Name: Un modelo de infección por Candida albicans en una articulación periprotésica en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Aprende a construir un modelo de infección articular periprotésica por Candida albicans en ratones usando alambre de titanio-níquel. Este método facilita el estudio de prevención y tratamiento de infecciones fúngicas en implantes.

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Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shaanxi (número de subvención 2021SF-118) y de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 81973409, 82204631).

Los animales fueron comprados a la Universidad Jiaotong de Xi'an. Todos los procedimientos de experimentación con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal de la Universidad Xi'an Jiaotong (número de aprobación: SCXK [Shaanxi] 2021-103). Los ratones se mantuvieron durante una semana con 5 ratones por jaula. Se les permitió el libre acceso a alimentos y agua. Los animales se mantuvieron a temperatura ambiente (RT; 24 °C ± 1 °C) y ciclo luz/oscuridad (12 h/12 h) antes de realizar el estudio.
1. Preparación del tampón y del equipo
<ol><li>Cultivo celular de C. albicans <ol><li>Inocular una colonia monoclonal de C. albicans (SC5314) a partir de un medio placa de peptona dextrosa (YPD) de extracto de levadura con un asa de inoculación en 5 ml de medio líquido YPD (YPD + 50 μg/mL de carbenicilina).</li>
		<li>A continuación, agite las células de C. albicans a una velocidad de 220 rpm a 30 °C durante la noche.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión a 400 x g durante 5 min a RT. Resuspender las células de C. albicans en solución salina normal y diluir la concentración de células a 1 x 106 células/mL ajustando visualmente la turbidez para que sea la misma que la de un McFarland de 0,5.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de solución salina normal<ol><li>Pesar 0,9 g de cloruro de sodio y disolver en 100 mL de agua desionizada para preparar solución salina normal al 0,9%.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de instrumentos quirúrgicos<ol><li>Autoclave (121 °C, 30 min) el instrumental quirúrgico (tijeras, pinzas, pinzas hemostáticas, portaagujas, agujas de sutura) y alambre de aleación de titanio-níquel (aproximadamente 0,5 mm de diámetro) antes de su uso.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Establecimiento del modelo PJI de ratón
<ol><li>Divida aleatoriamente 30 ratones C57BL/6 (machos, 15-20 g) en 3 grupos (10 ratones/grupo), a saber, grupo de control, grupo de implante en blanco (implantación de alambre de titanio-níquel sin infección por C. albicans ) y grupo PJI (implante de alambre de titanio-níquel con infección por C. albicans ).</li>
	<li>Anestesiar a los ratones con inhalación de isoflurano al 1-4% antes de quitar el pelo de la extremidad posterior izquierda y desinfectarlo con yodo. La pérdida del reflejo de enderezamiento y la falta de respuesta a la estimulación del dedo del pie confirman la profundidad de la anestesia. Mientras anestesia, aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir la sequedad de la córnea y para reponer el calor durante la cirugía y la recuperación.</li>
	<li>En el caso de los ratones del grupo de control, no proporcione ningún tratamiento. Bríndeles acceso gratuito a agua y alimentos.</li>
	<li>Para los ratones en el grupo de implantes en blanco y el grupo de PJI, haga una incisión longitudinal de 5 mm en la rodilla de cada extremidad posterior izquierda con una cuchilla # 10 o una navaja de afeitar estéril para exponer las articulaciones.</li>
	<li>Realice un orificio de 5 mm de longitud en el canal intramedular femoral insertando una aguja de jeringa estéril (26 G).</li>
	<li>Inserte un alambre liso de aleación de níquel-titanio (0,5 mm de diámetro, 5 mm de longitud) en el orificio antes de cortarlo con unas tijeras (Figura 1).</li>
	<li>Para los ratones en el grupo de implantes en blanco, agregue 2 μL de medio YPD a lo largo del alambre de aleación de níquel-titanio gota a gota antes de cerrar la herida capa por capa con una sutura de nailon (0,15 mm de diámetro).</li>
	<li>En el caso de los ratones del grupo PJI, inocular 2 μL de células de C. albicans (1 × 106 células/mL) en el espacio articular de los ratones a lo largo del alambre de aleación de níquel-titanio gota a gota antes de cerrar la herida capa por capa con una sutura de nylon.</li>
	<li>Aloja a los ratones con libre acceso a agua y comida durante 14 días. Administrar meloxicam por inyección subcutánea (4 mg/kg) cada 24 h durante un máximo de 3 días.</li>
	<li>Después de 14 días, anestesiar a los ratones con isoflurano al 3% antes de sacrificar a los ratones por luxación cervical.</li>
</ol>3. Evaluación del modelo PJI
<ol><li>Evaluación de infecciones en órganos principales<ol><li>Recolectar los riñones, el hígado y el bazo de los ratones después de la eutanasia.</li>
		<li>Añadir 500 μL de suero fisiológico normal estéril en cada órgano y triturar los tejidos en un homogeneizador a 4 °C.</li>
		<li>Añadir 100 μL del homogeneizado preparado en el paso 3.1.2 a una placa YPD antes de extenderlo uniformemente con una varilla doblada.</li>
		<li>Coloque las placas YPD invertidas en una incubadora a 37 °C durante 48 h.</li>
		<li>Observa y cuenta visualmente el número de colonias.</li>
	</ol></li>
	<li>Observación de C. albicans y biofilms en los implantes<ol><li>Cortar cuidadosamente la piel sobre la articulación de los ratones con unas tijeras antes de recoger el implante con unas pinzas.</li>
		<li>Mantener los implantes sumergidos en una solución de glutaraldehído al 2,5% para su fijación a 4 °C durante 48 h.</li>
		<li>Enjuague los implantes con PBS estéril tres veces antes de sumergirlos en una solución de ácido de osmio al 1% durante 3 h.</li>
		<li>Enjuague los implantes con PBS estéril tres veces antes de sumergirlos en soluciones de etanol al 50%, 70%, 80%, 90% y 100% durante 15 minutos para la deshidratación.</li>
		<li>Mantenga los implantes sumergidos en terc-butanol durante 30 minutos tres veces antes de liofilizar los implantes.</li>
		<li>Fije las muestras de implante a la etapa de muestra, recubra el implante con oro (recubrimiento de 10 nm) y obsérvelo bajo un microscopio electrónico de barrido (SEM) a alto vacío y 1,5 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis anatomopatológico de los tejidos del fémur<ol><li>Recoja los tejidos femorales con unas tijeras después de la eutanasia de los ratones.</li>
		<li>Sumergir los tejidos del fémur en una solución de paraformaldehído al 4% para su fijación a 4 °C durante 48 h.</li>
		<li>Coloque los tejidos del fémur en formol al 10% durante 1 semana.</li>
		<li>Deshidratar los tejidos del fémur sumergiéndolos en soluciones de etanol al 50%, 70%, 80%, 90% y 100% durante 15 min, respectivamente.</li>
		<li>Incrustar los tejidos deshidratados del fémur en parafina antes de seccionar los tejidos en muestras de 4 μm utilizando un micrótomo.</li>
		<li>Tinturar las secciones del fémur con hematoxilina y eosina siguiendo un protocolo estándar antes del análisis anatomopatológico21.</li>
	</ol></li>
</ol>

Establecimiento de un modelo de ratón para la PJI relacionada con la biopelícula de Candida albicans

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.

La infección causada por la contaminación de los instrumentos quirúrgicos o del ambiente quirúrgico durante la cirugía es la principal causa de la mayoría de las infecciones por implantes 24,25,26,27. Por lo tanto, en este estudio se construyó un modelo de PJI relacionado con la biopelícula de C. albicans de ratón. En comparación con el modelo tradicional de PJI en el que se utilizaron partículas estériles de acero inoxidable suspendidas en solución salina como implante, en este estudio se utilizó un alambre de aleación de níquel-titanio, un material de implante de uso común, para simular el contacto entre C. albicans, los materiales del implante y el hueso, que es más similar a la situación en las clínicas.
El modelo de PJI descrito en este artículo puede simular perfectamente el entorno fisiológico de PJI en clínicas. Este modelo solo se puede utilizar para estudiar la infección durante la implantación en lugar de la infección posterior transmitida por la sangre.
C. albicans se puede inocular de dos maneras. Uno es inocular directamente los implantes de C. albicans en el sitio del implante durante la cirugía28, y el otro es cultivar los implantes con C. albicans durante un período de tiempo para que se formen biopelículas maduras en la superficie del implante antes de la implantación quirúrgica29. En este estudio se eligió el primer método debido a su número exacto de inoculación de patógenos, lo que resultó en diferencias mínimas entre los grupos y una evaluación más objetiva de los tratamientos posteriores. Además, el primer método es más coherente con la situación clínica.
En este protocolo, la inserción del implante es difícil de realizar. El operador tiene que practicar varias veces para asegurarse de que el implante se inserta en la articulación en lugar de por vía subcutánea o intramuscular. Además, el número de inoculación de C. albicans es vital para la repetibilidad del modelo PJI. C. albicans debe mezclarse completamente a través de un vórtice para garantizar la precisión del número de inoculación. Además, se deben agregar los C. albicans a lo largo del alambre de aleación para simular la ruta de infección en la situación clínica.
Las biopelículas pudieron detectarse 7 días después de la infección bacteriana, después de lo cual las biopelículas aumentaron gradualmente y alcanzaron una mesetael día 1430. Por lo tanto, el éxito del modelo PJI establecido fue inspeccionado el día 14. La colonización de C. albicans y la formación de biofilm en la superficie del implante fueron inspeccionadas por SEM. Las lesiones tisulares alrededor del implante causadas por infección local se evaluaron mediante análisis anatomopatológico después de la tinción de H&E. Los estudios han demostrado que la osteólisis periprotésica es una característica importante debido a la PJI31. Por lo tanto, estos indicadores también son vitales en la evaluación de los métodos terapéuticos para la prevención y el tratamiento de la ICP32.
El cultivo microbiano se usa comúnmente para detectar infecciones microbianas en clínicas y laboratorios. Por lo tanto, en este estudio, se realizó el cultivo microbiano del implante, los tejidos alrededor de los implantes, el hígado y otros órganos vitales. Para el implante, se aplicó ultrasonidos para eliminar los C. albicans adheridos a la superficie del alambre de aleación de titanio-níquel. A continuación, los C. albicans se enriquecieron mediante centrifugación antes del cultivo microbiano. Sin embargo, se encontró un resultado negativo, inconsistente con el resultado del SEM (Figura 2). El resultado del SEM mostró que C. albicans se adhirió a la superficie del alambre de aleación de titanio-níquel. Por lo tanto, el resultado del cultivo microbiano fue un falso negativo, que puede atribuirse a la estrecha adhesión de C. albicans al alambre de aleación de titanio-níquel; El ultrasonido no pudo exfoliar con éxito el C. albicans del implante. Del mismo modo, el cultivo microbiano de los tejidos alrededor de los implantes y órganos vitales también fue negativo. Hay dos razones posibles: (1) El número de C. albicans inoculadas en este estudio fue de solo 2000 UFC, que puede ser demasiado pequeño para invadir el tejido circundante y el sistema durante el período experimental; (2) La sensibilidad del método para extraer y separar patógenos de los tejidos es baja. Un informe publicado anteriormente sugiere que el cultivo microbiano podría mostrar fácilmente resultados falsos negativos y retrasar los tratamientos33. La tinción de Grocott-Gomori se puede utilizar para determinar la formación de hifas en el hueso y la articulación32. También puede ser útil aumentar la cantidad de inóculo, prolongar la duración experimental o mantener a los ratones en un estado inmunodeprimido antes de la cirugía32. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la infección prolongada puede conducir a una infección profunda o incluso a una infección sistémica. Por lo tanto, el período experimental debe diseñarse de acuerdo con el propósito específico.
En resumen, este estudio creó un modelo de ratón exitoso de PJI asociado a la biopelícula de C. albicans , que puede ser de gran importancia para la investigación de la prevención y el tratamiento de la PIJ asociada a la biopelícula de C. albicans .

Candida albicans (C. albicans) reside comensalmente en muchas partes del cuerpo humano1, que también es el patógeno oportunista más común que causa infecciones fúngicas invasivas potencialmente mortales, especialmente en pacientes inmunocomprometidos 2,3. C. albicans puede transformarse entre los estados de levadura y micelio como un hongo polimórfico. El estado de micelio exhibe mayor virulencia, mayor adhesión e invasión de células y tejidos 4,5. Además, C. albicans puede formar biopelículas en las superficies de materiales biomédicos como dentaduras postizas, catéteres y stents 1,6,7. La densa estructura tridimensional de las biopelículas restringe la infiltración de fármacos antifúngicos, expresa genes resistentes a los fármacos y regula a la baja el metabolismo de las células fúngicas para resistir la eliminación del sistema inmunitario 6,7. Por lo tanto, las infecciones relacionadas con biopelículas son bastante desafiantes en las clínicas8.
Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulasa negativo y enterobacter son los principales patógenos causantes de la PJI9. Aunque la incidencia de la ICP fúngica es relativamente baja (alrededor del 1%)10, el costo del tratamiento de la ICP fúngica es mayor11, el ciclo de tratamiento es más largo11 y la tasa de éxito del tratamiento es menor10 que la ICP bacteriana. En los últimos años, la incidencia de PJI fúngica ha ido aumentando año tras año10. La PJI de Candida representa el 77%-84% de la PJIfúngica 10,12, y C. albicans es la más común en Candida (54%). Por lo tanto, es necesario estudiar la PJI fúngica.
Actualmente, la PJI se trata mediante cirugía de revisión mediante (1) la extracción del implante infectado, (2) el desbridamiento, (3) el tratamiento antimicrobiano y (4) el reimplante. Después de un desbridamiento completo, se coloca un antibiótico que contiene cemento óseo y el paciente es tratado con antibióticos sistémicamente durante más de 6 semanas para controlar eficazmente la infección antes de que se coloque un nuevo implante13. Sin embargo, este método no puede eliminar completamente los patógenos en los tejidos, y es muy probable que se desarrollen infecciones recurrentes tratadas con terapia antimicrobiana a largo plazo en cepas resistentes a los medicamentos 14,15,16.
El establecimiento de modelos animales de PJI es importante para la investigación y el desarrollo de nuevos fármacos o terapias para la PJI. En el desarrollo de la ICP, se forman grandes espacios muertos alrededor de la prótesis, lo que lleva a la formación de hematomas, que bloquean aún más el suministro de sangre a los tejidos circundantes y perjudican el efecto de los antibióticos11,15. Debido a la dificultad de imitar el entorno circundante de la prótesis, los modelos animales tradicionales no pueden simular con precisión la situación real de la PJI17,18.
En este trabajo, se construyó un modelo de PJI asociado a la biopelícula de C. albicans en ratones mediante el uso de un alambre de titanio-níquel clínicamente ampliamente utilizado para simular implantes articulares19,20. Este modelo PJI exhibe las ventajas de fácil operación, alta tasa de éxito, alta repetibilidad y alta correlación clínica. Se espera que sea un modelo importante para el estudio de la prevención y el tratamiento de la PJI relacionada con la biopelícula de C. albicans.

<table><tbody><tr><td>0.5 Mactutrius turbidibris</td><td>Shanghai Lujing Technology Co., Ltd</td><td>5106063</td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C refrigerador</td><td>Electrolux (China) Electric Co., Ltd</td><td>ESE6539TA</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd</td><td>01-023</td><td></td></tr><tr><td>Balanzas analíticas</td><td>Shimadzu</td><td>ATX124</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaves Esterilizador</td><td>SANYO</td><td>MLS-3750</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Amresco</td><td>C0885</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ci Nikon Microscopio óptico vertical&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS2-FL</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Macklin&nbsp;</td><td></td><td></td>D823520</tr><tr><td>Anillo de inoculación</td><td>Thermo Scientific</td><td>251586</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD 20210103</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Xi'an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>20180108</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0099</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd</td><td>01-001</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia multicanal para animales pequeños RWD R550&nbsp;</td><td>RWD</td><td>R550</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>Hitachi</td><td>TM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura</td><td>Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd</td><td>ZQTY-50N</td><td></td></tr><tr><td>Generador de agua de agua ultrapura</td><td>Heal Force</td><td>NW20VF</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de ultrasonido</td><td>Do-Chrom</td><td>DS10260D</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Thermo Scientific&nbsp; Oxoid</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de infección por candida albicans en una articulación periprotésica en ratones

A Periprosthetic Joint Candida albicans Infection Model in Mouse

La infección articular periprotésica (PJI) es una de las infecciones comunes causadas por Candida albicans (C. albicans), que preocupa cada vez más a cirujanos y científicos. Por lo general, en el sitio de la infección se forman biopelículas que pueden proteger a C. albicans de los antibióticos y la eliminación inmunitaria. La cirugía que implica la extracción del implante infectado, el desbridamiento, el tratamiento antimicrobiano y el reimplante es el estándar de oro para el tratamiento de la PJI. Por lo tanto, el establecimiento de modelos animales de PJI es de gran importancia para la investigación y el desarrollo de nuevos fármacos o terapias para la PJI. En este estudio, se insertó un alambre liso de aleación de níquel-titanio, un implante ampliamente utilizado en clínicas ortopédicas, en la articulación femoral de un ratón C57BL/6 antes de que C. albicans fuera inoculado en la cavidad articular a lo largo del alambre. Después de 14 días, se observaron biopelículas maduras y gruesas en la superficie de los implantes bajo un microscopio electrónico de barrido (SEM). Se encontró una trabécula ósea significativamente reducida en la tinción de H&E de las muestras articulares infectadas. En resumen, se estableció un modelo de PJI de ratón con las ventajas de fácil operación, alta tasa de éxito, alta repetibilidad y alta correlación clínica. Se espera que este sea un modelo importante para los estudios clínicos de la prevención de la PJI relacionada con la biopelícula de C. albicans.

La transferencia de las muestras a un medio en placa y el conteo de las colonias después de la incubación durante la noche se utiliza comúnmente para evaluar la carga patógena local cerca de la lesión22,23. En nuestro estudio, el cultivo microbiano de muestras de hígado, riñón y bazo fue negativo, lo que indica que el modelo de este estudio solo condujo a una infección local en lugar de una infección sistémica en los ratones23.
Las imágenes SEM de los implantes se muestran en la Figura 2. Ningún C. albicans se adhirió o colonizó en la superficie del alambre de aleación de níquel-titanio en el grupo de implantes en blanco. Sin embargo, se observó una biopelícula madura y gruesa en la superficie del alambre de aleación de níquel-titanio en el grupo PJI, lo que indica la construcción exitosa del modelo PJI relacionado con la biopelícula de C. albicans en ratones 14 días después de la cirugía23.
La tinción H&amp;E de los tejidos femorales se muestra en la Figura 3. Se observó una estructura trabecular ósea clara y completa en el grupo control, mientras que en el grupo de implantes en blanco se observaron algunos defectos del tejido trabecular óseo en los tejidos femorales (Figura 3, flechas amarillas). En el grupo PJI, el número de trabéculas óseas disminuyó significativamente23. Estos resultados indican que el modelo de PJI asociado a la biopelícula de C. albicans en ratones se estableció con éxito con una lesión patológica significativa del tejido del fémur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65263/65263fig01.jpg"> Figura 1: Procedimiento de implantación. El cuadrado rojo en el panel izquierdo muestra el sitio quirúrgico donde se inserta el alambre liso de aleación de níquel-titanio. El panel de la derecha muestra una porción de fémur (círculo rojo) con el alambre de níquel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65263/65263fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65263/65263fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes SEM de la superficie del implante en los grupos en blanco y PJI. Los aumentos 1000x (barra de escala = 500 μm) y 5000x (barra de escala = 100 μm) se muestran como imágenes representativas. Esta figura ha sido modificada con permiso de Mo et al.23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65263/65263fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65263/65263fig03.jpg"> Figura 3: Tinción de H&amp;E del tejido femoral. En la figura se muestran imágenes representativas de H&amp;E del implante, el modelo PJI y los grupos de control. El grupo control muestra una estructura trabecular ósea clara y completa. El grupo de implantes en blanco mostró algunos defectos de tejido trabecular óseo en los tejidos femorales (flechas amarillas). Sin embargo, el número de trabéculas óseas disminuyó en el grupo de PJI. Los aumentos mostrados son 200x (barra de escala = 150 μm) y 400x (barra de escala = 75 μm). Esta figura ha sido modificada con permiso de Mo et al.23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65263/65263fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La infección de la articulación periprotésica (PJI) causada por patógenos peligrosos es común en la ortopedia clínica. Los modelos animales existentes no pueden simular con precisión la situación real de la PJI. Aquí, establecimos un modelo de ratón PJI asociado a la biopelícula de Candida albicans para investigar y desarrollar nuevas terapias para la PJI.

Un modelo de infección por Candida albicans en una articulación periprotésica en ratones

Periprosthetic joint infection (PJI) is one of the common infections caused by Candida albicans (C. albicans), which increasingly concerns surgeons and ...

En este estudio de la articulación periprotésica asociada a la biopelícula de Candida albicans, se construyó un modelo de infección por Candida albicans en ratones, utilizando alambre de titanio-níquel, comúnmente utilizado para simular implantes articulares. Este modelo de PJI es fácil de operar, tiene una alta tasa de éxito y es clínicamente relevante. Ayudará a comprender la prevención y el tratamiento de la PJI relacionada con la biopelícula de Candida albicans.Los modelos animales tradicionales no pueden simular con precisión la situación real de la PJI, debido al complejo entorno que rodea a los procesos. El modelo PJI de ratón relacionado con la biopelícula de Candida albicans puede abordar la brecha de investigación. El establecimiento del modelo animal de PJI es muy importante para la investigación y el desarrollo de nuevos fármacos o terapias para PJI.Se espera que el modelo de PJI de ratón asociado a la biopelícula de Candida albicans establecido en este artículo sea un modelo importante para la prevención y el tratamiento de la PJI asociada a la biopelícula de Candida albicans.

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