Name: Una técnica tridimensional para la visualización de cambios ultraestructurales mitocondriales en células de cáncer de páncreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a visualizar cambios ultraestructurales mitocondriales en células de cáncer de páncreas mediante microscopía electrónica y reconstrucción 3D. Esta técnica permite análisis cualitativos y cuantitativos de organelos sin equipo costoso.

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Esta investigación contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); Subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82274364, 81673607 y 81774011); así como el Proyecto de Investigación de Bienestar Público de la Subvención de Ciencia y Tecnología de Huzhou (2021GY49, 2018GZ24). Agradecemos la gran ayuda, el soporte técnico y el apoyo experimental de la Plataforma Pública del Centro de Investigación Médica, la Academia de Ciencias Médicas Chinas, la Universidad Médica China de Zhejiang.

1. Preparación del material
<ol><li>Cultivar 2 x 106 células Panc02 en 12 mL de medio DMEM (10% de suero fetal bovino y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina), y mantener a 37 °C y 95% de humedad en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 95% de aire durante 48 h.</li>
	<li>Recoja las células de Panc02, centrifugue a 28 x g durante 2 minutos y luego deseche el sobrenadante. Asegúrese de que la muestra tenga un tamaño adecuado (1 x 107 células), ya que de lo contrario, los siguientes pasos de fijación y deshidratación no funcionarán bien.</li>
	<li>Añadir 1 mL de glutaraldehído al 2,5% como fijador para fijar las células frescas de Panc02 en los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL durante la noche a 4 °C. NOTA: Las muestras deben centrifugarse a 1.006 x g durante 5 min en cada uno de los pasos siguientes (pasos 1.3-1.11).</li>
	<li>Aspire el fijador y enjuague las muestras dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M y, a continuación, enjuague dos veces con agua bidestilada (ddH2O) a temperatura ambiente durante 10 minutos cada una.</li>
	<li>Añadir 50 μl de una solución que contenga tetróxido de osmio al 1% (OsO 4) y ferrocianuro potásico al 1,5% en una proporción de 1:1 a4 °C durante 1 h. A continuación, enjuague dos veces con 0,1 M PBS durante 10 minutos cada vez y enjuague con ddH2O durante otros 10 minutos.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tiocarbohidrazida (TCH) al 1%, incube a temperatura ambiente durante 30 min a 1 h, y luego enjuague con ddH2O cuatro veces durante 10 min cada vez.</li>
	<li>Añadir 50 μL de OsO4 al 1%, fijar a temperatura ambiente durante 1 h y, a continuación, enjuagar con ddH2O cuatro veces durante 10 min cada vez.</li>
	<li>Añadir 1 ml de acetato de uranilo al 2% a 4 °C durante la noche y, a continuación, enjuagar con ddH2O cuatro veces durante 10 min cada vez.</li>
	<li>Añadir 1 ml de solución Walton (0,066 g de nitrato de plomo disuelto en 10 ml de solución madre de ácido aspártico 0,03 mol/L) a 60 °C durante 1 h adicional de incubación.</li>
	<li>Enjuague con ddH 2 O cuatro veces durante 10 minutos cada vez, y luego deshidrate en una serie de alcohol graduado durante 10 minutos cada vez: 50% de alcohol, 70% de alcohol, 80% de alcohol y 90% de alcohol 1 vez, y 100 % de alcohol2veces. Luego, deshidrata en acetona al 100% dos veces durante 10 minutos cada vez. Use 1 ml de cada solución para la deshidratación.</li>
	<li>Mezcle 200 μL de acetona con resina epoxi Pon 812 en una proporción de 3:1, 1:1 y 1:3. Remojar la muestra en resina a temperatura ambiente durante 2 h, 4 h y 4 h, respectivamente, y luego tomar la resina epoxi 100% Pon 812 para impregnar durante la noche. NOTA: Al realizar los pasos de tinción e inclusión de resina, es importante operar en una campana extractora, ya que se trata de sustancias tóxicas. Además, se deben usar batas de laboratorio y guantes resistentes a los solventes durante el experimento.</li>
	<li>Coloque las muestras en un molde de inclusión y luego colóquelas en un horno a 60 °C durante 48 h para polimerizar. Utilice la incrustación plana29 para reducir la apariencia de resina alrededor de la muestra. Esto simplifica la instalación de la muestra y disminuye el impacto de los artefactos de carga en la segmentación posterior de la imagen. NOTA: Para generar posteriormente una superficie de corte horizontal, se puede agregar una pequeña cantidad de resina en el orificio del molde, teniendo cuidado de no llenarlo en exceso.</li>
	<li>Prepare las obleas de silicio lavándolas primero y luego hidrófilándolas con una solución concentrada de H 2 SO4 / H 2 O2durante 30 min. Recoja tiras en rodajas en serie con un grosor de 70 nm en las obleas de silicio hidrofilizado utilizando un ultramicrótomo y séquelas en un horno a 60 °C durante 10 min. NOTA: Capture lentamente la rebanada a medida que la rebanada flota hacia la superficie de las obleas para evitar la pérdida o deformación de la rebanada.</li>
</ol>2. Adquisición de imágenes y reconstrucción tridimensional
<ol><li>Antes de montar una oblea de silicona en el escenario, lave las secciones con agua destilada tres veces y séquelas al aire. Corte una cinta de carbón conductora con un tamaño de 1 cm x 0,5 cm y péguela entre la oblea de silicio y la etapa de muestra SEM para completar la configuración de la muestra (Figura 2E).</li>
	<li>Ajuste el parámetro de tensión de aceleración FE-SEM a 2 kV con una distancia de trabajo de 4 mm (Figura 3B y Tabla 1). NOTA: Para mejorar la relación señal-ruido y reducir el ruido en la imagen, observe con aumentos bajos siempre que sea posible. A medida que aumenta el múltiplo, el rango de escaneo del SEM disminuye, lo que lleva a un aumento en la acumulación de carga en las imágenes.</li>
	<li>Haga clic en el icono H/L en la barra de menú superior. En primer lugar, con un aumento bajo, oriente la primera sección de las tiras de corte de destino y, a continuación, haga clic de nuevo en la opción H/L (Figura 3A) para cambiar al modo de aumento alto; Recopile una imagen adecuada para la estructura de interés ajustando el brillo, el contraste y la ampliación de la imagen.</li>
	<li>Seleccione Vista de proyecto > Datos abiertos e importe los archivos de imagen que se analizarán en el software.</li>
	<li>Alinee las imágenes haciendo clic en Alinear sectores > Editar (Figura 4B) y ajuste el valor de Rango de intensidad en la barra de menú inferior izquierda modificando la transparencia de la imagen. En este caso, utilice una estrategia de alineación semiautomática; Específicamente, a través de la alineación automática, haga que las imágenes se superpongan con una imagen anterior y, a continuación, realice un ajuste fino manual. NOTA: En este trabajo, durante el proceso de alineación, se utilizó la imagen anterior como referencia, y se utilizaron las operaciones de movimiento y rotación para superponer al máximo la estructura objetivo de las dos imágenes. Hacer clic en Alinear par de sectores actual puede ayudar a alinear las imágenes automáticamente, pero puede producirse un mal desplazamiento.</li>
	<li>Seleccione el módulo Extraer subvolumen y recorte los conjuntos de datos alineados para que se ajusten al tamaño de la parte superpuesta de toda la pila.</li>
	<li>En la subsección Segmentación (Figura 4C), seleccione Remuestrear > Segmentación > Guardar. Elija el umbral de la Varita mágica y el tamaño de la herramienta Pincel para seleccionar el rango correcto. Una vez más, adopte un método de segmentación semiautomático usando primero la Varita mágica para seleccionar automáticamente un área grande adecuada y luego use el Pincel para describir con precisión los detalles. NOTA: La varita mágica se puede aplicar para segmentar imágenes en función de las diferencias obvias en la intensidad de píxeles existentes entre la estructura de interés y las estructuras circundantes alterando el valor de Enmascaramiento y utilizando la Línea de límite de dibujo. Es incapaz de distinguir los artefactos de carga generados durante la adquisición de imágenes. Por lo tanto, puede dar lugar a una segmentación incorrecta para las regiones de destino. La herramienta Pincel se puede utilizar para segmentar manualmente y reconstruir con precisión las estructuras biológicas.</li>
	<li>En Segmentación > selección, haga clic en el icono + para agregar el área seleccionada (Figura 4C).</li>
	<li>Repita el paso anterior (2.8) para seleccionar la misma estructura objetivo en diferentes imágenes hasta que se complete la selección para reconstruir las microestructuras de interés. NOTA: Durante los procesos de remodelación mitocondrial, la selección del objeto objetivo debe realizarse a partir de la imagen en medio de un grupo de imágenes secuenciales. Si se selecciona el área requerida de la primera o la última imagen, el resultado de la reconstrucción no podrá presentar una visualización 3D completa.</li>
	<li>Después de completar la segmentación regional, genere el archivo de imagen de acuerdo con los mejores resultados para el tamaño del objeto y la resolución de la imagen. Haga clic en Editor de recorte y, a continuación, introduzca el número 6 en el cuadro Control deslizante virtual (Figura 4C).</li>
	<li>En el menú desplegable de la izquierda, haga clic con el botón derecho en el área gris de la subsección Proyecto y seleccione Generar superficie > Crear > Aplicar. En el archivo generado, utilice el módulo Vista de superficie para crear la estructura de superficie y la representación 3D.</li>
</ol>3. Cuantificación
<ol><li>Haga clic en Eliminar pequeñas manchas > aplicar (Figura 4D). En la subsección Proyecto , haga clic con el botón derecho en el área gris y seleccione Análisis de etiquetas > Aplicar (Figura 4D).</li>
	<li>Personalice el nombre de la columna y elija un grupo de medida. Seleccione Volume3d y Length3d en el cuadro Medidas nativas. </li>
	<li>Haga clic en el botón Aplicar en la esquina inferior izquierda de la pantalla. Copie los datos y grafique en el software estadístico, como GraphPad.</li>
</ol>

Técnica 3D para visualizar crestas mitocondriales en células de cáncer de páncreas

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El método que aquí se presenta es una guía útil paso a paso para aplicar la técnica de reconstrucción 3D, que implica la aplicación de microscopía electrónica y tecnología de procesamiento de imágenes al apilamiento y segmentación de imágenes tomográficas 2D generadas a partir de secciones ultrafinas en serie. Este protocolo pone de relieve una limitación de las imágenes 2D que puede abordarse mediante la visualización en 3D de la ultraestructura del orgánulo, que tiene las ventajas de una fuerte reproducibilidad de las ...

Las mitocondrias son uno de los orgánulos más importantes de la célula. Sirven como eje central de la bioenergética celular y el metabolismo 1,2 y desempeñan un papel fundamental en el cáncer3. El cáncer de páncreas (CP) es unode los cánceres más difíciles de tratar debido a su rápida propagación y alta tasa de mortalidad. La disfunción mitocondrial, que es causada principalmente por cambios en la morfología mitocondrial 3,5,6,7, se ha relacionado con los mecanismos de enfermedad subyacentes al PC8. Las mitocondrias también son altamente dinámicas, lo que se refleja en los cambios frecuentes y dinámicos en su conectividad de red y estructura de crestas9. La remodelación de la estructura de las crestas puede afectar directamente la función mitocondrial y el estado celular 10,11, que se alteran significativamente durante el crecimiento de las células tumorales, la metástasis y los cambios en el microambientetumoral 12,13.
En los últimos años, los científicos han estudiado este orgánulo mediante la observación EM14,15,16,17; por ejemplo, los investigadores han analizado la dinámica mitocondrial utilizando técnicas de reconstrucción 3D 6,7,18,19. El concepto general y el método para la reconstrucción 3D de imágenes de microscopía electrónica se establecieron formalmente ya en 196820 e implicaron la combinación de microscopía electrónica, difracción de electrones y procesamiento de imágenes por computadora para reconstruir la cola del fago T4. Hasta ahora, la tecnología de imágenes 3D de microscopía electrónica ha logrado avances significativos en términos de resolución de imagen 21, grado de automatización22 y volumen de procesamiento 23 y se ha utilizado a una escala cada vez más amplia en la investigación biológica, desde el nivel de tejido hasta el nivel de ultraestructura de orgánulos a escala nanométrica24. En los últimos años, la microscopía electrónica en 3D también se ha convertido en una tecnología prometedora para una amplia gama de aplicaciones25,26,27.
La creciente atención a las crestas mitocondriales ilustra particularmente los requisitos esenciales para la obtención de imágenes de volumen ultraestructural. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se ha utilizado para visualizar muestras recogidas en una rejilla de cobre (malla 400)28, con el haz de electrones pasando a través de la sección. Sin embargo, debido al alcance limitado de la rejilla de cobre, es imposible obtener imágenes completas de cortes continuos de la misma muestra29. Esto complica el estudio de las estructuras diana durante la obtención de imágenes TEM. Además, la TEM se basa en tareas manuales que consumen mucho tiempo y son propensas a errores, como cortar y recoger múltiples cortes y obtener imágenes de ellas secuencialmente21, por lo que no está adaptado para reconstrucciones ultraestructurales de muestras de gran volumen23. En la actualidad, la reconstrucción de alta resolución de imágenes de muestras de gran volumen se logra mediante el uso de equipos especializados, como el conjunto de cámaras TEM (TEMCA)30 o dos sistemas TEMCA de segunda generación (TEMCA2)31, que permiten obtener imágenes automatizadas de alto rendimiento en poco tiempo. Sin embargo, este tipo de imágenes no tiene la ventaja de ser fácil de obtener y universal debido a la necesidad de equipos personalizados.
En comparación con TEM, el método para generar automáticamente miles de imágenes volumétricas en serie para grandes áreas basado en SEM 32,33 mejora la eficiencia y la fiabilidad de las imágenes en serie y ofrece resoluciones z más altas34. Por ejemplo, la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBF-SEM) y la microscopía electrónica de barrido por haz de iones focalizado (FIB-SEM) han hecho posible lograr la reconstrucción 3D de la ultraestructura con alta velocidad, eficiencia y resolución35,36. Sin embargo, es inevitable que la superficie del bloque se corte mecánicamente con la cuchilla de diamante del SBF-SEM o con el fresado con el haz de iones enfocado del FIB-SEM33,37. Debido a la destructividad de los dos métodos para las muestras, no es posible reconstruir la misma estructura objetivo para su posterior análisis38,39,40. Además, pocos estudios han intentado reconstruir la ultraestructura de orgánulos 3D de las células cancerosas utilizando EM para observar cambios patológicos12. Por estas razones, con el fin de dilucidar aún más los mecanismos patológicos de las células cancerosas, como las células de cáncer de páncreas, proponemos una tecnología novedosa para la reconstrucción 3D de imágenes de sección seriada utilizando un ultramicrótomo y un microscopio electrónico de barrido por emisión de campo (FE-SEM) para analizar la ultraestructura mitocondrial a nivel de crestas; Con esta tecnología, se pueden adquirir datos de alta resolución utilizando un método eficiente y accesible. Las secciones ultrafinas en serie realizadas con un ultramicrótomo pueden almacenarse de forma semipermanente en una caja de rejilla y volver a crear imágenes varias veces, incluso después de varios años41. FE-SEM es muy valorada como herramienta en diversos campos de investigación debido a su capacidad para proporcionar imágenes de alta resolución, gran aumento y versatilidad42. En un intento de mostrar la estructura fina de los orgánulos en 3D, la técnica para producir pilas de imágenes 2D en serie con una resolución útil utilizando electrones retrodispersados producidos por FE-SEM 43,44 también se puede utilizar para lograr imágenes de alto rendimiento y multiescala de las regiones objetivo o sus estructuras asociadas sin equipo especial 45. La generación de artefactos de carga afecta directamente a la calidad de las imágenes adquiridas, por lo que es especialmente importante que el tiempo de permanencia sea corto.
Por lo tanto, el presente estudio profundiza en los procedimientos experimentales empleados en esta técnica SEM para reconstruir la estructura 3D de las crestas mitocondriales46. En concreto, mostramos el proceso desarrollado para conseguir la segmentación semiautomática de las regiones mitocondriales y digitalizar la reconstrucción 3D mediante el software Amira, que también implica la realización de muestras de corte mediante el método convencional de preparación de muestras OTO44,47, la finalización de la recogida de cortes mediante corte ultramicroscópico y la adquisición de datos secuenciales 2D mediante FE-SEM.

<table><tbody><tr><td>(1S,3R)-RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A Acetona</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SIGMA</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td>2020.2</td></tr><tr><td>Ácido aspártico</td><td>MCE</td><td>HY-42068</td><td></td></tr><tr><td>Águila modificada de Dulbecco' s medio</td><td>Gibco</td><td>11995115</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck 100983</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatina-1</td><td>MCE</td><td>HY-100579</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido por emisión de campo</td><td>HITACHI</td><td>SU8010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Alfa</td><td>Aesar A10500.22</td><td></td></tr><tr><td>Plomo nitrato</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-211724</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de Osmio</td><td>SANTA CRUZ</td><td>sc-206008B</td><td></td></tr><tr><td>Panc02</td><td>Colección Europea de Cultivos Celulares Autentificados&nbsp;</td><td></td><td></td>98102213</tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Biosharp</td><td>BL505A</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>Pon 812 Resina epoxi</td><td>SPI CHEM</td><td>GS02660</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianuro de potasio</td><td>Macklin</td><td>P816416</td><td></td></tr><tr><td>Tiocarbohidrazida</td><td>Merck</td><td>223220</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>LEICA</td><td>EMUC7</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Uranilo</td><td>RHAWN R032929</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una técnica tridimensional para la visualización de cambios ultraestructurales mitocondriales en células de cáncer de páncreas

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

Comprender las características dinámicas de la ultraestructura del orgánulo celular, que no solo es rica en información desconocida sino también sofisticada desde una perspectiva tridimensional (3D), es fundamental para los estudios mecanicistas. La microscopía electrónica (EM) ofrece una buena profundidad de imagen y permite la reconstrucción de pilas de imágenes de alta resolución para investigar la morfología ultraestructural de los orgánulos celulares incluso a escala nanométrica; por lo tanto, la reconstrucción 3D está ganando importancia debido a sus ventajas incomparables. La microscopía electrónica de barrido (SEM) proporciona una tecnología de adquisición de imágenes de alto rendimiento que permite reconstruir grandes estructuras en 3D a partir de la misma región de interés en cortes consecutivos. Por lo tanto, la aplicación de SEM en la reconstrucción 3D a gran escala para restaurar la verdadera ultraestructura 3D de los orgánulos es cada vez más común. En este protocolo, sugerimos una combinación de técnicas seriadas de corte ultrafino y reconstrucción 3D para estudiar las crestas mitocondriales en células de cáncer de páncreas. Los detalles de cómo se realizan estas técnicas se describen en este protocolo paso a paso, incluido el método de osmio-tiocarbohidrazida-osmio (OTO), la obtención de imágenes de sección ultrafina en serie y la visualización de la pantalla.

Durante el cultivo celular (Figura 1A), primero dividimos las células de cáncer de páncreas en un grupo control cultivado con medio de cultivo completo, un grupo (1S,3R)-RSL348 (RSL3, un activador de la ferroptosis, 100 nM) y un grupo RSL3 (100 nM) más ferrostatina-149 (Fer-1, un inhibidor de la ferroptosis, 100 nM). A través de los pasos experimentales anteriores, el microscopio electrónico de barrido adquirió 38 (Figura suplementaria 1), 43 (...

Este protocolo describe cómo reconstruir las crestas mitocondriales para lograr imágenes 3D con alta precisión, alta resolución y alto rendimiento.

Una técnica tridimensional para la visualización de cambios ultraestructurales mitocondriales en células de cáncer de páncreas

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Este proyecto tiene como objetivo revisar el efecto anticancerígeno de los fármacos mediante el cambio de la estructura a nivel subcelular a nanoescala, y establecer el vínculo entre la morfología de los orgánulos y el mecanismo patológico del cáncer. Esta tecnología combina la tecnología tradicional de microscopía electrónica con la tecnología de reconstrucción tridimensional sin necesidad de equipos especiales. En comparación con otras técnicas, puede mejorar la eficiencia de la imagen y la flexibilidad de la reconstrucción, y la reconstrucción en la vida real de las estructuras objetivo en cualquier momento.Así que es muy fácil y universal. Esta tecnología de reconstrucción tridimensional de los portaobjetos ultrafinos continuos puede restaurar repetidamente el estereoquímico real sin necesidad de un equipo específico y costoso. Se puede utilizar para el análisis cualitativo y cuantitativo de todos los orgánulos en cualquier momento.Se da cuenta de la fácil operación de la observación.

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