Name: Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprende el aislamiento semiautomatizado de la fracción vascular estromal de tejido adiposo blanco murino mediante un disociador tisular. Este protocolo mejora la reproducibilidad para la diferenciación de adipocitos en investigación metabólica.

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Los autores desean agradecer a Takahito Wada y Saiko Yoshida (Universidad de Tokio, Tokio, Japón) por su asistencia experimental. Este trabajo fue financiado por las siguientes subvenciones a Y.H.: beca de investigación del Programa de Jóvenes Investigadores Excelentes de la Universidad de Tokio; Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, número de subvención 19K17976; subvención para el Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) de la Fundación Japonesa de Enzimología Aplicada, número de subvención 17F005; beca de la Fundación de Investigación Farmacológica; beca de la Fundación Memorial Mochida para la Investigación Médica y Farmacéutica; beca de la Fundación MSD Life Science; subvención de la Daiwa Securities Health Foundation; subvención de la Fundación de Investigación Bioquímica de Tokio; Beca de Investigación en Ciencias de la Vida de la Fundación Takeda Science; y subvención de la Fundación de Investigación Médica SENSHIN.

Todos los experimentos con animales descritos en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Tokio y realizados de acuerdo con las directrices institucionales de la Universidad de Tokio.
1. Preparación de la solución enzimática y el medio
<ol><li>Coloque ambos lados del tejido adiposo blanco inguinal (lado derecho e izquierdo, aproximadamente 150 mg) de un ratón de 7-8 semanas de edad y 2,5 ml de solución enzimática en el tubo C del disociador.</li>
	<li>Reconstituir la enzima D con 3 ml de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 sin suero bovino fetal (FBS) ni antibióticos, enzima R con 2,7 ml de DMEM/F12 sin FBS ni antibióticos, y enzima A con 1 ml de tampón A.</li>
	<li>Prepare 2,5 ml de solución enzimática añadiendo 100 μL de enzima D, 50 μL de enzima R, 12,5 μL de enzima A y 2,35 ml de DMEM/F12 sin FBS ni antibióticos en el tubo C. Coloque el tubo C con solución enzimática en hielo.</li>
</ol>2. Aislamiento del tejido adiposo
<ol><li>Eutanasia de ratones machos C57BL/6J de 7-8 semanas de edad (aproximadamente 20 g) por luxación cervical.</li>
	<li>En un banco limpio, para aislar el tejido adiposo blanco inguinal, corte la piel con tijeras romas / afiladas en el abdomen y hacia las extremidades inferiores. Aísle el tejido adiposo del interior de los muslos con tijeras afiladas/afiladas. Un lado del tejido adiposo inguinal wieghs ~ 75 mg.</li>
	<li>Coloque el tejido adiposo aislado en el tubo C con solución enzimática en hielo y mantenga el tubo dentro del banco limpio para mantener la esterilidad.</li>
</ol>3. Picada y digestión del tejido adiposo
<ol><li>En el banco limpio, agregue 2,5 ml de solución enzimática al tubo C.</li>
	<li>Picar el tejido adiposo en trozos pequeños cortando con tijeras afiladas / afiladas 50 veces. Cortar el tejido adiposo en ~2 mm2 pedazos.</li>
	<li>Cierre herméticamente la tapa del tubo C, gire el tubo boca abajo y conéctelo al manguito del disociador de tejido con la tapa puesta. Luego, digiera la muestra durante ~ 40 min a 37 ° C. NOTA: Este estudio utilizó gentleMACS Octo Disociator with Heaters (Miltenyi Biotec 130-096-427), y se siguió el programa preinstalado "37C_mr_ATDK_1".</li>
</ol>4. Filtración de la suspensión celular
<ol><li>Precalentamiento DMEM/F12 que contiene 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina a 37 °C.</li>
	<li>Separe el tubo C del disociador de tejido y detenga la digestión agregando 5 ml de DMEM / F12 que contiene 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y pipeteando suavemente cuatro veces.</li>
	<li>Centrifugar a 700 x g durante 10 min a 20 °C.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet celular.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet agregando 10 ml de DMEM / F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y pipeteando suavemente cinco veces.</li>
	<li>Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm de diámetro colocado en un tubo nuevo de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugar a 250 x g durante 5 min y resuspender el pellet en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
</ol>5. Recubrimiento celular
<ol><li>Centrifugar a 500 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet agregando 10 ml de DMEM / F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y pipeteando diez veces.</li>
	<li>Colocar la suspensión celular en una placa recubierta de colágeno de 10 cm y colocar las placas en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5%CO2) durante 1-2 h. NOTA: Los platos recubiertos de colágeno no son absolutamente necesarios. Sin embargo, según la experiencia, los platos recubiertos de colágeno ayudan a la adherencia de los preadipocitos y, por lo tanto, aumentan la supervivencia de las células.</li>
	<li>Aspirar el medio y lavar las células dos veces con 3 ml de PBS por lavado.</li>
	<li>Añadir 10 ml de DMEM/F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y devolver los platos a la incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% deCO2).</li>
</ol>6. Transmisión de preadipocitos
<ol><li>Al día siguiente, aspire el medio (las células serán adherentes, y por lo tanto el medio puede ser aspirado), lave las células dos veces con 3 ml de PBS por lavado, y agregue 10 ml de DMEM / F12 que contiene 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Cuando las células alcancen el 80% de confluencia (generalmente 4 días después del aislamiento de SVF), divida las células en cuatro platos recubiertos de colágeno de 10 cm.<ol><li>Específicamente, aspire el medio, lave las células con PBS (temperatura ambiente [RT]), agregue 1 ml de tripsina al 0,05% precalentada e incube durante 5 minutos en la incubadora de cultivo celular.</li>
		<li>Agregue 10 ml de DMEM / F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina para apagar la actividad de la tripsina. Después del pipeteo, centrifugar a 440 x g durante 5 min.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante, resuspender las células añadiendo 40 ml de DMEM/F12 que contiene 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina, y colocar las células en cuatro platos recubiertos de colágeno de 10 cm.</li>
	</ol></li>
	<li>Paso de las células de nuevo cuando alcanzan el 80% de confluencia.</li>
</ol>7. Preparación del retrovirus que expresa el antígeno T grande SV40 para la inmortalización de preadipocitos (opcional)
<ol><li>Al menos 3 días antes de la inmortalización, placa de platino-E (Plat-E) empaquetando células29 a una densidad de 3.0 x 105 células/ml en 2 mL de DMEM con 10% FBS sin antibióticos. Use un hemacitómetro para contar las células.</li>
	<li>Al día siguiente, transfecta 4 μg de pBABE-neo largeTcDNA (agregue el plásmido del gen # 1780) usando Lipofectamine 2000, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Después de 24 h, aspirar el medio y agregar 2 mL de DMEM con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Al día siguiente, cosecha el sobrenadante retroviral. El retrovirus puede utilizarse para la inmortalización inmediatamente o almacenarse a -80 °C.</li>
</ol>8. Inmortalización de preadipocitos con antígeno SV40 T grande (opcional)
<ol><li>Paso y expansión de los preadipocitos dos veces después del aislamiento de SVF.</li>
	<li>Colocar las células en placas de 6 pocillos a una densidad de 0,5-1,0 x 104 células/ml en 2 ml de DMEM/F12 con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Use un hemacitómetro para contar las células.</li>
	<li>Al día siguiente, preparar 250 μL de retrovirus fresco o descongelado que exprese el antígeno T grande SV40 por pocillo de las placas de 6 pocillos. Centrifugar a 440 x g durante 5 min y colocar el sobrenadante en un tubo nuevo.</li>
	<li>Agregue 750 μL de DMEM/F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina y 1 μL de polifereno por 250 μL de sobrenadante retroviral para producir el virus de trabajo.</li>
	<li>Aspirar el medio y añadir 1.000 μL del retrovirus de trabajo a cada pocillo que contenga preadipocitos.</li>
	<li>Añadir 1 ml de DMEM/F12 con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina 4 h después.</li>
	<li>Al día siguiente, separe los preadipocitos infectados en un plato de 10 cm y seleccione las células infectadas con DMEM / F12 que contiene 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y 500 μg / ml de neomicina. Para controlar la selección de antibióticos, prepare un plato de células no infectadas con neomicina.</li>
	<li>Continúe pasando las células infectadas con neomicina hasta que todas las células no infectadas en la placa del monitor estén muertas.</li>
</ol>9. Diferenciación de adipocitos
<ol><li>Placar las células. Para placas de 12 pocillos, placar las células a una densidad de 4.0 x 104 células/ml en 1 ml de DMEM/F12 que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Cuando los preadipocitos se vuelvan confluentes (48-72 h después de la placa), aspirar el medio y reemplazarlo con medio de diferenciación (ver Tabla 1 para la composición).</li>
	<li>En el día 2 de la diferenciación (es decir, 48 h después de inducir la diferenciación), reemplace el medio con medio de mantenimiento (ver Tabla 1 para la composición). Después, cambie el medio de mantenimiento cada 2 días. La diferenciación terminal se logra en el día 7 de diferenciación.</li>
	<li>Tinción de rojo aceite<ol><li>Para la tinción de rojo aceite, aspirar el medio y enjuagar las células con 1 mL de PBS por pocillo. Fijar las células añadiendo 1 ml de formaldehído al 4% por pocillo e incubar las células durante 15 min en RT.</li>
		<li>Durante la incubación, diluir la solución madre de aceite rojo o al 0,5% (en alcohol isopropílico) al 0,3% conddH2Oy filtrar la solución de trabajo con papel de filtro.</li>
		<li>Después de los 15 minutos de incubación, retire el formaldehído, enjuague las células con alcohol isopropílico al 60%, agregue 1 ml de aceite filtrado rojo o solución de trabajo e incube durante 1 h en RT.</li>
		<li>Después de la incubación, lave las células con agua corriente. Luego, observe los adipocitos cargados de lípidos bajo un microscopio invertido (aumento: objetivo 20x y ocular 10x).</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de expresión de ARNm NOTA: Consulte la Tabla 2 para obtener la lista de cebadores utilizados en este estudio.<ol><li>Aspirar el medio y añadir 1 mL/pocillo de trizol al pocillo.</li>
		<li>Incubar durante 15 minutos en RT, separar las células por pipeteo y recoger las muestras en tubos de 1,5 ml. Las muestras pueden almacenarse a -80 °C hasta la extracción del ARN.</li>
		<li>Descongele la muestra congelada a RT, agregue 200 μL de cloroformo a la muestra y agite vigorosamente durante 15 s.</li>
		<li>Incubar la muestra a RT durante 3 min y luego girar a 20.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Retire con cuidado la fase acuosa (superior, incolora) y transfiérala a tubos nuevos. Nunca transfiera la fase proteica (media, blanca) o la fase fenol/cloroformo (inferior, rosa).</li>
		<li>Agregue lentamente un volumen igual de 70% de EtOH y mezcle suavemente. No vorágice.</li>
		<li>Cargue la muestra (hasta 700 μL) en una columna de espín de ARN asentada en un tubo de recolección. Asegúrese de incluir cualquier precipitado que pueda haberse formado.</li>
		<li>Girar a 9.000 x g durante 30 s a 4 °C y, a continuación, desechar el caudal.</li>
		<li>Añadir 700 μL de tampón RW1, girar a 9.000 x g durante 30 s a 4 °C y, a continuación, desechar el flujo.</li>
		<li>Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección y agregue 500 μL de RPE tampón.</li>
		<li>Girar a 9.000 x g durante 30 s a 4 °C y, a continuación, desechar el caudal.</li>
		<li>Añadir 500 μL de RPE tampón, girar a 9.000 x g durante 2 min a 4 °C y, a continuación, desechar el flujo.</li>
		<li>Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección y gire (columnas sin tampón) a 9.000 x g durante 1-2 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección de 1,5 ml y agregue 30 μL de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna.</li>
		<li>Incubar la muestra en RT durante 1-2 min. Luego, girar a 9,000 x g durante 1 minuto a 4 ° C para eluyir el ARN.</li>
		<li>Compruebe la concentración de ARN con un fluoroespectrómetro. NOTA: Se recomienda alinear la concentración aquí.</li>
		<li>Realice la transcripción inversa utilizando ~ 200 ng de plantilla de ARN. Utilice un kit comercial de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR-RT) y siga el protocolo del fabricante. Después de la reacción, diluir el ADNc 20 veces a 200 μL.</li>
		<li>Agregue 2.0 μL de ADNc, 3.0 μL de Power Sybr Green Master Mix, 0.018 μL de cebador directo qPCR de 100 μM, 0.018 μL de cebador inverso qPCR de 100 μM y 0.96 μL de ddH2O a cada pocillo de una placa de 384 pocillos.</li>
		<li>Ejecute una qPCR (etapa de espera: 50 °C durante 2 min y 95 °C durante 2 min; Etapa de PCR: 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min; etapa de curva de fusión: 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min y 95 °C durante 15 s). Utilice el método de curva estándar para la cuantificación.</li>
	</ol></li>
</ol>

Aislamiento semiautomatizado de tejido adiposo blanco murino

<ol><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+expression+of+tumor+necrosis+factor-alpha%3A+direct+role+in+obesity-linked+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance.</a> Science. 259 (5091), 87-91 (1993).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li>
<li>Kajimura, S., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+in+brown+adipose+tissue+biology%3A+Molecular+control+of+brown+fat+development+and+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis.</a> Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+obesity%3A+from+discovery+to+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of obesity: from discovery to biology.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).</li>
<li>Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bigger+picture+of+FTO-the+first+GWAS-identified+obesity+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene.</a> Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).</li>
<li>Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+obesity+variant-exercise+interaction+on+changes+in+body+weight+and+BMI%3A+The+Taiwan+biobank+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+activity+attenuates+the+genetic+predisposition+to+obesity+in+20%2C000+men+and+women+from+EPIC-Norfolk+prospective+population+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study.</a> PLoS Medicine. 7 (8), e1000332(2010).</li>
<li>Claussnitzer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTO+obesity+variant+circuitry+and+adipocyte+browning+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).</li>
<li>Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+adipogenesis+in+fibroblasts+by+PPAR+gamma+2%2C+a+lipid-activated+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor.</a> Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+controls+a+brown+fat%2Fskeletal+muscle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).</li>
<li>Rajakumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBF2+determines+and+maintains+brown+adipocyte+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity.</a> Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).</li>
<li>Shapira, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBF2+transcriptionally+regulates+brown+adipogenesis+via+the+histone+reader+DPF3+and+the+BAF+chromatin+remodeling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex.</a> Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+co-localizes+with+PPAR%CE%B3+and+transcriptionally+controls+the+brown+fat+gene+program%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program.</a> Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+differentially+controls+adipogenic+and+myogenic+gene+program+through+distinct+pathways+to+ensure+brown+and+beige+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation.</a> PLoS Genetics. 16 (9), e1009044(2020).</li>
<li>Hiraike, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIA+determines+the+cis-effect+of+genetic+variation+on+Ucp1+expression+in+murine+thermogenic+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes.</a> iScience. 25 (8), 104729(2022).</li>
<li>Villanueva, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+subtype-selective+recruitment+of+TLE3+or+Prdm16+by+PPAR%CE%B3+specifies+lipid+storage+versus+thermogenic+gene+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).</li>
<li>Pearson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TLE3+promotes+the+mitochondrial+program+in+beige+adipocytes+and+improves+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism.</a> Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).</li>
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<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublines+of+mouse+3T3+cells+that+accumulate+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid.</a> Cell. 1 (3), 113-116 (1974).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+established+preadipose+cell+line+and+its+differentiation+in+culture+II.+Factors+affecting+the+adipose+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion.</a> Cell. 5 (1), 19-27 (1975).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+heritable+changes+leading+to+increased+adipose+conversion+in+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells.</a> Cell. 7 (1), 105-113 (1976).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+preadipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).</li>
<li>Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture%3A+a+simple%2C+reproducible%2C+efficient+and+economic+technique+for+isolation+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+adipose+tissue+and+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).</li>
<li>Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+freshly+isolated+human+adipose+stromal+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Surgery+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications.</a> Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).</li>
<li>Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+respirometric+measurements+of+UCP1-mediated+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis.</a> Biochimie. 134, 56-61 (2017).</li>
<li>Hiraike, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+with+mouse+adipocytes+using+hypotonic+buffer+to+enrich+nuclear+fraction+before+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation.</a> STAR Protocols. 4 (1), 102093(2023).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tiene un interés financiero en competencia relacionado con este trabajo.

Aquí, describimos un protocolo para el aislamiento de la SVF del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y realizar la diferenciación de adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de colagenasa disminuyó la variación experimental, disminuyó el riesgo de contaminación y aumentó la reproducibilidad. Si bien este procedimiento es un paso crítico dentro del protocolo presentado, el proceso está altamente automatizado y no se necesita optimización. Sin embargo, dependiendo de l...

La biología del tejido adiposo ha estado atrayendo una atención cada vez mayor debido a la creciente prevalencia de obesidad y diabetes tipo 2 a nivel mundial1. Los adipocitos almacenan el exceso de energía en forma de gotas de lípidos, que se liberan al morir de hambre. Además, el tejido adiposo mantiene la homeostasis energética sistémica al servir como órgano endocrino y comunicarse con otros tejidos 2,3. Curiosamente, tanto el exceso de tejido adiposo (obesidad) como la pérdida adiposa (lipodistrofia) están relacionados con la resistencia a la insulina y la diabetes1. Los adipocitos se dividen en tres tipos: blanco, marrón y beige1. Los adipocitos blancos almacenan principalmente el exceso de energía como lípidos, mientras que los adipocitos marrones y beige disipan la energía en forma de calor a través de la proteína 1 de desacoplamiento mitocondrial (Ucp1)1,4. En particular, los adipocitos beige (también llamados adipocitos marrones "inducibles") aparecen en el tejido adiposo blanco en respuesta a la estimulación fría o simpática y exhiben patrones de expresión génica que se superponen pero son distintos de los de los adipocitos marrones "clásicos"5. Recientemente, se ha anticipado que los adipocitos marrones y beige son objetivos potenciales de tratamientos contra la obesidad y la diabetes destinados a "mejorar la disipación de energía" en lugar de "suprimir la ingesta de energía"4. De manera favorable, se informa que el alelo de riesgo de la variante de obesidad FTO rs1421085 en humanos, que exhibe la asociación más fuerte con un mayor índice de masa corporal (IMC) entre las variantes comunes 6,7 y exhibe varias interacciones gen-ambiente8,9, regula negativamente la diferenciación y función de los adipocitos beige10. El γ del receptor activado por proliferador de peroxisomas (PPARγ) es conocido como un regulador transcripcional maestro de la adipogénesis y es necesario y suficiente para la diferenciación de los adipocitos11. Los reguladores transcripcionales, como el dominio homólogo PRD1-BF1-RIZ1 que contiene 16 (PRDM16), el factor 2 de células b tempranas (EBF2) y el factor nuclear I-A (NFIA), son cruciales para la diferenciación y función de los adipocitos marrones y beige 12,13,14,15,16,17,18 . Por otro lado, la programación génica del adipocitos blancos requiere reguladores transcripcionales, como la proteína potenciadora similar a la transducina 3 (TLE3) y la proteína 423 del dedo de zinc (ZFP423)19,20,21.
Los sistemas modelo in vitro permiten realizar estudios moleculares que tienen como objetivo mejorar la comprensión de los mecanismos subyacentes a las funciones y disfunciones de los adipocitos. Aunque existen líneas celulares de preadipocitos inmortalizadas y disponibles públicamente como 3T3-L1 y 3T3-F442A22,23,24, el cultivo de preadipocitos primarios y la diferenciación en adipocitos sería un modelo más adecuado para estudiar la adipogénesis in vivo. El aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino es un método bien conocido para la obtención de preadipocitos primarios25,26. Sin embargo, la digestión de la colagenasa del tejido adiposo, que se realiza comúnmente utilizando un agitador bacteriano con un bastidor tubular, puede resultar en una variación experimental y es propensa a la contaminación27,28. Aquí, describimos un protocolo alternativo que utiliza un disociador de tejido suave de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) para la digestión de la colagenasa para lograr un aislamiento más fácil de la SVF.

<table><tbody><tr><td>Plato de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>placa de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Plato de 60 mm</td><td>IWAKI</td><td>3010-060</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disociación de tejido adiposo, ratón y rata</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-808</td><td>Contenido: Enzima D, Enzima R, Enzima A y Tampón A</td></tr><tr><td>Colador de células 70 &micro; m</td><td>BD falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Platos recubiertos de colágeno, 100 mm</td><td>BD</td><td>#356450</td><td></td></tr><tr><td>Platos recubiertos de colágeno, 60 mm</td><td>BD#</td><td>354401</td><td></td></tr><tr>Microplaca de recubrimiento de<td>colágeno I 6 pocillos</td><td>IWAKI</td><td>4810-010</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Wako</td><td>041-18861</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de disección</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Tijeras de disección, romas/afiladas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>autoclave antes de usar</td></tr><tr><td>Tijeras de disección, afiladas/afiladas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>autoclave antes</td></tr><tr><td>de usar DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubos</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACSOcto Disociador con calentadores</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R Inyección U-100</td><td>Eli Lilly</td><td>872492</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Isobutilmetilxantina (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>17018-1G</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina Sulfato</td><td>Fujifilm</td><td>146-08871&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>pBABE-neo largeTcDNA (SV40)</td><td>Añadir gen</td><td>#1780</td><td></td></tr><tr><td>PBS comprimidos</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line cell</td><td>biolab</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12996-81</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems 4367659</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>#FSQ-201</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Wako</td><td>180-02653</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T2877-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

El estudio in vitro de la diferenciación de adipocitos blancos, marrones y beige permite la investigación de las funciones autónomas celulares de los adipocitos y sus mecanismos. Las líneas celulares de preadipocitos blancos inmortalizados están disponibles públicamente y se usan ampliamente. Sin embargo, la aparición de adipocitos beige en el tejido adiposo blanco en respuesta a señales externas es difícil de recapitular en toda su extensión utilizando líneas celulares de adipocitos blancos disponibles públicamente. El aislamiento de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino se ejecuta comúnmente para obtener preadipocitos primarios y realizar la diferenciación de adipocitos. Sin embargo, la picada y la digestión de la colagenasa del tejido adiposo a mano pueden dar lugar a variaciones experimentales y son propensas a la contaminación. Aquí, presentamos un protocolo semiautomatizado modificado que utiliza un disociador de tejido para la digestión de colagenasa para lograr un aislamiento más fácil del SVF, con el objetivo de reducir la variación experimental, reducir la contaminación y aumentar la reproducibilidad. Los preadipocitos obtenidos y los adipocitos diferenciados pueden ser utilizados para análisis funcionales y mecanicistas.

Este protocolo produce adipocitos completamente diferenciados y cargados de lípidos 7 días después de inducir la diferenciación de los adipocitos. El grado de diferenciación de los adipocitos puede evaluarse mediante la tinción de triglicéridos y lípidos (Figura 1A), o el análisis de expresión de ARNm mediante qPCR-RT de genes adipocitos, como el regulador maestro de la adipogénesis Pparg y su diana Fabp4 (Figura 1B). Para inducir la diferencia...

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Estamos interesados en los subtipos marrones y beige de adipocito que disipan la energía en forma de calor, mientras que el adipocito blanco generalmente almacena energía como Nuestro objetivo es desarrollar un nuevo tratamiento para la obesidad y la diabetes basado en la promoción del gasto energético, en lugar de la supresión de la ingesta de energía. Hemos identificado un factor de transcripción, NFI, como un regulador crítico de la diferenciación de adipocitos marrones mediante un análisis de cromatina abierta de todo el genoma. NFI y el regulador transcripcional maestro de la adipogénesis, PPAR-gamma, se co-localizan como los potenciadores específicos de la grasa marrón.En el proceso de aislamiento de la fracción vascular estromal del tejido adiposo del ratón, la picada manual y la digestión de la colagenasa del tejido adiposo pueden conducir a la variabilidad experimental y la contaminación. Nuestro método utiliza un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa, que facilita el aislamiento de SVF, reduce la variabilidad experimental y la contaminación, y mejora la reproducibilidad. Los experimentos con adipocito individualmente diferenciados son indispensables para la investigación en nuestro campo.Nuestro protocolo ofrecería un aislamiento de SVF fácil y reproducible para la posterior diferenciación de adipocitos y aceleraría la investigación en nuestra comunidad. Actualmente, estamos investigando el papel de la NFI del metabolismo de todo el cuerpo, como el peso corporal y la glucosa, utilizando modelos de ratón de ganancia y pérdida de función. También exploraremos otras activaciones farmacológicas de NFI para cada vía descendente en un futuro próximo.

semi-automated-isolation-stromal-vascular-fraction-from-murine-white

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video demuestra una técnica para aislar y cultivar células madre adiposas (ADSC) derivadas de la cresta neural marcadas con fluorescencia a partir de tejido adiposo del arco periaórtico murino. Tras el aislamiento, las NCADSC se detectan, se clasifican mediante la clasificación celular activada por fluorescencia y, posteriormente, se cultivan en una placa, lo que promueve la proliferación celular.

Aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo periaórtico murino

Preadipocitos primarios blancas aisladas de tejidos adiposos blancos en ratones se pueden diferenciar en células beige / brite. Se presenta aquí un sistema fiable modelo celular para estudiar la regulación molecular de "color" de la grasa blanca.

Aislamiento y diferenciación de las células del estroma vascular a células Beige / Brite

En 2001, investigadores de la UCLA describen el aislamiento de una población de células madre adultas, denominada células madre o las ASC derivadas de tejido adiposo, a partir de tejido adiposo. En este artículo se describe el aislamiento de las ASC de lipoaspirates utilizando un protocolo de digestión manual, enzimática utilizando colagenasa.

Aislamiento Manual de células madre derivadas de tejido adiposo de Lipoaspirates Humanos

El tejido adiposo (AT) es un sitio de activación de células inmunes y la interacción intensa. Casi todas las células del sistema inmune están presentes en AT y sus proporciones se alteran por la obesidad. Aislamiento adecuado, cuantificación y caracterización de las poblaciones de células inmunes son fundamentales para la comprensión de su papel en la enfermedad immunometabolic.

Aislamiento de tejido adiposo células inmunes

Se presenta un protocolo para aislar fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo que representan unidades de vascularización prometedores. Se pueden aislar rápidamente, no requieren en el procesamiento vitro y, por tanto, puede ser utilizado para prevascularization de un solo paso en diferentes campos de la ingeniería de tejidos.

Aislamiento de murino tejido adiposo derivado de microvascular Fragmentos como Unidades Vascularización para ingeniería de tejidos

Tejido adiposo blanco (WAT) tiene deficiencias importantes en sus modelos actuales de cultivo primario, que obstaculizan el desarrollo farmacológico y estudios metabólicos. Aquí, presentamos un protocolo para producir un sistema microphysiological adiposo WAT bocadillo entre las hojas de las células estromales. Esta construcción proporciona una plataforma estable y adaptable para cultivo primario de WAT.

Una plataforma de Microphysiologic de grasa humana: intercala tejido adiposo blanco

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

Este protocolo proporciona un método eficiente de digestión de colagenasas para el aislamiento de adipocitos viables y células de la fracción vascular estromal-SVF de grasa visceral humana en un solo proceso, incluida la metodología para obtener ARN de alta calidad de los adipocitos y la fenotipificación de los macrófagos SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su análisis por citometría de flujo.

Aislamiento de adipocitos viables y fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo visceral humano adecuado para análisis de ARN y fenotipado de macrófagos

En este trabajo se describe el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, lo que permite estudiar la función del tejido adiposo perivascular y su relación con las células vasculares.

Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón

Aquí presentamos un método estándar para aislar de forma eficiente células madre y adipocitos derivados del adiposo, caracterizado por una reducción del &gt; del 90% en el tiempo de procesamiento, alta viabilidad celular y amplia compatibilidad.

Aislamiento eficiente de células madre y adipocitos derivados del adiposo a partir de tejido adiposo porcino

Aprende el aislamiento semiautomatizado de la fracción vascular estromal de tejido adiposo blanco murino mediante un disociador tisular. Este protocolo mejora la reproducibilidad para la diferenciación de adipocitos en investigación metabólica.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

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