Name: Análisis de la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a analizar la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente GFP y ensayos de ChIP. Este protocolo estandarizado permite estudiar modificaciones cromatínicas y vías de ARN pequeño en el gusano nematodo.

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Deseamos agradecer a los laboratorios de la comunidad de C. elegans que desarrollaron y compartieron las herramientas y cuyo trabajo se cita en este manuscrito. Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Este trabajo fue apoyado por una subvención del Proyecto de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) a A.L.S. (PJT-175245). C.L. cuenta con el apoyo de una beca de posgrado del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) (PGS-D).

Herencia epigenética y ChIP en Caenorhabditis elegans

<ol><li>Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+heritable+silencing+induced+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).</li>
<li>Ashe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+can+trigger+a+multigenerational+epigenetic+memory+in+the+germline+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans.</a> Cell. 150 (1), 88-99 (2012).</li>
<li>Buckley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+Argonaute+promotes+multigenerational+epigenetic+inheritance+and+germline+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality.</a> Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+silencing+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term gene silencing by RNAi.</a> Nature. 442 (7105), 882(2006).</li>
<li>Lee, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+piRNAs+mediate+the+genome-wide+surveillance+of+germline+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts.</a> Cell. 150 (1), 78-87 (2012).</li>
<li>Luteijn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+stable+Piwi-induced+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).</li>
<li>Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+siRNAs+mediate+paramutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).</li>
<li>Shirayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+initiate+an+epigenetic+memory+of+nonself+RNA+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline.</a> Cell. 150 (1), 65-77 (2012).</li>
<li>Minkina, O., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+heritable+germline+silencing+directs+somatic+silencing+at+an+endogenous+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus.</a> Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).</li>
<li>Seroussi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+epigenetic+regulation+by+C.+elegans+nuclear+RNA+interference+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).</li>
<li>Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3+is+required+for+inheritance+of+small+RNAs+that+target+a+unique+subset+of+newly+evolved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes.</a> eLife. 8, e40448(2019).</li>
<li>Woodhouse, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+SET-25+and+SET-32+are+required+for+establishment+but+not+long-term+maintenance+of+transgenerational+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance.</a> Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+resets+ancestral+heritable+small+RNA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stress resets ancestral heritable small RNA responses.</a> eLife. 10, e65797(2021).</li>
<li>Houri-Ze'evi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+mechanism+determines+the+duration+of+the+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 165 (1), 88-99 (2016).</li>
<li>Spracklin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAi+inheritance+machinery+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).</li>
<li>Perales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance+is+negatively+regulated+by+the+HERI-1+chromodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein.</a> Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).</li>
<li>Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+coordinate+poly%28UG%29+tailing+to+prevent+aberrant+and+perpetual+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing.</a> Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+GeneticsWormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+Vinyl+Record%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record.</a> microPublication Biology. 2018, (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+techniques+for+the+analysis+of+chromatin+and+nuclear+organization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).</li>
<li>Gu, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+siRNA+in+Caenorhabditis+elegans+generates+a+transgenerational+sequence-targeted+histone+H3+lysine+9+methylation+footprint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint.</a> Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+the+downstream+effects+of+germline+nuclear+RNAi+reveals+that+H3K9me3+is+dispensable+for+heritable+RNAi+and+the+maintenance+of+endogenous+siRNA-mediated+transcriptional+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).</li>
<li>Kalinava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+heterochromatin+factor+SET-32+plays+an+essential+role+in+transgenerational+establishment+of+nuclear+RNAi-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing.</a> Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).</li>
<li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET-2-dependent+H3K9+methylation+suppresses+transgenerational+small+RNA+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance.</a> Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+Argonaute+protein+promotes+the+inheritance+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi.</a> Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).</li>
<li>Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+inheritance+of+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans.</a> Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+rules+explain+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).</li>
<li>Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNAi+maintains+heritable+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrde+pathway+mediates+small-RNA-directed+histone+H3+lysine+27+trimethylation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
</ol>

Todos los autores confirman que no tienen ningún conflicto que revelar.

En este protocolo, el dsRNA se introduce por alimentación, que se ha convertido en un método estándar en C. elegans18. Para los ensayos de herencia de ARNi, el enfoque de alimentación proporciona un método fácil para obtener una gran población de P0 2,11,12,22,23,24,25. Sin embargo, el momento y la duración de la exposición al ARNi afectan a la eficacia del silenciamiento transgénico26, y la concentración de bacterias ARNi afecta a la persistencia del silenciamiento del ARNi hereditario1. Por lo tanto, el crecimiento estandarizado de bacterias ARNi y gusanos es importante para obtener un nivel constante de silenciamiento de GFP y duración de la herencia. Aquí, los embriones se colocan en placas de ARNi para que los animales P0 estén expuestos a las bacterias ARNi desde la eclosión. Los enfoques alternativos han colocado animales sincronizados en estadios L1 24,27 oL4 25 en placas de ARNi-NGM. Además, dado que la inanición y otros estreses afectan el mantenimiento de la herencia de ARNi13, las placas deben ser monitoreadas para evitar el hacinamiento y el agotamiento del suministro de alimentos. Como alternativa a la iniciación del ARNi por alimentación, algunos de los estudios pioneros de herencia de ARNi de C. elegans indujeron el ARNi a través de la inyección en gónadas, lo que proporciona un mayor control de la concentración de dsRNA 1,28.
En este protocolo, cada generación es transitada como una población con tratamiento con hipoclorito alcalino, como se describió previamente 16,22,23,24. El tratamiento con hipoclorito garantiza que la generación F1 no se contaminará con bacterias ARNi del entorno parental22 y evita posibles cuellos de botella no deseados en la población. Sin embargo, el paso a granel también puede ser una limitación, ya que los animales individuales pueden tener patrones de herencia distintos 1,29. Un método alternativo para establecer cada generación es seleccionar animales individuales 1,2,9,11,25. Este enfoque permite el seguimiento de fenotipos dentro de linajes y la incorporación de cruces genéticos. El análisis de linaje también puede ser ventajoso para fenotipos de baja penetrancia12.
La expresión de proteínas fluorescentes es una lectura potente y conveniente del silenciamiento inducido por ARNi 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Como se describe en este protocolo, la expresión GFP se puede puntuar manualmente como ON o OFF 11,12,15,16,25. La puntuación manual se puede refinar aún más mediante la asignación de niveles de intensidad cualitativa 3,4,14. Alternativamente, la puntuación de intensidad automatizada de imágenes de microscopía 11,12,14,25,27 o la medición de fluorescencia por citometría de flujo de animales vivos2 pueden proporcionar una lectura cuantitativa y de alto rendimiento. Sin embargo, dado que la expresión del reportero está restringida a la línea germinal, una advertencia de los enfoques automatizados es que también deben diferenciar entre los animales con expresión silenciada de GFP y los animales sin línea germinal, especialmente si el estudio incorpora mutantes con un desarrollo anormal de la línea germinal. Como alternativa a la fluorescencia de GFP, se puede utilizar la transcripción inversa (RT)-qPCR para cuantificarlos niveles de ARNm y ARNm 2,16,23,24. Este enfoque proporciona una lectura más directa del silenciamiento, que se dirige al ARN, y es especialmente útil para otras dianas de ARNi en las que el silenciamiento no produce un fenotipo visible. Una limitación del uso de reporteros artificiales de GFP es que las secuencias exógenas y endógenas están reguladas diferencialmente en el ARNi transgeneracional11. Por lo tanto, los estudios con dianas endógenas, como el alelo letal embrionario sensible a la temperatura oma-1(zu405)1,11,16,25, deben considerarse como un enfoque complementario a los reporteros de transgenes fluorescentes.
El análisis de ChIP en el contexto de los ensayos de herencia de ARNi requiere la comparación entre tratamientos y réplicas. En primer lugar, para tener en cuenta las diferencias en el material de partida entre las muestras, la señal ChIP se normaliza a la señal de entrada en el mismo lugar que el "porcentaje de entrada". El procesamiento de una histona H3 ChIP en paralelo ayudará a determinar si cualquier alteración de la modificación de histonas se corresponde con cambios en la densidad de nucleosomas. Además, debido a que ChIP es un proceso de varios pasos, la eficiencia puede variar entre muestras. La selección de loci de control positivo y negativo apropiados es útil para evaluar y comparar la relación señal-ruido entre muestras y experimentos. Además, para facilitar las comparaciones entre muestras, los valores del ciclo umbral de qPCR de ADN ChIP en el objetivo de ARNi a menudo se normalizan a un locus de control 3,11,15,23,30,31. Para evaluar los efectos del tratamiento con ARNi, también se compara la relación entre la señal ChIP en el ARNi del tratamiento y las condiciones de control o ausencia de ARNi. Una limitación del enfoque actual es que la ChIP se realiza con animales enteros, mientras que la respuesta al tratamiento con ARNi puede ser exclusiva de la línea germinal. Un enfoque para superar esta advertencia es realizar ChIP utilizando núcleos aislados de la línea germinal. Las consideraciones técnicas adicionales para optimizar ChIP también se han discutido ampliamente en otros lugares32,33.
En general, esta herencia de ARNi y el protocolo ChIP proporcionan una base detallada y fácil de adaptar que puede integrarse con otras técnicas para explorar más a fondo la regulación epigenética transgeneracional. Por ejemplo, se pueden construir bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento a partir del ADN ChIP (ChIP-seq) para obtener una visión más detallada del panorama de la cromatina, tanto proximal a la diana de ARNi como a escala de todo el genoma.

La herencia epigenética permite la transmisión de información reguladora de genes a través de generaciones y, por lo tanto, puede permitir que el entorno o las experiencias de los padres afecten a su progenie. En C. elegans, el silenciamiento génico de la línea germinal iniciado por ARN bicatenario exógeno (dsRNA) puede heredarse durante varias generaciones en la progenie no expuesta al desencadenante original 1,2,3,4. Este proceso, denominado herencia de ARN de interferencia (ARNi), es uno de varios fenómenos de silenciamiento epigenético relacionados en C. elegans, incluido el silenciamiento multigeneracional iniciado por piRNA2,5, la paramutación/ARNe (silenciamiento epigenético inducido por ARN)6,7,8 y el silenciamiento iniciado por matrices multicopia9, que tienen requisitos superpuestos pero distintos para la maquinaria de regulación de ARN pequeño y cromatina . En el ARNi exógeno de C. elegans, el dsRNA se procesa en pequeños ARN interferentes (siRNA) que actúan en un complejo con las proteínas primarias de Argonaute para reconocer su ARNm diana. Esta orientación conduce a la amplificación de siRNAs secundarios que se asocian con Argonautas secundarios para silenciar el ARNm diana a través de vías de silenciamiento citoplasmático y nuclear. En el caso de las dianas de ARNi expresadas en la línea germinal, el ARGONAUTE secundario nuclear HRDE-1 y los factores de ARNi nuclear adicionales se dirigen a los transcritos nacientes, lo que da lugar a la represión transcripcional y al reclutamiento de metiltransferasas de histonas para depositar marcas de cromatina represivas, incluida H3K9me310. La histona H3K9me3 promueve el establecimiento del silenciamiento hereditario de los transgenes de proteína verde fluorescente (GFP) expresados en la línea germinal por la herencia de ARNi11,12.
El objetivo de este protocolo es utilizar un transgén que exprese una proteína de fusión GFP-histona en la línea germinal como indicador de la herencia de ARNi y ensayar los cambios en las modificaciones de las histonas en el locus del transgén reportero mediante inmunoprecipitación de cromatina y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (ChIP-qPCR). Este protocolo describe un enfoque estandarizado de alimentación de ARNi basado en placas para iniciar el silenciamiento del reportero. También proporciona una cronología detallada para el paso de animales entre generaciones mediante el aislamiento en el útero de embriones de adultos grávidos mediante un tratamiento con hipoclorito alcalino («blanqueo»). También se describen métodos y datos representativos para monitorizar la frecuencia de silenciamiento de GFP en un subconjunto de la población mediante microscopía de fluorescencia y para la histona H3K9me3 ChIP-qPCR. Los ensayos de herencia de ARNi basados en reporteros proporcionan un sistema altamente manejable para diseccionar funcionalmente los roles de los factores genéticos y ambientales en la regulación epigenética 13,14, y los exámenes genéticos que utilizan dichos reporteros han identificado tanto los genes que son necesarios para 2,3,15 como los genes que regulan negativamente 16,17 la duración de la herencia epigenética transgeneracional.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Bioshop</td><td>AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Bioshop</td><td>AMP201</td><td>Haga una solución de 100 mg/mL en agua ultrapura. Filtrar-esterilizar y almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-H3K9me3 para conejos</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td>La concentración depende del lote (0,9 - 1 mg/mL).</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal antihistona H3 para conejos</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>La concentración depende del lote (0,7 - 1 mg/mL).</td></tr><tr><td>Lejía (6% Hipoclorito de sodio)</td><td></td><td>Lavo</td> 02358107<td></td></tr><tr><td>C. elegans cepa con GFP RNAi Reporter</td><td>NA</td><td>SX1263</td><td>Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). Un regalo del laboratorio E. Miska, Universidad de Cambridge.</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>BioShop</td><td>CAR544</td><td>Prepare una solución de 25 mg/mL en agua ultrapura. Filtrar-esterilizar y almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína G Cuentas Magnéticas</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>E. coli cepa HT115(DE3)</td><td>Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)</td><td>HT115(DE3)</td><td></td></tr><tr><td>E. coli cepa OP50-1</td><td>Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)</td><td>OP50-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>Invitrogen</td><td></td> 15575020 <td></td></tr><tr><td>Fluorescencia Estereoscopio</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído (37%)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td>Prepare una solución de 1,25 M y almacene a 4 °C.</td></tr><tr><td>HEPES-KOH (1 M, pH 7.5)</td><td>Teknova</td><td>H1035</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos impresos hidrófobos, 10 pocillos</td><td>VWR</td><td>100488-904</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (etoxilato de octilfenol)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>Prepare una solución al 10% (v/v) en agua ultrapura y almacene a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>IPTG (Isopropil-&beta;-D-tiogalactósido)</td><td>BioShop</td><td>IPT001</td><td>Haga una solución de 0,2 g/mL en agua ultrapura. Filtrar-esterilizar y almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>LB Placas de Agar suplementadas con 100 &micro; g/mL de ampicilina</td><td>NA</td><td>NA Receta</td><td>estándar de laboratorio.</td></tr><tr><td>Levamisol (clorhidrato de tetramisol)</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>Hacer una solución de 200 mM en agua ultrapura. Almacenar a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>LiCl (8 m)</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>M9 Tampón</td><td>NA</td><td>NA</td><td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.</td></tr><tr><td>Separador magnético (tubos de 1,5 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Separador magnético (tubos de 0,2 mL)</td><td>Permagen</td><td>MSR812</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>Technologist Choice</td><td>LAB-037</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5 M)</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td>Para tampones ChIP.</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>Haga una solución de 10 M y almacene a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Placas NGM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1,7% (p/v) agar, 0,3% (p/v) de NaCl, 0,25% (p/v) de peptona, 1 mM de CaCl2, 5 &mu; g/mL colesterol, 25 mM Fosfato de potasio pH 6,0, 1 mM MgSO4, 50 y micro; g/mL de estreptomicina.</td></tr><tr><td>IgG normal de conejo (1 mg/mL)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>2729</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (35 mm x 10 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (10X)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido - ARNi de control;</td><td>Addgene</td><td>L4440 (Plásmido #1654)</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido - ARNi dirigido a GFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4417 (plásmido #1649)</td><td>Nota, se pueden utilizar plásmidos alternativos derivados de L4440 dirigidos a GFP.</td></tr><tr><td>Par de cebadores [-3,3 kb aguas arriba de gfp]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG</td></tr><tr><td>Par de cebadores [+1,3 kb aguas abajo de gfp]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT</td></tr><tr><td>Par de cebadores [clec-18]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA</td></tr><tr><td>Par de cebadores [gfp exón 1]</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>NA</td><td>F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTGTGT, R: GGGTAAGTTCCGTATGTGTTGC</td></tr><tr><td>Par de cebadores [gfp exón 4]</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>NA</td><td>F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA</td></tr><tr><td>Par de cebadores [hrp-2]</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>NA</td><td>F: CGTCAACAGGGAGCAGCTGG, R: CCTCCGAACTTTCTCTCTCTCCA Tableta</td></tr> de <tr><td>cóctel inhibidor de proteasa</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas de RNAi-NGM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1,7% (p/v) agar, 0,3% (p/v) NaCl, 0,25% (p/v) peptona, 1 mM CaCl2, 5 y micro; g/mL colesterol, 25 mM Tampón fosfato potásico pH 6,0, 1 mM MgSO4, 25 &micro; g/mL de carbenicilina y 5 mM de IPTG.</td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (N-Lauroilsarcosina sódica, sal)</td><td>Sigma</td><td>L5777</td><td>Prepare una solución al 10% (p/v) y almacene a temperatura ambiente, protegida de la luz, durante un máximo de 1 mes.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>74255</td><td>Prepare una solución al 10% (p/v) y almacene a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>Prepare una solución al 5% (p/v) y almacene a temperatura ambiente, protegida de la luz durante un máximo de 1 mes.</td></tr><tr><td>Tubo de sonicación</td><td>Evergreen</td><td>214-3721-010</td><td></td></tr><tr><td>Tapa del tubo de sonicación</td><td>Evergreen</td><td>300-2911-020</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica Q800R3-110</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Bioshop</td><td>STP101</td><td>Haga una solución de 50 mg / mL en agua ultrapura. Filtrar-esterilizar y almacenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Tampón TAE (1X)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>40 mM Tris, 20 mM acetato, 1 mM</td></tr><tr><td>EDTA Contador de conteo clicker</td><td>Uline</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Bioshop</td><td>TET701</td><td>Prepare una solución de 5 mg/mL en etanol y almacene a -20 °C.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-205</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Prepare una solución al 10% (v/v) en agua ultrapura y almacene a temperatura ambiente.</td></tr></tbody></table>

análisis de la herencia epigenética transgeneracional en c. elegans mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (chip)

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

La herencia epigenética transgeneracional (TEI) permite la transmisión de información a través de la línea germinal sin cambiar la secuencia del genoma, a través de factores como los ARN no codificantes y las modificaciones de la cromatina. El fenómeno de la herencia de ARN de interferencia (ARNi) en el nematodo Caenorhabditis elegans es un modelo eficaz para investigar TEI que aprovecha el corto ciclo de vida, la autopropagación y la transparencia de este organismo modelo. En la herencia de ARNi, la exposición de los animales al ARNi conduce al silenciamiento génico y a la alteración de las firmas de cromatina en el locus diana que persisten durante varias generaciones en ausencia del desencadenante inicial. Este protocolo describe el análisis de la herencia de ARNi en C. elegans utilizando un indicador de proteína fluorescente verde nuclear (GFP) expresado en la línea germinal. El silenciamiento del reportero se inicia alimentando a los animales con bacterias que expresan ARN bicatenario dirigido a GFP. En cada generación, los animales son conducidos para mantener un desarrollo sincronizado, y el silenciamiento del gen reportero se determina mediante microscopía. En generaciones seleccionadas, las poblaciones se recolectan y procesan para la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para medir el enriquecimiento de la modificación de histonas en el locus reportero de GFP. Este protocolo para estudiar la herencia de ARNi puede modificarse fácilmente y combinarse con otros análisis para investigar más a fondo los factores TEI en las vías de ARN pequeño y cromatina.

Los animales portadores del reportero de la histona GFP H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 expresada en la línea germinal (Figura 2A) fueron expuestos al ARNi de GFP o al ARNi de control mediante la alimentación, y se les hizo pasar como se describe en el protocolo y en la Figura 1. La señal de GFP nuclear en la línea germinal se puntuó manualmente utilizando un microscopio de disección de fluorescencia para una muestra de la población en cada generación. El silenciamiento del transgén fue totalmente penetrante en los animales puntuados P0 y F1 tratados con GFP RNAi (Figura 2B). En la generación F2, la proporción de la población que exhibía herencia de silenciamiento de GFP fue de aproximadamente el 50%. Para la generación F5, la mayoría de la población no mostró herencia de silenciamiento, y para la generación F10, no se detectó herencia, ya que todos los animales expresaron GFP.
Para determinar el cambio en el enriquecimiento de la histona H3K9me3 correspondiente al silenciamiento inducido por ARNi, se realizó ChIP-qPCR en animales de generación F1 después de un tratamiento con ARNi GFP o ARNi control. Como era de esperar, la población tratada con ARNi de GFP mostró niveles más altos de histonas H3K9me3 en el objetivo de GFP y en la región descendente de 1,3 kb en comparación con los animales tratados con ARNi de control (Figura 2C). La especificidad de la histona H3K9me3 ChIP está respaldada por el enriquecimiento en un locus de control positivo (clec-18) que se sabe que está enriquecido en esta marca, pero no en un locus de control negativo cercano (hrp-2). También se detectó enriquecimiento de histonas H3 y enriquecimiento cercano al fondo en las inmunoprecipitaciones de control de IgG en todos los loci de qPCR, como se esperaba. Cuando el enriquecimiento de ChIP en el reportero se normaliza al locus de control positivo clec-18 , se muestra un mayor enriquecimiento de la histona H3K9me3 en el ARNi de GFP, mientras que el enriquecimiento de la histona H3 es similar entre los tratamientos de control y de ARNi de GFP (Figura 2D). Dado que no se espera que el ARNi de GFP afecte a la histona H3K9me3 ni a la ocupación total de la histona H3 en el locus clec-18 , esta normalización mitiga la variación técnica, como las diferencias en la eficiencia de ChIP entre el ARNi de GFP y las muestras de ARNi de control. El cambio de plegamiento de los niveles de histonas H3K9me3 e histonas H3 entre los tratamientos con ARNi muestra un enriquecimiento de la histona H3K9me3 específica del reportero de GFP, independiente de la ocupación de la histona, tras el silenciamiento inducido por ARNi de GFP (Figura 2E).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65285/65285fig02.jpg"> Figura 2: El silenciamiento inducido por GFP RNAi corresponde a un enriquecimiento elevado de H3K9me3 en la diana de ARNi. (A) Diagrama del reportero de ARNi GFP expresado en la línea germinal mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] con regiones de amplicón de qPCR marcadas. (B) La expresión de GFP se obtuvo a lo largo de las generaciones después de los tratamientos con ARNi a 21 °C. Las barras de error representan la desviación estándar de dos réplicas biológicas. (C) ChIP-qPCR de H3K9me3, histona H3 y control de IgG en adultos jóvenes F1 a partir de dos réplicas biológicas. clec-18 y hrp-2 son los loci de control positivo y negativo para el enriquecimiento de H3K9me3, respectivamente. (D) Enriquecimiento de H3K9me3 e histona H3 en el reportero de ARNi de GFP normalizado al locus de control positivo clec-18. (E) Cambio en el enriquecimiento de H3K9me3 e histona H3 entre los animales tratados con ARNi GFP y los animales tratados con ARNi control, con normalización a clec-18. La línea punteada representa un cambio de plegado de 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65285/65285fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe un ensayo de interferencia de ARN y ChIP para estudiar la herencia epigenética del silenciamiento inducido por ARNi y las modificaciones asociadas a la cromatina en C. elegans.

Análisis de la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

La investigación en nuestro laboratorio examina cómo las proteínas asociadas a la cromatina, las modificaciones de las histonas y los factores de la vía del ARN pequeño trabajan juntos en el contexto del desarrollo y la herencia epigenética transgeneracional. El ensayo de herencia de ARN, utilizando un reportero GFP, se ha convertido en una herramienta muy poderosa. Este protocolo describe cómo estandarizar la preparación, el puntaje y el paso de gusanos, y la preparación de muestras de ChIP, lo que puede ayudar a generar resultados reproducibles.Uno de los retos experimentales cuando se estudian los transgenes expresados en la línea germinal es aislar los efectos en la línea germinal del animal. Actualmente estamos utilizando animales enteros para ChIP, pero en el futuro nos gustaría desarrollar ensayos para examinar la cromatina, específicamente en la línea germinal. Nuestro laboratorio está interesado en la metilación de histonas y las proteínas que reconocen estas marcas.En el futuro, nos gustaría investigar la interacción entre estos lectores de cromatina y las pequeñas vías de ARN en el contexto de la herencia de ARNi en los transgenes y la regulación de las secuencias endógenas.

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Investigación

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Genética

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

En este artículo se describe una técnica para la visualización de los primeros eventos de la embriogénesis en el...

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe un procedimiento rápido y de bajo consumo de material para la integración de matrices extracromosómicas transgénicas en el genoma de Caenorhabditis elegans utilizando irradiación ultravioleta (UV). Además, este protocolo es particularmente adecuado para líneas transgénicas que transmiten matrices extracromosómicas a una alta velocidad.

Un protocolo rápido para la integración de matrices extracromosómicas con alta tasa de transmisión en el genoma de C. elegans

Describimos los pasos detallados de un ensayo químico de alto rendimiento en el nematodo Caenorhabditis elegans utilizado para evaluar la toxicidad de la línea germinal. En este ensayo, la interrupción de la función de la línea germinal después de la exposición química se monitorea utilizando un indicador fluorescente específico para embriones aneuploides.

Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Reglamento de medio ambiente de la cromatina es un proceso esencial para expresión génica adecuada. Aquí, describimos un método para controlar la expresión génica a través de la contratación de modificadores de la cromatina maquinaria de manera gene-específica y reversible.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Este método está diseñado para seguir la formación de dominios de cromatina mediadas por PRC2 en líneas celulares, y el método se puede adaptar a muchos otros sistemas.

Un método para estudiar la formación de novo de dominios de cromatina

Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

La infección de Caenorhabditis elegans por el parásito microsporidio Nematocida parisii permite a los gusanos producir descendencia que es altamente resistente al mismo patógeno. Este es un ejemplo de inmunidad hereditaria, un fenómeno epigenético poco conocido. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de gusano genéticamente tratable.

Estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de Caenorhabditis elegans de infección por microsporidios

Aquí, presentamos protocolos y herramientas para visualizar el calcio durante la fertilización y la embriogénesis temprana utilizando un reportero de calcio codificado genéticamente expresado en la línea germinal del nematodo modelo C. elegans.

Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Aquí presentamos un protocolo ATAC-seq rápido y sencillo para implementarse en un gusano completo de la etapa L4 de Caenorhabditis elegans usando solo 30 μL de pellet de gusano.

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Un flujo de trabajo de microinyección CRISPR/Cas9 para el marcaje fluorescente endógeno en la línea germinal de Caenorhabditis elegans para obtener líneas homocigotas de knock-in para análisis in vivo de localización de proteínas.

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Aprende a analizar la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente GFP y ensayos de ChIP. Este protocolo estandarizado permite estudiar modificaciones cromatínicas y vías de ARN pequeño en el gusano nematodo.

Análisis de la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) (Video) | JoVE Journal

Análisis de la herencia epigenética transgeneracional en C. elegans mediante un reportero fluorescente e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

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