Name: Perfusión sanguínea rápida y efectiva en Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprende un protocolo de perfusión sanguínea rápida en Xenopus laevis y Xenopus tropicalis para transcriptómica y proteómica. Este método optimiza la calidad de muestras tisulares con tratamiento humano.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención OD R24 de los NIH OD031956 y la subvención R01 del NICHD HD073104. Agradecemos a Darcy Kelly por las útiles discusiones y los aportes iniciales sobre este protocolo. También nos gustaría agradecer a Samantha Jalbert, Jill Ralston y Wil Ratzan por su asistencia y apoyo, así como a nuestros tres revisores anónimos por sus comentarios.

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las reglas y regulaciones de la Escuela de Medicina de Harvard IACUC (Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales) (IS 00001365_3).
NOTA: Aunque el método primario de eutanasia descrito es considerado una técnica aceptable para la eutanasia por la Asociación Americana de Medicina Veterinaria12, no se ha encontrado que conduzca al cese de un latido cardíaco13. Incluso el método secundario de doble picadura utilizado con frecuencia no evita esto, ni tampoco la eliminación del corazón del animal. La exanguinación de animales anestesiados se considera un método humano y eficaz para el éxito de la eutanasia12. Como mantener tejidos frescos a través de la eutanasia es el objetivo de este protocolo, es beneficioso que el corazón continúe latiendo a través de la eutanasia primaria con MS-222, y que la perfusión sea en sí misma un método de eutanasia secundaria a través de la exanguinación.
1. Preparación
<ol><li>Asegúrese de que la institución de investigación ha aprobado la técnica de eutanasia y perfusión descrita en este protocolo.</li>
	<li>Preparar una solución de 5 g/L MS-222 (metanosulfonato de tricaína) y 5 g/L de bicarbonato de sodio. El volumen debe ser mayor que el volumen requerido para cubrir completamente a los animales sacrificados. Compruebe el pH para asegurarse de que es ≥7.</li>
	<li>Preparar 500 μL de 180 U/ml de heparina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) por X. laevis, o 200 μL por X. tropicalis.</li>
	<li>Realizar la eutanasia primaria colocando el Xenopus en esta solución (a partir del paso 1.2); El animal permanecerá sumergido durante un total de 1 h.</li>
	<li>Confirme que el Xenopus ha perdido su respuesta al dolor pellizcando el pie 15 minutos en la eutanasia. Si el animal es reactivo, devuélvalo a la solución de eutanasia hasta que se pierda esta respuesta.</li>
	<li>Pesar el Xenopus y tomar las medidas adicionales necesarias antes del muestreo.</li>
	<li>Con una aguja de 31 G, inyecte X. laevis con 250 μL y X. tropicalis con 100 μL de heparina de 180 U/ml en PBS (desde el paso 1.3) en la musculatura de cada extremidad anterior.</li>
	<li>Preparar una solución de 1 mL/g del peso animal de 54 U/mL de heparina en perfusión PBS. Las personas con más experiencia con este protocolo pueden encontrar que se requieren menos medios para completar la perfusión.</li>
	<li>Use una aguja hipodérmica de 22 G para perfundir X. laevis y una aguja hipodérmica de 25 G para X. tropicali. Embelle la aguja de perfusión recortando la punta con cortadores de alambre (Figura 1)14. NOTA: Esto reduce la probabilidad de que la aguja perfore a través del ventrículo si se desplaza. Además de embotarse, la aguja puede ser molida ligeramente hacia abajo con una piedra de afilar o lima, pero aún así permanece lo suficientemente afilada como para perforar el ventrículo.</li>
	<li>Prepare la bomba colocando la aguja recortada y haciendo circular 54 U/ml de perfusión heparinizada de PBS (a partir del paso 1.8). Asegúrese de purgar todas las burbujas de aire del tubo para eliminar la posibilidad de embolia de aire, lo que conduce a una disminución de la eficiencia o falla de la perfusión (ver Tabla 1). Mantenga los medios de perfusión en hielo durante la duración del procedimiento.</li>
	<li>Si la bomba no es programable, con la aguja en su lugar, mida el volumen bombeado de medios bajo los diferentes ajustes para determinar qué ajustes son los más cercanos a 5 mL/min y 10 mL/min. Estos caudales se utilizarán independientemente de la especie. Si la bomba de perfusión es programable, calibre con la aguja en su lugar, siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Coloque la superficie de disección (bandeja o lámina de espuma) en una inclinación dentro de un recipiente secundario, o colóquela para facilitar el drenaje de la sangre.</li>
	<li>Una vez que la rana ha estado en la solución durante 1 h, se ha completado la eutanasia primaria. Retire la rana y vuelva a verificar la pérdida de respuesta al dolor realizando un pellizco en el pie.</li>
	<li>Coloque la rana sobre su espalda y fije cada extremidad (Figura 2). Si se requiere preservar el tejido de las extremidades, se pueden colocar alfileres delgados a través de los dedos o grapas en forma de U alrededor de las extremidades.</li>
	<li>Usando tijeras de disección, corte a través de la piel, hasta la línea media, y luego lateralmente, haciendo dos colgajos. (Figura 2)</li>
	<li>Use fórceps para agarrar la línea alba y alejarla de la cavidad celómica (Figura 3). Use cuidadosamente tijeras para cortar a través de la musculatura. Haga dos solapas fuera de la pared de la cavidad y corte o fije todas las solapas fuera del camino.</li>
	<li>Use tijeras de disección para cortar a través de los huesos coracoides y cortar el exceso de tejido para obtener un mejor acceso al corazón (Figura 3).</li>
	<li>El corazón todavía debería estar latiendo. Si el corazón ha dejado de latir antes de la perfusión, tenga en cuenta que la frescura de la muestra se ha visto comprometida.</li>
</ol>2. Perfusión
<ol><li>Identifique el estómago y desplácelo suavemente para que esté en la parte superior del lóbulo izquierdo del hígado (a la derecha del espectador), con su vasculatura visible durante la duración del procedimiento. Identifique un pulmón y agárrelo por su punta con pinzas de tejido. Tire del pulmón fuera de la cavidad celómica y fíjelo a través de la punta (Figura 4). Haga esto suavemente, ya que los vasos sanguíneos rotos no se perfunden bien. Tenga en cuenta si la sangre es visible dentro del lóbulo, ya que esto afectará la capacidad de determinar la finalización del procedimiento.</li>
	<li>Tome una imagen de la cavidad celómica para evaluar mejor la eficiencia de la perfusión y potencialmente identificar tejidos anormales en una fecha posterior.</li>
	<li>Identifique el pericardio delgado y tire de él enseñado con pinzas de tejido (Figura 5). Perforar suavemente el pericardio con la punta de las tijeras de iridectomía, teniendo cuidado de no cortar los tejidos subyacentes. Despegue el pericardio lejos de las tres cámaras del corazón.</li>
	<li>Use fórceps para agarrar suavemente el ventrículo por su ápice. Aplique una presión limitada para que haya suficiente espacio entre las superficies de tracción de las pinzas para que pase la aguja de perfusión (Figura 6).</li>
	<li>Inserte la aguja a través del cierre de los fórceps en la cámara del ventrículo, teniendo cuidado de no perforar a través del ventrículo (Figura 7). Sujete las pinzas de tejido en su lugar con un soporte de aguja usando un hemostático. NOTA: Esta técnica estabiliza la posición de la aguja, que todavía está afilada. Sujetar la aguja directamente al ventrículo también causará daños innecesarios, lo que dificultará la recuperación en caso de que sea necesario (ver Tabla 1).</li>
	<li>Arranque el flujo de la bomba a aproximadamente 5 mL/min. Las tres cámaras del corazón y el tronco arterial se hincharán (Figura 8; ver Tabla 1).</li>
	<li>Con tijeras, lance con cuidado la aurícula derecha (a la izquierda del espectador); La sangre se derramará. Ajuste el caudal a 5 mL/min o auméntelo a 10 mL/min.</li>
	<li>Continúe hasta que la vasculatura del estómago se blanquee (ver Tabla 1), luego lance la aurícula izquierda del corazón (a la derecha del espectador). Si el caudal sigue siendo de 5 ml/min, auméntelo a aproximadamente 10 ml/min.</li>
	<li>Use una pipeta de transferencia para enjuagar la cavidad celómica en medios de perfusión, para ayudar a mantener la visibilidad y evaluar mejor el color del perfusión que fluye de las aurículas.</li>
	<li>Mantenga la aguja en su lugar hasta que el perfusión que fluye de las aurículas esté claro (ver Tabla 1) y el pulmón haya perdido su tono rojo (ver Tabla 1; Figura 9).</li>
</ol>

Perfusión sanguínea en ranas de uñas africanas para transcriptómica y proteómica

<ol><li>Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+perfusion+as+a+method+for+vascular+visualization+in+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+brain+of+the+adult+pipid+frog%2C+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts.</a> Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+urinary+bladder+in+the+adult+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts.</a> Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).</li>
<li>Lametschwandtner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+gallbladder+of+the+adult+South+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis+Daudin%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts.</a> Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+non-lobulated+liver+of+adult+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts.</a> Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).</li>
<li>Miodoński, A. J., Bär, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+supply+of+the+choriocapillaris+of+anuran+amphibians+%28Rana+temporaria%2C+Rana+esculenta%29.+Scanning+electron-microscopic+%28SEM%29+study+of+microcorrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts.</a> Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).</li>
<li>Nenni, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%3A+Facilitating+the+use+of+Xenopus+to+model+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease.</a> Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).</li>
<li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus%3A+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li>
<li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+repertoire+in+early+vertebrate+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+gene+expression+in+vertebrate+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 360 (6392), (2018).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+landscape+of+larval+and+adult+Xenopus+laevis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).</li>
<li>AVMA (American Veterinary Medical Association). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals%2C+2020+edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition.</a> AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).</li>
<li>Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupivacaine+as+a+euthanasia+agent+for+African+Clawed+Frogs+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis).</a> PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Heinz-Taheny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+physiology+and+diseases+of+amphibians.+Veterinary+clinics+of+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Clinics+of+North+America.+Exotic+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America.</a> The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).</li>
<li>Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vertebrate+heart%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The vertebrate heart: an evolutionary perspective.</a> Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).</li>
<li>Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+protocol+for+lizards%2C+including+a+method+for+brain+removal%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal.</a> MethodsX. 2, 165-173 (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Este protocolo describe las técnicas tradicionales de disección para acceder a la cavidad celómica. Otras técnicas también son aceptables, siempre que causen un daño mínimo a los tejidos, el corazón sea accesible y el pulmón y el estómago sean visibles. Del mismo modo, la mayoría de las herramientas de disección enumeradas se pueden sustituir fácilmente con elementos comparables.
Si bien se han hecho intentos para optimizar la eficacia de este procedimiento, los resultados pueden variar depend...

La perfusión de todo el cuerpo de los anfibios se completa rutinariamente con fines de preservación y fijación 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos procedimientos ocurren a una velocidad que limita el número de muestras frescas que se pueden tomar por animal. El objetivo de este trabajo es desarrollar un protocolo efectivo de perfusión sanguínea en Xenopus, priorizando la velocidad de la técnica. El protocolo toma menos de 10 min por animal para X. tropicalis y menos de 15 min por X. laevis animal. Las prioridades secundarias son la facilidad de replicación y el uso de equipos fáciles de adquirir para que las muestras de alta calidad puedan compartirse ampliamente entre los laboratorios Xenopus.
Las ranas Xenopus se utilizan ampliamente en la investigación biomédica para estudiar procesos biológicos y patológicos fundamentales conservados en todas las especies. Este tetrápodo tiene una relación evolutiva más cercana con los mamíferos que otros modelos acuáticos, con pulmones, un corazón de tres cámaras y extremidades con dedos. La comunidad internacional utiliza eficazmente Xenopus para obtener una comprensión más profunda de las enfermedades humanas a través de modelos de enfermedades en profundidad y análisis moleculares de la función génica relacionada con la enfermedad. Las numerosas ventajas de Xenopus como modelo animal los convierten en herramientas invaluables para estudiar las bases moleculares del desarrollo humano y la enfermedad; Estas ventajas incluyen: gran tamaño de ovocitos y embriones, alta fecundidad, facilidad de alojamiento, rápido desarrollo externo y facilidad de manipulación genómica. Se ha estimado que Xenopus comparte ~ 80% de los genes identificados de enfermedades humanas7.
En comparación con los modelos populares de mamíferos, Xenopus es un modelo rápido y rentable, con la facilidad de eliminación de morfolinos y la disponibilidad de transgénicos eficientes y mutaciones genéticas dirigidas utilizando CRISPR8. La espectrometría cuantitativa de masas y la transcriptómica unicelular se han aplicado con éxito a embriones de Xenopus9,10, pero un atlas celular reciente de Xenopus laevis muestra que la composición de la mayoría de los tejidos está dominada por los tipos de células sanguíneas 11. Al desarrollar una técnica que exangüe el tejido a un ritmo rápido y utilizando medios refrigerados, la frescura de la muestra se ve mínimamente afectada por la perfusión. Esto es particularmente importante para aplicaciones donde el objetivo es perfilar la expresión de ARNm o proteína fisiológicamente imperturbable.

<table><tbody><tr><td>5x Lupa con luz LED y soporte</td><td>amazon.com</td> luz <td>B08QJ6J8P1</td><td>no debe producir calor</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia desechables</td><td>VWR</td><<td>em>414004-036</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de disección de punta fina</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección afiladas piont, rectas 6,5"</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de disección</td><td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>Las láminas de espuma de poliestireno son una alternativa aceptable</td></tr><tr><td>Contenedor de eutanasia</td><td>Artículo de plástico de EE. UU</td><td>. 2860</td><td>recipientes opacos alternativos aceptables</td></tr><tr><td>Tapa del contenedor de eutanasia</td><td>Artículo de plástico de EE. UU</td><td>.&nbsp; 3047</td><td></td></tr><tr><td>Clavijas de disección fina Living</td><td>Systems Instrumentation</td><td>PIN-#3</td><td></td></tr><tr><td>Agujas hipodérmicas de uso general, 22 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5A</td><td>para X. laevis</td></tr><tr><td>Agujas hipodérmicas de uso general, 25 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>para X. tropicalis</td></tr><tr><td>Heparina, mucosa</td> <td>intestinal porcinaMilliporeSigma</td><td>37-505-410MG</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iridictomía 6"</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>Las tijeras de iris son una alternativa aceptable</td></tr><tr><td>Adaptador Luer a lengüeta macho Luer con anillo de bloqueo</td><td>amazon.com</td><td>B09PTX6M2Z</td><td>tamaño dependerá de la manguera de la bomba utilizada</td></tr> El <tr><td>portaagujas Mayo-Hegar Fisher</td><td>Scinetific</td><td>08-966</td><td>pinzas para mosquitos son una alternativa aceptable</td></tr><tr><td>MS-222: Sincaína (antes tricaína)</td><td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Bomba dosificadora de líquido peristáltica 5&ndash; 100 mL/min</td><td>amazon.com</td><td>B07PWY4SM6</td><td>cualquier bomba peristáltica capaz de bombear 5-10 mL/min es aceptable</td></tr><tr><td>Piedra de afilar</td><td>VWR</td><td>470150-112</td><td>opcional; para agujas desafiladas</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio, en polvo, USP</td><td>Pinza de muestra Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr>, <tr><td>dentada</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>Clavijas en T para diseccionar</td><td>Fisher Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de insulina cortas ultrafinas,</td> cortadores <td>de alambre VWR</td><td>BD328438</td><td></td>de 31 G</tr><tr><td>, cortaúñas de corte lateral ultra afilados y potentes de 6 pulgadas</td><td>amazon.com</td><td>B087P191LP</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusión sanguínea rápida y efectiva en xenopus

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

Xenopus ha sido poderosos organismos modelo para comprender el desarrollo y la enfermedad de los vertebrados durante más de 100 años. Aquí, se define un protocolo de perfusión sanguínea rápida en Xenopus, dirigido a una reducción consistente y drástica de la sangre dentro de todos los tejidos. La perfusión se lleva a cabo insertando una aguja directamente en el ventrículo del corazón y bombeando solución salina tamponada con fosfato heparinizado (PBS) a través del sistema vascular. El procedimiento se puede completar en aproximadamente 10 minutos por animal. La sangre está dominada por unas pocas proteínas y tipos de células muy abundantes, creando numerosos problemas ya que estas proteínas enmascaran la mayoría de las otras moléculas y tipos de células de interés. La caracterización reproducible de tejidos adultos de Xenopus con proteómica cuantitativa y transcriptómica unicelular se beneficiará de la aplicación de este protocolo antes del muestreo de órganos. Los protocolos para el muestreo de tejidos se definen en documentos complementarios. Estos procedimientos están dirigidos a la estandarización de prácticas en Xenopus de diferente sexo, edad y estado de salud, específicamente X. laevis y X. tropicalis.

Después de una perfusión exitosa, todos los tejidos (excluyendo el hígado en Xenopus pigmentado) serán claramente más ligeros y menos saturados de sangre. Los vasos sanguíneos principales se volverán menos notables (Figura 10), y los tejidos (excluyendo el hígado) se enjuagarán limpiamente en el tampón después de ser muestreados. Si bien la ejecución exitosa del protocolo solo puede confirmarse en última instancia por la calidad de los datos de muestras de tejido exsanguinadas, en l...

Aquí se presenta un protocolo efectivo de perfusión sanguínea rápida para preparar muestras de tejido de ranas con garras africanas para estudios de transcriptómica y proteómica.

Perfusión sanguínea rápida y efectiva en Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

Este procedimiento se centra en la utilización humana de los modelos de anfibios de una manera que maximiza la eficiencia. Las prácticas de estandarización se pueden aplicar a las muestras tomadas y conservadas en la colonia de origen, mitigando los riesgos de bioseguridad y eliminando el estrés del transporte de animales. La profusión se puede completar rápidamente, maximizando el tiempo disponible para muestrear tejidos mientras aún están frescos.Esta frescura es especialmente importante para el perfil proteómico y transcriptómico. Este protocolo es detallado y explícito, por lo que es utilizable por personas con una amplia variedad de antecedentes. Esto facilita el intercambio de muestras de alta calidad entre los laboratorios Xenopus.Junto con esta técnica de profusión, se está trabajando en un protocolo igualmente completo para el muestreo estandarizado de todos los órganos principales.

effective-rapid-blood-perfusion-in-xenopus

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Investigación

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Biology

Biología

Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Usando una técnica lipofílica de tinción de perclorato de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina (DiI), Ambystoma mexicanum puede someterse a perfusión vascular para permitir una fácil visualización de la vasculatura.

La perfusión como un método para la visualización vascular<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Aquí presentamos un ensayo de permeabilidad vascular de cerebro de ratón mediante inyección intraperitoneal de trazadores fluorescentes seguido de perfusión que es aplicable a los modelos animales de disfunción de la barrera blood - brain. Una hemi-cerebro se utiliza para evaluar cuantitativamente la permeabilidad y el otro para tracer visualización/immunostaining. El procedimiento toma 5-6 h por 10 ratones.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Normotérmica ex situ corazón perfusión (ESHP), conserva el corazón en un estado semi-fisiológico, paliza. Cuando se realiza en un modo de trabajo, ESHP proporciona la oportunidad de realizar evaluaciones sofisticadas de donantes viabilidad de función y órgano de corazón. Aquí, describimos nuestro método para la evaluación del desempeño miocardio durante ESHP.

Normotérmica Ex Situ corazón perfusión en modo de trabajo: evaluación de la función cardiaca y el metabolismo

Aquí se presenta un protocolo de perfusión vascular materno-fetal ex vivo para permitir la administración de un artículo de ensayo en vasculatura materna y para evaluar la transferencia placentaria de partículas xenobióticas o agentes farmacológicos, además de alteraciones en Fisiología placentaria.

Ex vivo perfusion de la placenta de roedores

Se describe un protocolo para la perfusión in situ de la parte inferior del cuerpo del ratón, incluyendo la vejiga, la próstata, los órganos sexuales, los huesos, los músculos y la piel del pie.

Establecimiento de la perfusión de circuito cerrado en situ de órganos abdominales inferiores y extremidades traseras en ratones

Este artículo presenta una guía para tomar muestras de seis órganos significativos y diversos en Xenopus adultos a los que se puede acceder rápida y fácilmente: el ventrículo cardíaco, el lóbulo hepático, el páncreas, los cuerpos grasos, los riñones emparejados y la piel.

Técnicas para la toma rápida de muestras de seis órganos cruciales en Xenopus adulto

Este protocolo introduce un método rápido para la obtención de imágenes vasculares tridimensionales cuantitativas de montaje completo mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz. La eficacia del método se demuestra utilizando el sistema de arterias de arco faríngeo del modelo de embrión de pollo, con fuerzas hemodinámicas cuantificadas mediante dinámica de fluidos computacional.

Obtención rápida de imágenes de alta resolución de la vasculatura de animales pequeños para estudios cuantitativos

Esta es la primera parte de un protocolo integral de muestreo de Xenopus . Los tejidos muestreados son el ventrículo cardíaco, el tronco arterial, el lóbulo hepático izquierdo, la vesícula biliar, el pulmón, el páncreas, el bazo, la laringe, el esófago, el estómago, los intestinos, los testículos, los cuerpos grasos, el oviducto, los riñones pareados, el plexo ciático, la piel, el timo y todo el ojo.

Técnicas eficientes para el muestreo exhaustivo de tejidos accesibles en xenopus adulto

Aquí, presentamos un protocolo para un sistema de perfusión ex vivo normotérmico modificable de código abierto diseñado para superar el alto costo y la flexibilidad limitada de las plataformas existentes, lo que permite un uso más accesible, rentable e iterativo en la investigación biomédica preclínica.

Un sistema de perfusión normotémica de código abierto diseñado para científicos investigadores

Aprende un protocolo de perfusión sanguínea rápida en Xenopus laevis y Xenopus tropicalis para transcriptómica y proteómica. Este método optimiza la calidad de muestras tisulares con tratamiento humano.

Perfusión sanguínea rápida y efectiva en Xenopus

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