Name: Análisis de la densidad mitocondrial y la distribución longitudinal en fibras musculares vivas de rata mediante microscopía confocal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprende a analizar la densidad y distribución mitocondrial en fibras musculares vivas de rata mediante microscopía confocal. Este protocolo cuantitativo revela diferencias entre condiciones fisiológicas y patológicas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo contó con el apoyo de la Facultad de Medicina y el Instituto de Investigación de la Obesidad del Tecnológico de Monterrey. La Figura 3A fue creada con el software Scientific Image and Illustration.

Análisis microscópico confocal de las mitocondrias del músculo de la rata

<ol><li>Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+dynamic+mitochondrial+network%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Shaping the dynamic mitochondrial network.</a> BMC Biology. 12, 35(2014).</li>
<li>De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondria in health and disease.</a> Cell Calcium. 94, 102357(2021).</li>
<li>Chang, C. R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+mitochondrial+fission+through+modification+of+the+dynamin-related+protein+Drp1%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).</li>
<li>Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+specialization+of+mitochondrial+form+and+function+in+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305(2021).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+subpopulations+and+heterogeneity+revealed+by+confocal+imaging%3A+possible+physiological+role%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).</li>
<li>Díaz-Vegas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+increase+induced+by+RyR1+and+IP3R+channel+activation+after+membrane+depolarization+regulates+skeletal+muscle+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism.</a> Frontiers in Physiology. 9, 791(2018).</li>
<li>Boncompagni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+linked+to+calcium+stores+in+striated+muscle+by+developmentally+regulated+tethering+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).</li>
<li>Reggiani, C., Marcucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controversial+issue%3A+Can+mitochondria+modulate+cytosolic+calcium+and+contraction+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167(2022).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 26(2011).</li>
<li>Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+T-tubules+and+sarcoplasmic+reticulum+in+ventricular+myocytes+in+early+cardiac+hypertrophy+in+a+pressure+overload+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).</li>
<li>Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+role+of+T-tubules+disruption+and+decreased+SERCA2+on+contractile+dynamics+of+isolated+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes.</a> Life Sciences. 264, 118700(2021).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphaned+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Orphaned ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Houzelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+mitochondrial+dynamics+in+relation+to+oxidative+capacity+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity.</a> Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).</li>
<li>Call, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulk1-mediated+autophagy+plays+an+essential+role+in+mitochondrial+remodeling+and+functional+regeneration+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).</li>
<li>Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+network+dynamics+in+metabolic+disorders+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).</li>
<li>Rivera-Alvarez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+session+of+physical+activity+restores+the+mitochondrial+organization+disrupted+by+obesity+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers.</a> Life Sciences. 256, 117965(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeconvolutionLab2%3A+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes%2C+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li>
<li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%2C+mitochondrial+homeostasis%2C+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467(2020).</li>
<li>Meinild, L. A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+training+increases+skeletal+muscle+mitochondrial+volume+density+by+enlargement+of+existing+mitochondria+and+not+de+novo+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis.</a> Acta Physiologica. 222 (1), (2018).</li>
<li>Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+mitochondrial+health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exercise and mitochondrial health.</a> Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).</li>
<li>Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+remodeling+in+exercise+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases.</a> Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).</li>
<li>Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+structure+and+function+in+rat+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers.</a> Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).</li>
<li>Vincent, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+mitochondrial+ultrastructural+defects+in+mitochondria+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy.</a> Scientific Reports. 6, 30610(2016).</li>
<li>Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+is+a+distinguishing+feature+of+skeletal+muscle+fiber+types+and+regulates+organellar+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization.</a> Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).</li>
<li>Cheng, A. J., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation%2C+and+measurement+of+force+and+myoplasmic+free+%5BCa2%2B%5D+in+fully+intact+single+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function%2C+structure%2C+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252(2022).</li>
<li>Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22In%3A+Pawley%2C+J.+%28eds%29+Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer, Boston, MA. (2006).</li>
<li>Otsu, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+selection+method+from+gray-level+histogram%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+System+Man+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Threshold selection method from gray-level histogram.</a> IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Brüser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+mitochondria+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of mitochondria at the nanoscale.</a> Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Las mitocondrias son orgánulos con una alta capacidad de remodelación. Su contenido, densidad y distribución pueden modificarse rápidamente a través de la activación de los mecanismos de fusión y fisión mitocondrial, conocidos como dinámica mitocondrial1, y el equilibrio entre los mecanismos de recambio mitocondrial: la biogénesis mitocondrial y la vía especializada de degradación de las mitocondrias, mitofagia21,22. El contenido y la morfología mitocondrial pueden variar según el tipo de célula y la etapa de desarrollo y pueden ser remodelados bajo diferentes estímulos fisiológicos y patológicos 17,22,23,24. Por lo tanto, el estudio de la morfología mitocondrial ha sido relevante durante más de medio siglo25. Cabe destacar que el análisis de las mitocondrias a través de microscopía electrónica ha sido la técnica estándar aplicada en múltiples estudios26.
Los estudios fluorescentes por microscopía confocal han ganado relevancia en los últimos años debido a su capacidad para obtener imágenes de células vivas de mitocondrias a diferentes profundidades de fibra, lo que podría ayudar a comprender mejor el papel de las mitocondrias en el músculo esquelético en diferentes condiciones adaptativas y desadaptativas27. En este estudio se describe una metodología para el análisis de la densidad y distribución mitocondrial en fibras musculares esqueléticas vivas mediante microscopía confocal. Uno de los principales desafíos de trabajar con fibras musculares esqueléticas vivas es evitar la contracción desde los procesos de aislamiento hasta el registro confocal mitocondrial. Para lograr este objetivo, se utiliza una solución17 de Relax con alto contenido de Mg y ATP para mantener las fibras relajadas durante al menos 2 h, lo que da tiempo suficiente para llevar a cabo el proceso de aislamiento de fibras, la carga de fluoróforos y la adquisición de la señal mitocondrial por microscopía confocal. Un punto crítico del protocolo es la obtención mecánica de las fibras, ya que requiere de alta precisión y tejido fresco; Sin embargo, es posible obtener haces de fibras viables a partir del músculo de rata con esta técnica previamente utilizada y reportada28. La obtención de fibras intactas permite preservar el sarcolema y el ambiente intracelular, manteniendo la diafonía metabólica y funcional entre las estructuras celulares28,29.
A diferencia del trabajo con tejidos o células fijas, la adquisición de imágenes fluorescentes de células vivas mediante microscopía confocal permite monitorizar en tiempo real el efecto de diversas condiciones experimentales. El presente protocolo se puede utilizar para explorar los cambios en la densidad y distribución mitocondrial en tiempo real y explorar las diferencias entre los grupos experimentales, como los ejemplos presentados aquí entre las fibras derivadas de Lean y Ob (Figura 3 y Figura 4). Siempre se debe tener en cuenta que la obtención de imágenes de células vivas implica la estandarización de condiciones óptimas de trabajo con un daño celular menor. El tiempo de trabajo, la calidad de las soluciones utilizadas, los parámetros de adquisición y la exposición de los láseres deben controlarse con precisión. Por lo tanto, a continuación se mencionan consideraciones esenciales.
Las mitocondrias de las fibras musculares no se pueden registrar completamente longitudinalmente mediante microscopía confocal debido al tamaño de la fibra y al daño de la fibra que puede causar la exposición prolongada al láser. Sin embargo, bajo esta técnica se registra una muestra representativa de la fibra. Aunque es posible registrar todo el espesor de la fibra muscular esquelética de una rata mediante microscopía confocal, esto implica un mayor tiempo de registro y exposición al rayo láser. En el caso de las ratas de control, no se han encontrado problemas con estas grabaciones. Sin embargo, las fibras de condiciones patológicas pueden ser más susceptibles al daño, como se observa en las fibras de ratas Ob. En consecuencia, se prefiere adquirir una pila de imágenes confocales representativas obtenidas a diferentes distancias Z. Cuando solo se registra una sección de espesor de fibra, se recomienda tomar la pila a la misma profundidad en todas las fibras ensayadas, ya que la distribución y densidad mitocondrial puede variar según su posición dentro de la fibra. Se recomienda la adquisición de la señal a una profundidad superior a 15 μm para obtener imágenes confocales representativas de IMF, evitando las poblaciones de MUS que se sitúan cerca de la periferia.
Durante la adquisición confocal, se deben tener en cuenta algunas consideraciones importantes. En primer lugar, la selección de la lente del objetivo de inmersión teniendo en cuenta el aumento, la alta NA y el medio de inmersión. Dado que las células se mantienen en un medio de incubación hidrófilo, el índice de refracción del medio de incubación e inmersión debe ser similar para obtener una buena señal y escanear profundamente en el tejido. Por lo general, se logra con una lente de objetivo de inmersión en agua. Las imágenes confocales de la Figura 3 y la Figura 4 se adquirieron con un objetivo de inmersión en agua de 20x y 0,7 NA. Este objetivo permite el registro de la fibra en toda su profundidad, pero se decidió el barrido a 15, 18 y 21 μm ya que se pueden obtener imágenes confocales representativas de IMF con señal de alta intensidad de fluorescencia y menor daño a la fibra. Se pueden considerar otros aumentos, como 40x y aceite como medio de inmersión, pero deben evaluarse.
En segundo lugar, el tamaño de píxel para la adquisición de imágenes se calcula de acuerdo con el teorema de Nyquist, que permite la selección de un tamaño de píxel apropiado que evita la sobremuestrea (mayor exposición al láser) y la submuestra (conduce a una menor resolución)30. El cálculo depende de las características de la lente del objetivo seleccionada y de la longitud de onda (~90 nm). Se puede ajustar con el zoom; Por lo tanto, solo una configuración de zoom proporciona un tamaño de píxel óptimode 30. Sin embargo, en la práctica, el zoom también depende de la zona de la muestra a analizar. Así, encontrar el equilibrio permite trabajar con un tamaño de píxel que se acerque más al criterio de Nyquist y que además se ajuste al área a analizar. La Figura 3 y la Figura 4 se adquirieron con un tamaño de píxel de 150 y 190 nm, lo que permitió analizar el ancho total de la fibra, que es de ~50-80 μm.
En tercer lugar, se debe utilizar un diámetro de agujero de alfiler adecuado que evite que la luz desenfocada llegue al detector. Normalmente, 1 Airy se considera el tamaño óptimo de estenopeico, ya que permite la detección de ~80% de los fotones que se originan en el plano de enfoque30. Sin embargo, algunas muestras biológicas teñidas que muestran bajos niveles de fluorescencia requieren un aumento estenopeico30. Las imágenes confocales de la Figura 3 y la Figura 4 se adquirieron con un tamaño estenopeico de 3 Airy debido a una señal baja capturada con un Airy más bajo. Es importante tener en cuenta que el aumento de la intensidad de la señal resultante del aumento del tamaño del estenopeico conduce a la reducción de la resolución debido al aumento de la luz capturada desenfocada. Por esta razón, recomendamos usar un tamaño de agujero de alfiler lo más cercano posible a 1 aireado.
Cuando se adquieren adecuadamente, las imágenes confocales pueden procesarse para obtener información cuantitativa sobre la densidad y distribución mitocondrial. En cualquier caso, el paso crítico de la imagen de procesamiento de los umbrales debe realizarse antes del análisis para mejorar la cuantificación de la señal. Durante este paso crucial, se define el valor de intensidad de fluorescencia que separa los píxeles positivos de las mitocondrias de los del fondo. El umbral se puede definir mediante un ajuste gaussiano del pico que representa las mitocondrias cuando el histograma de la imagen muestra dos picos, uno correspondiente al fondo y el otro a las mitocondrias. Sin embargo, no siempre se consigue una distribución bimodal en cada una de las imágenes, por lo que hay que aplicar otros métodos de umbral.
En este protocolo, se describe la implementación del umbral de Otsu, que es un método no paramétrico y no supervisado diseñado para encontrar el valor umbral cuando los dos picos no están separados, u otros picos están presentes31. Otsu se puede aplicar fácilmente utilizando una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas; sin embargo, se pueden probar otros métodos de umbral. Se debe aplicar el mismo método de umbral a todas las imágenes confocales y debe calcularse de forma independiente para cada imagen confocal. Aplicar el umbral a una pila completa conduce a resultados incorrectos. Una vez obtenidas las imágenes binarias tras el proceso de umbralización, se puede realizar fácilmente el análisis de la densidad mitocondrial y de la FFT siguiendo las instrucciones descritas en este protocolo. Sin embargo, se debe tener cuidado al realizar ambos análisis para evitar incluir núcleos y capilares, ya que daría lugar a errores de cuantificación. En cuanto a la densidad, basta con restar los píxeles, o el área ocupada por los núcleos o capilares, a los píxeles o área total a analizar. Además, al realizar el análisis FFT, se debe verificar que la señal mitocondrial sea recta. Por el contrario, cuando la señal mitocondrial está inclinada, puede producir perfiles que no representan la distribución longitudinal mitocondrial, lo que produce datos incorrectos del espectro FFT. Además, se puede aplicar un paso de preprocesamiento para reducir el ruido en las imágenes. Este protocolo describe dos pasos de preprocesamiento opcionales mediante un filtro mediano y deconvolución 2D. Los efectos de estos métodos de preprocesamiento sobre la imagen y el contenido de densidad mitocondrial se presentan en la Figura Suplementaria S1. Es importante tener en cuenta que, si bien estos preprocesos pueden mejorar la calidad de la imagen, también pueden provocar la pérdida de ciertos detalles de la imagen. Por lo tanto, deben usarse con precaución y aplicarse de manera consistente a todas las imágenes que se analizan.
A pesar de sus ventajas, la microscopía confocal está limitada por una resolución lateral (XY) de 180-250 nm cuando se dan las condiciones óptimas para su adquisición32. El diámetro mitocondrial es de ~200-700 nm, cerca del límite de difracción de la microscopía confocal; por lo tanto, las estructuras submitocondriales no pueden ser detectadas adecuadamente33 y no pueden ser evaluadas por los análisis de densidad y FFT que se muestran en este protocolo. Se pueden explorar otras técnicas de microscopía de superresolución, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), la nanoscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED) o la microscopía de iluminación estructurada (SIM), para resolver estructuras submitocondriales32. En este protocolo, las imágenes confocales de las mitocondrias se obtienen utilizando el fluoróforo TMRE, que depende del potencial de membrana mitocondrial. Por lo tanto, la intensidad fluorescente mitocondrial puede variar según su potencial de membrana. Se realiza un proceso de umbral antes del análisis de datos para superar este problema. Todos los píxeles por encima de un umbral definido se consideran positivos para la señal mitocondrial independientemente de su valor de fluorescencia. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las mitocondrias con un potencial de membrana muy bajo no pueden resolverse con esta técnica. Por lo tanto, se recomiendan estudios complementarios de cuantificación del contenido de proteínas mitocondriales. Una ventaja del uso de TMRE es que las imágenes confocales también se pueden utilizar para el análisis del potencial de membrana mitocondrial, pero es necesario realizar controles adecuados con agentes de desacoplamiento como la carbonilcianuro-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP). Además, las instrucciones para el análisis de la densidad y distribución mitocondrial se pueden lograr utilizando indicadores fluorescentes verdes para las mitocondrias, que cargan las mitocondrias independientemente de su potencial de membrana, pero la estrategia de incubación y los ajustes de adquisición confocal deben estandarizarse.
Dado que la estructura de las mitocondrias está relacionada con funciones mitocondriales y celulares esenciales, el protocolo descrito aquí puede proporcionar información valiosa sobre su remodelación durante la enfermedad o por un daño de estrés particular. Podría contribuir a una mejor comprensión de las funciones clave del músculo esquelético gobernado por las mitocondrias, como la producción de energía, o en las que las mitocondrias juegan un papel importante en la interacción con otros orgánulos, como el acoplamiento contracción-metabolismo. Seguir las instrucciones del protocolo permite estimar la densidad mitocondrial y la distribución en el músculo esquelético vivo. Los pasos del protocolo se dividen en tres etapas principales centradas en la disección del haz muscular esquelético, la exploración con microscopía confocal y el análisis de imágenes, donde se incluyen instrucciones detalladas y consideraciones importantes. En particular, el protocolo se puede optimizar aún más para explorar pasos Z adicionales para la reconstrucción mitocondrial completa dentro de la fibra de acuerdo con las necesidades del usuario. Por ejemplo, los pasos de imagen y análisis confocal se pueden probar para estudiar estructuras celulares con una distribución similar, como TT en muestras vivas y fijas.

Las mitocondrias forman redes altamente dinámicas que están reguladas principalmente por el equilibrio entre su elongación (fusión) y fragmentación (fisión)1,2, que son moduladas por la expresión y actividad de proteínas como la Mitofusina 1 y 2 (Mfn1 y Mfn2), y la atrofia de la proteína óptica 1 (Opa1), que regulan la fusión de la membrana mitocondrial externa y la membrana interna, respectivamente 1,2. La proteína relacionada con la dinamina (Drp1) regula predominantemente la fisión mitocondrial cuando se fosforila en el Ser6163.
En el músculo esquelético, se ha establecido que la red mitocondrial está organizada en subpoblaciones estructuralmente bien definidas en función de su proximidad a diferentes regiones celulares (miofibrillas, sarcolemas y núcleos)4,5. Las mitocondrias ubicadas justo debajo del sarcolema se denominan mitocondrias subsarcolemales (SSM), las ubicadas entre los filamentos contráctiles se denominan mitocondrias intermiofibrilares (IMF) y la subpoblación mitocondrial alrededor de los núcleos se denomina red mitocondrial perinuclear (PMN). Además, se ha sugerido que estas subpoblaciones mitocondriales tienen funciones específicas de la región y están metabólicamente especializadas 4,5.
El mantenimiento de la homeostasis energética celular, que permite la función metabólica y contráctil, depende en gran medida de la interacción y comunicación en sitios específicos a través de la red mitocondrial (por ejemplo, interacción IMF y SSM)4,6. Además de las interacciones de la red mitocondrial, la mitocondria también puede interactuar con otros orgánulos, formando complejos estructurales y funcionales. En este sentido, se ha demostrado que la IMF puede localizarse adyacente al retículo sarcoplásmico (RS) y en las proximidades de las unidades de liberación de Ca2+ (CRU), formadas por los túbulos transversales (TT)7. Este hecho es relevante debido al papel de la captación mitocondrial de Ca2+ en la regulación de la síntesis de ATP y la apoptosis. Recientemente, también se ha sugerido un papel potencial en la regulación de los transitorios citosólicos de Ca2+ 8.
Las TT son invaginaciones de sarcolema que tienen una distribución periódica a lo largo del eje longitudinal de los cardiomiocitos y las fibras del músculo esquelético 9,10, similar a la distribución IMF 5. Los cambios en la distribución de los TT tienen importantes implicaciones fisiológicas, dado su papel en la función contráctil. Sin embargo, estos cambios se han evaluado principalmente en cardiomiocitos. El uso del análisis de la transformada rápida de Fourier (FFT) permite la conversión de señales periódicas del dominio de la distancia al dominio de la frecuencia, lo que da como resultado un espectro FFT que indica la frecuencia y la regularidad de la señal11,12,13. A pesar de que existe evidencia de que la organización de la red mitocondrial en las fibras del músculo esquelético es esencial para la adaptación a diferentes condiciones metabólicas, como durante la regeneración después de una lesión muscular14,15, la mayoría de los análisis se realizan cualitativamente.
Además, dado que la disfunción mitocondrial se ha asociado con varias enfermedades relacionadas con el músculo esquelético (p. ej., atrofia por desuso)2 y no musculares, en particular enfermedades metabólicas, y la pérdida de masa muscular asociada (es decir, atrofia)16, la evaluación cuantitativa de la red mitocondrial y la distribución en el músculo esquelético cobra relevancia. Recientemente, se ha observado una diferencia significativa en la distribución longitudinal de las mitocondrias de las fibras musculares gastrocnemias entre un grupo obeso (Ob; Zucker fa/fa rats), y un grupo magro (Lean; Zucker +/+ ratas) se identificó a través de FFT17. Este estudio demostró la utilidad de la FFT en el análisis de la distribución mitocondrial. Por lo tanto, este protocolo presenta una metodología para estudiar las mitocondrias en fibras musculares esqueléticas vivas a partir de imágenes obtenidas por microscopía confocal de fluorescencia. La densidad mitocondrial se cuantifica mediante umbrales de fondo, y también se describe el análisis de la distribución mitocondrial longitudinal mediante análisis FFT. En la Figura 1 se presenta un esquema de flujo de trabajo.

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato hidrato de sal disódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio de borosilicato</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0709</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Software de microscopio confocal Leica Application Suite&nbsp;</td><td>Leica</td><td>2.7.3.9723</td><td></td></tr><tr><td>Creatina Fosfoquinasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)</td><td>Grupo de Imágenes Biomédicas, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/</td><td></td></tr> <tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ácido aspártico potasio saturado hemihidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11240</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&agudo; Ácido N&agudo;-tetraacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Miltex</td><td>MH-18</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objetivo&nbsp;</td><td>Leica</td><td>506517</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris</td><td>Miltex</td><td>5-304</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-(-)-málico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico sal monosódica hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Maxchelator</td>, <td>https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm&nbsp de Salud de UC Davis</td><td>;</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras</td><td>Miltex</td><td>18-1633</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas Fiji&nbsp;</td><td>Público, mantenido por el grupo Eliceiri/LOCI, el grupo Jug y el laboratorio Tomancak. Fiji</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td></tr> <tr><td>Hidrato de sal disódica de fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Generador de PSF (PSF_Generator.jar)</td><td>Grupo de Imágenes Biomédicas, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de grabación</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de cálculo Microsoft Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, éster etílico</td><td>Invitrogen</td><td>T669</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de la densidad mitocondrial y la distribución longitudinal en fibras musculares vivas de rata mediante microscopía confocal

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

La mitocondria es un orgánulo que puede alargarse, fragmentarse y renovarse según los requerimientos metabólicos de las células. La remodelación de la red mitocondrial permite que las mitocondrias sanas satisfagan las demandas celulares; Sin embargo, la pérdida de esta capacidad se ha relacionado con el desarrollo o progresión de diferentes patologías. En el músculo esquelético, se observan cambios en la densidad y distribución mitocondrial en condiciones fisiológicas y patológicas como el ejercicio, el envejecimiento y la obesidad, entre otras. Por lo tanto, el estudio de la red mitocondrial puede proporcionar una mejor comprensión de los mecanismos relacionados con esas condiciones.
Aquí, se describe un protocolo para la obtención de imágenes mitocondriales de fibras musculares esqueléticas vivas de ratas. Las fibras se diseccionan manualmente en una solución relajante y se incuban con un indicador fluorescente de imágenes de células vivas de las mitocondrias (éster etílico de tetrametilrodamina, TMRE). La señal mitocondrial se registra mediante microscopía confocal utilizando el modo de escaneo XYZ para obtener imágenes confocales de la red mitocondrial intermiofibrilar (IMF). Después de eso, las imágenes confocales se procesan mediante umbrales y binarización. La imagen confocal binarizada tiene en cuenta los píxeles positivos de las mitocondrias, que luego se cuentan para obtener la densidad mitocondrial. La red mitocondrial en el músculo esquelético se caracteriza por una alta densidad de población IMF, que tiene una distribución longitudinal periódica similar a la de los túbulos T (TT). La Transformada Rápida de Fourier (FFT) es una técnica de análisis estándar realizada para evaluar la distribución de TT que permite encontrar la frecuencia de distribución y el nivel de su organización. En este protocolo se describe la implementación del algoritmo FFT para el análisis de la distribución mitocondrial longitudinal en músculo esquelético.

Siguiendo el presente protocolo, se puede lograr el análisis de la densidad y distribución de las mitocondrias en músculo esquelético vivo. El protocolo se divide en tres etapas principales: disección del haz muscular esquelético, exploración por microscopía confocal y análisis de imágenes. La descripción general del flujo de trabajo se presenta en la Figura 1. La Figura 2A muestra un músculo gastrocnemio de rata entero en una placa de Petri, marcando la cabeza lateral de la que se obtienen las fibras, mientras que la Figura 2B muestra los haces de fibras en la solución Relax. Mediante microscopía confocal, se pueden registrar las mitocondrias a lo largo de la profundidad de la fibra muscular esquelética viva utilizando el indicador fluorescente TMRE. TMRE es un fluoróforo catiónico lipofílico que se acumula selectivamente dentro de las mitocondrias de acuerdo con el potencial de membrana mitocondrial20.
Se puede obtener una imagen confocal óptima de IMF seleccionando una distancia Z superior a 15 μm de profundidad dentro de la fibra (Figura 3A). La Figura 3B muestra imágenes confocales XY representativas de mitocondrias cargadas con TMRE adquiridas a lo largo de la distancia Z de las fibras musculares gastrocnemias (15 a 21 μm). Las imágenes confocales se procesaron mediante umbral para transformarlas en imágenes binarias que permitieran el análisis mitocondrial. La Figura 3B (panel izquierdo) muestra una fibra de una rata Lean ejercitada. Representa un registro confocal esperado de las mitocondrias de la fibra del músculo esquelético, ya que tiene un patrón consistente a lo largo de la fibra. Por el contrario, seleccionamos una fibra de una rata Ob (Figura 3B, panel derecho) que muestra alteraciones sustanciales en el contenido y distribución mitocondrial. La Figura 3C muestra la cuantificación del área de fibra ocupada por las mitocondrias expresada como densidad mitocondrial, obtenida a partir de cada imagen binarizada (mostrada en el panel B). Como era de esperarse, la fibra Ob presentó una menor densidad mitocondrial. Se cuantificó consistentemente a lo largo de la distancia Z analizada, que también se observa en la Figura 3D cuando se calcula la densidad mitocondrial por pila conformada por las tres imágenes confocales adquiridas a 15, 18 y 21 μm.
Al igual que el análisis de la densidad mitocondrial, el barrido confocal de un indicador fluorescente para la obtención de imágenes de células vivas, como TMRE, permite estudiar la organización longitudinal de las mitocondrias en el músculo esquelético vivo. IMF presenta una organización periódica en la banda I cercana a TT7, que puede ser analizada por FFT para cuantificar la frecuencia de la señal mitocondrial y el nivel de organización17. En la Figura 4 se muestran las diferencias en la organización de la IMF encontradas en gastrocnemios derivados de ratas Lean y Ob y cómo la FFT permite encontrar los cambios en la distribución de la señal mitocondrial. Las Figuras 4A, B exhiben ROI longitudinales seleccionadas en una posición central y lateral en la fibra para el análisis FFT. Antes de realizar FFT, se calcula el umbral para la sustracción de fondo. A continuación, la imagen se binariza; Estos procedimientos eliminan las variaciones en los niveles de intensidad de fluorescencia de la señal mitocondrial. La imagen binaria proporciona el perfil gráfico de la distribución de fluorescencia necesaria para realizar la FFT.
La Figura 4C, D muestra los ROI seleccionados en los paneles A y B con sus perfiles de trazado (paneles superiores). A partir de los perfiles de las parcelas, se pueden observar diferencias en la distribución de fluorescencia entre las fibras derivadas de ratas Lean y Ob, así como las variaciones entre ROIs dentro de la misma fibra. Para cada perfil de parcela, se presenta su respectivo espectro FFT (paneles inferiores). El pico del espectro FFT máximo indica la frecuencia FFT (eje X) de la distribución de la señal mitocondrial a lo largo del eje longitudinal. Se puede transformar en un valor de distancia cercano a 2 μm en los ROI lateral y central de la rata Lean. Cabe destacar que la magnitud FFT del pico es un índice de la regularidad de la señal mitocondrial, y los cambios en esta amplitud revelan alteraciones en la distribución mitocondrial.
La Figura 4E, F muestra las diferencias en el espectro FFT entre las fibras Lean y derivadas de Ob donde se analizaron las ROI laterales y centrales, respectivamente. En las ROI laterales (Figura 4E) la frecuencia de distribución longitudinal mitocondrial fue similar en las fibras magras y derivadas de Ob; sin embargo, la amplitud del pico máximo de FFT en las fibras derivadas de Ob fue mayor, lo que concuerda con la mayor regularidad de la señal observada en la imagen de la Figura 4B. Sin embargo, el ROI central (Figura 4F) del Ob se observa como un ejemplo de una reducción crítica del pico de FFT en comparación con el Lean cuando está presente una alteración importante de la distribución mitocondrial.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig01v2.jpg"> Figura 1: Esquema para el análisis mitocondrial en músculo esquelético mediante microscopía confocal. Este esquema resume los pasos principales del protocolo en tres fases separadas. La primera fase, la disección de los haces de fibras musculares del gastrocnemio, se subdivide en tres pasos posteriores, el aislamiento del músculo gastrocnemio, seguido de la disección mecánica del músculo en haces para finalmente hacer una selección visual de los viables. La segunda fase consiste en la adquisición de imágenes de células vivas mediante microscopía confocal, que consiste en la incubación con el fluoróforo (TMRE) durante 20 min a temperatura ambiente para colocar las fibras en la cámara. Posteriormente, se realizan los ajustes apropiados en el microscopio para llevar a cabo la adquisición de las imágenes confocales. Durante la tercera fase, se lleva a cabo el procesamiento de imágenes confocales y el análisis de datos. Empezando por el procesamiento de imágenes, donde se requiere un umbral para generar imágenes binarias a partir de las cuales se realizan cálculos de densidad mitocondrial y distribución mitocondrial por FFT. Abreviaturas: TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina; FFT = Transformada rápida de Fourier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig02.jpg"> Figura 2: Disección del haz de músculo esquelético. (A ) Cabeza de gastrocnemio lateral de rata disecada (flecha negra) en una placa de Petri con solución Relax. (B) Imagen representativa de los haces de fibras musculares de gastrocnemio en la solución Relax antes de la carga de TMRE. Abreviatura: TMRE = éster etílico de tetrametilrodamina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig03.jpg"> Figura 3: Análisis de densidad mitocondrial. (A) Ilustración que representa la distancia Z recomendada para el escaneo confocal de las mitocondrias IMF en fibras musculares esqueléticas. (B) Serie de imágenes confocales de mitocondrias cargadas con TMRE en fibras musculares esqueléticas, obtenidas de una rata Zucker +/+ ejercitada (Lean) y de una rata Zucker fa/fa obesa (Ob) registradas en la distancia Z (de 15 a 21 μm de profundidad). Las imágenes se procesaron mediante umbrales y se transformaron en imágenes binarias. (C) Calculó la mitodensidad de los cortes confocales obtenidos a diferentes distancias Z observadas en el panel B. (D) La mitodensidad obtenida de la pila compuesta por las imágenes observadas en el panel B. Las imágenes del panel B son de 65 x 50 μm. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: Mitodensidad = Densidad mitocondrial; IMF = mitocondrias intermiofibrilares; Ob = Obeso; SSM = mitocondrias subsarcolemales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig04.jpg"> Figura 4: Análisis de la distribución mitocondrial por FFT. Imágenes confocales representativas de mitocondrias cargadas con el indicador fluorescente TMRE adquiridas a 21 μm de la profundidad de las fibras del músculo esquelético obtenidas de una rata Zucker +/+ ejercitada (Lean, panel A) y de una rata Zucker fa/fa obesa (Ob, panel B). Las imágenes se procesaron mediante umbrales y se transformaron en imágenes binarias. ROI lateral y central del panel A (panel C) y panel B (panel D) con sus respectivos perfiles de gráficos de intensidad de fluorescencia (gráfico superior) y espectro FFT (gráfico inferior). La FFT se calculó a partir de ROI con 256 píxeles de ancho, lo que corresponde a un tamaño de ROI de 39 x 5 μm en el panel A y un tamaño de ROI de 50 x 5 μm en el panel B. El panel E muestra las diferencias del espectro FFT encontradas entre las mitocondrias derivadas de ratas Lean y Ob en el ROI lateral, mientras que el panel F muestra las diferencias del espectro FFT del ROI central. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: A.U. = Unidades arbitrarias; FFT = Transformada rápida de Fourier; ROI = regiones de interés; Ob = Obeso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reactivo</td>
			<td>Concentración final en 100 mL</td>
			<td>Acción </td>
		</tr><tr><td>K-aspartato</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Kcl</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Ácido L-glutámico</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Ácido málico</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>1 mM de Mg2+ libre</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CaCl2</td>
			<td>0,00002 mM de Ca2+ libre</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Fosfocreatina di-Na</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr><tr><td>Creatina fosfoquinasa</td>
			<td>5 U/mL</td>
			<td>200 U/mL</td>
		</tr><tr><td>MgATP</td>
			<td>5 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>pH 7,3 (con NaOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Reactivos de solución relajante y concentración.
Figura complementaria S1: Efecto de los métodos de preprocesamiento de imágenes. (A) Imágenes confocales representativas de mitocondrias cargadas con el indicador fluorescente TMRE adquiridas a una profundidad de 18 μm en fibras musculares esqueléticas obtenidas de una rata Zucker +/+ ejercitada (Lean, panel superior) y de una rata Zucker fa/fa obesa (panel inferior), junto con sus respectivas imágenes obesas obtenidas después del preprocesamiento utilizando el umbral de Otsu, el filtro mediano y el umbral de Otsu, y deconvolución 2D y umbral de Otsu. (B) Perfil gráfico de la mitodensidad obtenido a partir de las imágenes confocales (panel A) después del preprocesamiento con diferentes métodos. Las imágenes del panel A son de 65 x 50 μm. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: 2D-Decon = deconvolución 2D; Mitodensidad = Densidad mitocondrial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/Supl%201-rev4.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Aquí, presentamos un protocolo para analizar los cambios en la densidad mitocondrial y la distribución longitudinal mediante imágenes de músculo esquelético vivo utilizando microscopía confocal para el escaneo de redes mitocondriales.

Análisis de la densidad mitocondrial y la distribución longitudinal en fibras musculares vivas de rata mediante microscopía confocal

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...

La remodelación de la red mitocondrial se produce en condiciones de estrés fisiológico y patológicas. Sin embargo, los efectos de la remodelación mitocondrial en un músculo esquelético siguen sin comprenderse por completo. Este protocolo permite cuantificar los cambios de las mitocondrias en el músculo esquelético vivo, mejorando nuestra comprensión de la interacción entre las alteraciones mitocondriales y la función celular.Trabajar con músculos esqueléticos vivos presenta desafíos debido a la contracción de las fibras durante el aislamiento y la sensibilidad a la imagen durante la exploración confocal. Este protocolo describe un proceso de aislamiento utilizando una solución de relajación, lo que permite el análisis de fibras musculares viables para la evaluación mitocondrial mediante microscopía confocal. Nuestro protocolo aborda la falta de flujos de trabajo para analizar cuantitativamente las redes mitocondriales en las fibras del músculo esquelético.Los pasos descritos aquí permiten a los usuarios aprovechar más las imágenes obtenidas por microscopía confocal utilizando el procesamiento de imágenes mediante umbrales y análisis rápidos de Fourier para lograr la cuantificación de la densidad y distribución mitocondrial. Estamos interesados en el estudio de la alteración del músculo esquelético, en particular la dinámica mitocondrial y la remodelación estructural mitocondrial durante la adversidad y cómo se pueden modular a través de intervenciones como el ejercicio y el ayuno intermedio.

analysis-mitochondrial-density-longitudinal-distribution-rat-live

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los fibroblastos de pacientes portadores de mutaciones causantes de la enfermedad en el Parkinson genes representan un fácil...

El uso de fibroblastos humanos primarios para la Supervisión de fenotipos mitocondriales en el campo de la enfermedad de Parkinson

Este protocolo utiliza técnicas de análisis y proyección de imagen (3D) tridimensionales para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Las técnicas son aplicables a otras situaciones donde una señal fluorescente se utiliza para aislar un subconjunto de los datos de otra señal fluorescente.

Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal

La visualización y el análisis mitocondrial del tejido cerebral de mamíferos es una tarea desafiante. Aquí, describimos cómo el análisis de reconstrucción tridimensional (3D) de la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBFSEM) se puede utilizar para obtener información sobre el análisis morfológico y volumétrico de este orgánulo generador de energía crítico.

Análisis del Cerebro Las mitocondrias Usando serie Bloque-Cara Microscopía Electrónica de Barrido

Aquí, se presenta un protocolo para análisis rápido de la fibra muscular, lo que permite mejorar la calidad de la tinción, y la adquisición de ese modo automático y la cuantificación de las poblaciones de fibra utilizando el ImageJ software disponible libremente.

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

Un procedimiento modificado posterior a la fijación aumenta el contraste de las partículas de glucógeno en el tejido. Este documento proporciona un protocolo paso a paso que describe cómo manejar el tejido, realizar las imágenes y utilizar métodos estereológicos para obtener datos imparciales y cuantitativos sobre la distribución de glucógeno subcelular específico del tipo de fibra en el músculo esquelético.

Cuantificación de la distribución de glucógeno subcelular en fibras musculares esqueléticas mediante microscopía electrónica de transmisión

La creciente evidencia indica que la infiltración excesiva de lípidos dentro del músculo esquelético resulta en lipotoxicidad y diabetes. Aquí, presentamos un protocolo completo, que incluye procesamiento de tejidos, tinción con Bodipy, adquisición de imágenes y análisis, para cuantificar el tamaño, la densidad y la distribución subcelular de las gotas lipídicas de una manera específica de tipo de fibra.

Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

En este estudio, describimos un protocolo paso a paso y enfatizamos los detalles clave para determinar las características morfológicas de las mitocondrias en células vivas, incluida la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Este método se usa comúnmente para examinar la morfología mitocondrial para estudiar diversas afecciones.

Determinación de la morfología mitocondrial en células vivas mediante microscopía confocal

Aquí describimos el localizador de eventos mitocondriales (MEL), un complemento de ImageJ útil en la cuantificación de los cambios tridimensionales en la actividad de fisión y fusión mitocondrial a lo largo del tiempo. También describimos una tubería de procesamiento de imágenes útil para la limpieza de micrografías antes del análisis en ImageJ.

Comprensión de los cambios en la morfología mitocondrial a través de micrografías de fluorescencia dinámicas y tridimensionales

Inyecciones locales de un marcador mitocondrial con marcador mitocondrial terminal de células de Schwann en vivo para microscopía confocal. Este método utiliza pruebas de concepto demostradas en tejido muscular esquelético de ratones con músculo sano o enfermo para proporcionar una visualización mitocondrial de alta resolución.

Métodos para la cuantificación in situ de la morfología mitocondrial en células musculares y terminales de Schwann de ratones

Un método nuevo y versátil para la observación de la microcirculación se presenta. Se considera adecuado para observación a largo plazo, y para la combinación con intervenciones biológicas pharmacophysiological o molecular.

En vivo la micro-circulación de medición en el músculo esquelético de Intra-vital Microscopía

Aprende a analizar la densidad y distribución mitocondrial en fibras musculares vivas de rata mediante microscopía confocal. Este protocolo cuantitativo revela diferencias entre condiciones fisiológicas y patológicas.

Análisis de la densidad mitocondrial y la distribución longitudinal en fibras musculares vivas de rata mediante microscopía confocal (Video) | JoVE Journal

Análisis de la densidad mitocondrial y la distribución longitudinal en fibras musculares vivas de rata mediante microscopía confocal

Explorar más videos