celular injertado y la deposición de colágeno. (A) Los volúmenes celulares injertados (N = 3) se calcularon a partir de secciones seriadas. Las barras de error indican desviaciones estándar. *P &lt; 0,01 en una prueba t no apareada. (B) Tinción inmunohistoquímica para colágeno tipo I. La barra de escala indica 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig04.jpg"> Figura 4: Mejoras en la función cardíaca y en la integración histológica con bolas de cardiomiocitos injertadas por el método de inyección lenta . (A) Vistas representativas del modo M del ecocardiógrafo. El gráfico muestra la transición de los acortamientos de fracciones en el grupo trasplantado con bola de cardiomiocitos (línea roja continua; N = 4) y el grupo de vehículos (solución de suspensión celular para el método de inyección lenta) (línea azul punteada; N = 3). Abreviaturas: IM = infarto de miocardio; Cx43 = conexina 43; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; PKH26 = etiqueta de membrana de células fluorescentes rojas. Las barras de error indican las desviaciones estándar. *P &lt; 0,01 en una prueba t pareada. (B) Análisis inmunohistoquímicos de la relación entre las bolas de cardiomiocitos injertadas y los cardiomiocitos del huésped. Las observaciones microscópicas láser convencionales utilizando una lente de objetivo 2x se muestran en la columna de la izquierda. A continuación se presentan las versiones ampliadas (con una lente de objetivo de 20x) de dos áreas que se muestran en el cuadro, etiquetadas con * y #. Barras de escala: imagen superior = 300 μm; * y # = 30 μm. Se muestran imágenes microscópicas láser confocales con una lente de objetivo de 20x para comparar. Se muestran tres posiciones. En las imágenes fusionadas, las puntas de flecha indican la existencia de uniones gap (Cx43) que conectan directamente el injerto y los cardiomiocitos del huésped. La barra de escala indica 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Video complementario 1: Método de inyección lenta ecoguiada. El ecocardiograma en modo B en la vista frontal muestra la punta de la aguja de inyección avanzada hacia el miocardio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/Supplementary%20video.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este método elimina cualquier invasión importante durante las inyecciones celulares causada por la solución de suspensión celular.

Un nuevo método de inyección celular con una invasión mínima

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...

En este trabajo, el propósito es mejorar la eficacia de los medicamentos regenerativos, especialmente la medicina regenerativa cardíaca utilizando células madre pluripotentes inducidas. La medicina regenerativa del corazón es nuestro campo de investigación con mayor contribución. Mis hallazgos significativos incluyen una selección metabólica de cardiomiocitos, es decir,Una forma de masa de purificación simple y masiva para cardiomiocitos con condición de cultivo de glucosa extraída y lactato agregado. Otro hallazgo incluye el método eficiente de injerto para cardiomiocitos mediante la publicación de polos de cardiomiocitos. Este método de trasplante con polos de cardiomiocitos confirmó el aumento de los injertos de polos de cardiomiocitos.Sin embargo, se encontró la falta de interacción directa entre el huésped y los cardiomiocitos del injerto. Esta técnica ofrece menos invasiones a los tejidos que reciben las inyecciones celulares. Como resultado de esto, se facilitó la interacción directa entre el huésped y los cardiomiocitos del injerto.Esta tecnología puede disminuir las lesiones, las respuestas inflamatorias y, finalmente, la fibrosis, es decir, la formación de cicatrices. Con suerte, esta tecnología se aplicará a la próxima generación de medicamentos regenerativos, incluida la medicina regenerativa del corazón que utiliza células madre pluripotentes.Ya hemos encontrado varias formas de aportar un mérito significativo a la medicina regenerativa del corazón. Estos estudios continuarán en el futuro.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Inyección directa intranucleares de cDNA es una técnica eficaz para la transfección las células post-mitóticas. Este método proporciona altos niveles de expresión de proteínas heterólogas de construcciones de ADNc únicos o múltiples y permite la función de proteínas a estudiar en un ambiente fisiológicamente relevantes con una variedad de ensayos de células individuales.

La microinyección de ADN en intranucleares disociada neuronas de mamíferos adultos

Usando la punta fina micropipetas se inyecta el plásmido de ADN en subdominios de somitas pollo o tubos neurales. La concentración del plásmido se ajusta a generar solo las células transfectadas. A continuación, permitir que las células se desarrollan en poblaciones clonales.

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Debido a su gran tamaño y organización relativamente simple, las células nodriza de Drosophila son ideales para estudios de imágenes de células vivas. Este video describe un método de microinyección para la administración de compuestos exógenos en las células, y el protocolo presentado demuestra el procedimiento con sondas de oligonucleótidos fluorescentes llamadas balizas moleculares (MB) que se utilizan para visualizar transcripciones endógenas de ARNm.

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Este video muestra el procedimiento de inyectar células cancerosas por vía intravenosa en la vasculatura de la membrana corioalantoidea del pollo para generar un modelo de metástasis de cáncer CAM. Las células inyectadas eventualmente forman colonias dispersas de células cancerosas individuales, lo que permite el estudio de la invasión del cáncer y la metástasis.

Inyección intravenosa de células cancerosas en la vasculatura de la membrana corioalantoidea de pollo: un procedimiento para establecer un modelo de cáncer de membrana corioalantoidea para estudiar la invasión y metástasis del cáncer

Se describe aquí cómo realizar una microinyección de una sola célula de Lucifer amarillo para visualizar la comunicación celular a través de las uniones gap-en las células vivas, y proporcionar algunos consejos útiles. Esperamos que este documento ayudará a cada uno para evaluar el grado de acoplamiento celular debido a uniones gap funcionales. Todo lo descrito aquí podría ser, en principio, adaptado a otros colorantes fluorescentes con peso molecular inferior a 1.000 Daltons.

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