Name: El método de ordeño cerebral para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprende el método de ordeño cerebral para aislar células madre neurales y progenitoras de oligodendrocitos en ratas vivas. Esta técnica permite estudios longitudinales sin comprometer el bienestar animal.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de Action Medical Research (Reino Unido) (GN2291) a R.J.M.F. e I.K. El trabajo de investigación también fue parcialmente financiado (costos de animales y apoyo a D.D.) por la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (H.F.R.I.) en el marco de la "Primera Convocatoria de Proyectos de Investigación H.F.R.I. para apoyar a los miembros de la Facultad e Investigadores y la adquisición de subvenciones para equipos de investigación de alto costo" (Número de proyecto: 3395).

Los procedimientos de cría, mantenimiento y experimentación de animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986, autorizada por el Ministerio del Interior, y con el Decreto Presidencial 56/2013 de la República Helénica, examinada por los Órganos de Revisión Ética y de Bienestar Animal de las Universidades de Cambridge y Patras, así como aprobada y examinada por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Prefectura local (Número de protocolo: 5675/39/18-01-2021). Se utilizaron ratas macho y hembra Sprague-Dawley, Wistar y Long-Evans, con edades que variaban entre 2 y 4 meses y con pesos corporales entre 150 g y 250 g. El protocolo se resume gráficamente en la Figura 1.
1. Preparación del cóctel de liberación
NOTA: Prepárese fresco el día del procedimiento y manténgalo en hielo. Las cantidades se administran por 2 μL que se inyectan i.c.v. en cada ventrículo lateral. Prepare 1 μl adicional por cada inyección prevista.
<ol><li>Preparar 0,5 μL de 500 mU de neuraminidasa de Clostridium perfringens (Clostridium welchii). NOTA: Consérvelo como un caldo de 1 U/μL diluido en agua estéril a -20 °C. No se han probado otros tipos de neuraminidasas.</li>
	<li>Prepare 1 μL que contenga 1 μg de anticuerpo bloqueador de integrina-β1. NOTA: Guárdelo a 4 °C.</li>
	<li>Preparar 0,5 μL que contiene 0,5 μg de factor de crecimiento básico de fibroblastos (FGF-básico humano recombinante). NOTA: Consérvelo en forma de 1 μg/μL diluido en agua estéril a -20 °C.</li>
</ol>2. Inyección de cóctel de liberación
NOTA: Todo el proceso se puede realizar en 20 minutos. Tenga cuidado de realizar la cirugía en condiciones asépticas. Limpie todas las superficies con antiséptico (por ejemplo, peróxido de hidrógeno al 3% o al 6%). Use herramientas, guantes, batas y paños esterilizados en autoclave o fácilmente estériles.
<ol><li>Anestesiar al animal de experimentación por inhalación de isoflurano (2,5% para inducción y 2% para mantenimiento). Confirme la profundidad de la anestesia comprobando el reflejo corneal, la reacción a los estímulos (prueba de pellizco de la extremidad posterior y la cola) y el modo de respiración. NOTA: Los procedimientos quirúrgicos se pueden realizar bajo anestesia general inducida por anestesia inyectable intraperitoneal (p. ej., ketamina [40 mg/kg] y xilacina [10 mg/kg]). La anestesia profunda se confirmó mediante la comprobación del reflejo corneal, la reacción a los estímulos (prueba de pellizco de la extremidad posterior y la cola) y el modo de respiración.</li>
	<li>Administrar analgesia por vía subcutánea (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina) tras la inducción de la anestesia.</li>
	<li>Monta la rata en el marco estereotáxico.</li>
	<li>Afeita el pelaje de la cabeza con una navaja de afeitar y limpia la piel con un antiséptico, como una solución de povidona yodada al 10% y luego alcohol. Aplique el antiséptico tres veces con hisopos de algodón estériles. Frote con movimientos circulares durante 3-5 segundos cada vez. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad.</li>
	<li>Haga una incisión de 2 cm en la piel de la cabeza a lo largo de la línea media con un bisturí estéril.</li>
	<li>Limpie meticulosamente el cráneo con hisopos estériles y solución salina estéril.</li>
	<li>Identifique el bregma utilizando el borde de la aguja de una jeringa Hamilton de 10 μL montada en el dispositivo estereotáxico. Establezca el bregma como "punto 0,0". NOTA: El bregma se identifica como el punto de intersección entre las suturas sagital y coronal. Se pueden encontrar más detalles en el atlas del cerebro de rata de Paxinos y Watson5.</li>
	<li>Mueva el dispositivo a las coordenadas anterioposterior (AP) = 0,3 mm, lateral (L) = +1,2 mm (para apuntar a la ZEE) o AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (para apuntar al CC).</li>
	<li>Taladre un orificio de rebaba de 1 mm con un taladro dental. NOTA: Al perforar a mano, tenga cuidado de no lesionar la superficie cortical. No se espera que la hemorragia sea considerable. Limpie la sangre con solución salina y aplique presión para detener el sangrado más persistente.</li>
	<li>Cargue 4 μL del cóctel de liberación en la jeringa Hamilton de 10 μL.</li>
	<li>Baje la aguja (preferiblemente de borde romo o cónico) de la jeringa Hamilton para entrar en contacto con la duramadre.</li>
	<li>Inserte la aguja a la profundidad deseada (D = 3,5 mm). NOTA: Vierta solución salina en la superficie de la duramadre para mantener el tejido hidratado.</li>
	<li>Infundir 2 μL del cóctel de liberación a razón de 1 μL/min.</li>
	<li>Deje la aguja en su lugar durante otros 2 minutos antes de recuperarla lentamente para evitar que salga a la superficie el cóctel de liberación.</li>
	<li>Repita los pasos 2.8-2.14 para el otro hemisferio en las coordenadas AP = 0.3 mm, L = -1.2 mm (para apuntar a la ZEE) o AP = 1.5 mm, L = -2.0 mm (para apuntar al CC).</li>
	<li>Suturar la incisión con nylon 5-0 (diámetro 0,1 mm) y limpiar la zona suturada con un antiséptico.</li>
	<li>Retirar la mascarilla que suministra el anestésico y trasladar al animal al área de monitoreo postoperatorio. NOTA: La recuperación de la anestesia y el mantenimiento de la decúbito deben ocurrir dentro de los 5-10 minutos, y la recuperación completa (comportamiento normal) dentro de los 25 minutos.<ol><li>Vigile de cerca la recuperación (movimiento vívido e ininterrumpido, acceso frecuente al agua) en un espacio bien calentado (24-25 °C), tranquilo y sin lecho de partículas pequeñas, que pueden obstruir las vías respiratorias. Devuelva el animal a la compañía de sus compañeros de jaula (no a animales nuevos) solo después de confirmar la recuperación completa.</li>
		<li>Vigilar al animal en el centro de mantenimiento durante al menos 48 h después de la cirugía. Tratar los signos de dolor (ocultamiento de la cabeza, postura anormal de la cabeza o del cuerpo, hipersensibilidad e hiperexcitabilidad a la manipulación) mediante la administración de analgesia (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina, por vía subcutánea). Remita a los animales con pelaje descolorido o erizado al veterinario responsable.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Biopsia líquida del líquido cefalorraquídeo (LCR)
NOTA: Todo el proceso se puede realizar en 10 minutos. La biopsia líquida descrita aquí se realiza 3 días después de la inyección del cóctel de liberación, pero se puede realizar exactamente de la misma manera siempre que sea necesario. Tenga cuidado de realizar la cirugía en condiciones asépticas. Limpie todas las superficies con un antiséptico (por ejemplo, peróxido de hidrógeno al 3% o al 6%). Use herramientas, guantes, batas y paños esterilizados en autoclave o fácilmente estériles.
<ol><li>Anestesiar al animal por inhalación de isoflurano (2,5% para inducción y 2% para mantenimiento). Confirme la profundidad de la anestesia revisando la córnea el reflejo, la reacción a los estímulos (prueba de pellizco de la extremidad trasera y la cola) y el modo de respiración. NOTA: Los procedimientos quirúrgicos se pueden realizar bajo anestesia general inducida por anestesia inyectable intraperitoneal (p. ej., ketamina [40 mg/kg] y xilacina [10 mg/kg]). Sin embargo, esto no es recomendable ya que el procedimiento es corto, especialmente si las biopsias se realizarán varias veces en días consecutivos.</li>
	<li>Administrar analgesia por vía subcutánea (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina) tras la inducción de la anestesia.</li>
	<li>Monta el animal de experimentación en el marco estereotáxico. Use barras para las orejas para fijar la cabeza sin obstruir el movimiento de rotación hacia adelante y hacia atrás.</li>
	<li>Estabilice la cabeza en un ángulo de 40° hacia abajo para que se pueda lograr una buena extensión de la parte posterior del cuello. NOTA: Una forma de hacerlo es utilizando la barra bucal del dispositivo6.</li>
	<li>Afeita el pelaje en el área del cuello con una navaja de afeitar y limpia la piel con un antiséptico, como una solución de povidona yodada al 10% y luego alcohol. Aplique el antiséptico tres veces con hisopos de algodón estériles. Frote con movimientos circulares durante 3-5 segundos cada vez.</li>
	<li>Con la yema del dedo, encuentre el área depresible en forma de rombo, colocada entre la protuberancia occipital y la columna vertebral del atlas6.</li>
	<li>Dibuje una marca de punto (por ejemplo, usando un marcador).</li>
	<li>Fije una jeringa de 1 ml o 0,5 ml en el marco estereotáxico. NOTA: Es recomendable utilizar jeringas con agujas no desmontables ya que producen una mejor succión y tienen menos volumen muerto.</li>
	<li>Lleve la aguja al punto de contacto con la piel en la marca del punto.</li>
	<li>Con un par de fórceps, levante la piel mientras baja la jeringa a través de las capas de la piel.</li>
	<li>Recupere ligeramente el émbolo para generar presión negativa en la jeringa.</li>
	<li>Vuelva a empezar a sumergir la aguja muy lentamente hasta que aparezca líquido (LCR) en la jeringa.</li>
	<li>Coloque la aguja en esta posición y permita el flujo lento del líquido cefalorraquídeo. NOTA: La aguja se puede bajar o elevar ligeramente si el flujo de líquido cefalorraquídeo es muy lento.</li>
	<li>Comience a retirar el líquido cefalorraquídeo lentamente (en pasos de 40 μL/min) hasta 120 μL.</li>
	<li>Recupere lentamente la jeringa.</li>
	<li>Administrar por vía intraperitoneal 1 ml de suero normal para apoyar la reposición de líquidos del animal de experimentación.</li>
	<li>Mezcle la biopsia líquida (LCR) con 400 μL de medio NSC y mantenga el tubo de microcentrífuga a 4 °C hasta su uso posterior. NOTA: Las biopsias líquidas deben procesarse dentro de las 3 horas si no se congelan.</li>
	<li>Retirar la mascarilla que suministra el anestésico y trasladar al animal al área de monitoreo post operación. NOTA: La recuperación de la anestesia y el mantenimiento de la decúbito deben ocurrir dentro de los 5-10 minutos, y la recuperación completa (comportamiento normal) dentro de los 25 minutos.<ol><li>Vigile de cerca la recuperación (movimiento vívido e ininterrumpido, acceso frecuente al agua) en un espacio bien calentado (24-25 °C), tranquilo y sin lecho de partículas pequeñas, que pueden obstruir las vías respiratorias. Devuelva el animal a la compañía de sus compañeros de jaula (no a animales nuevos) solo después de que se haya confirmado la recuperación completa.</li>
		<li>Vigilar al animal en el centro de mantenimiento durante al menos 48 h después de la cirugía. Si se observan signos de dolor (ocultamiento de la cabeza, postura anormal de la cabeza o del cuerpo, hipersensibilidad e hiperexcitabilidad a la manipulación), administrar analgesia (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina por vía subcutánea). Remita a los animales con pelaje descolorido o erizado al veterinario responsable.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Procesamiento de tejidos para inmunofluorescencia
<ol><li>Sacrificar al animal mediante infusión intracardíaca de 20 mL de solución salina helada, seguida de 50 mL de paraformaldehído helado al 4% (PFA; en solución salina tamponada con fosfato [PBS] de pH = 7,4).</li>
	<li>Disecciona el tejido cerebral.<ol><li>Separa la cabeza del cuerpo con unas tijeras para hacer un corte en la zona cervical. Use las tijeras para quitar la piel y luego corte el hueso del cráneo a lo largo de la línea media sagital, con las puntas de las tijeras apuntando hacia arriba para no dañar el tejido cerebral. Trate de continuar cortando tanto como sea posible, pasando la línea media coronal.</li>
		<li>Utilizar fórceps para extraer los huesos, empezando por los huesos supraoccipital y parietal y finalmente los huesos frontales.</li>
		<li>Una vez que se revela el tejido cerebral, use las pinzas o una espátula para sacarlo del cráneo. Para facilitar esto, corte los nervios en la base del cerebro y los bulbos olfatorios, si no lo desea.</li>
	</ol></li>
	<li>Fijar el tejido durante la noche en PFA al 2% a 4 °C.</li>
	<li>Crioproteger el tejido en sacarosa al 30% (en PBS) durante al menos 48 h a 4 °C hasta que el tejido se hunda hasta el fondo.</li>
	<li>Congelar el tejido a -80 °C.</li>
	<li>Cortar el tejido cerebral en secciones coronales de 14 μm de grosor con un criostato.</li>
	<li>Realizar tinción de inmunofluorescencia utilizando protocolos estándar 3,7<ol><li>Incubar las secciones con tampón de bloqueo (3% de albúmina sérica bovina [BSA], 0,1% Triton X-100, en PBS) durante 2 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Realizar la recuperación de antígenos (ebullición durante 15 min en tampón citrato 10 mM, pH = 6,0, utilizando frascos de vidrio). NOTA: Este paso es opcional, pero necesario para los antígenos nucleares.</li>
		<li>Llevar a temperatura ambiente e incubar con anticuerpos primarios contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), la doble cortina (Dcx), S100β y β-catenina (ver la Tabla de Materiales) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Incubar durante 2 h con anticuerpos secundarios en PBS con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para contratinción nuclear a temperatura ambiente (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Monta los cubreobjetos.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Procesamiento de células aisladas para inmunofluorescencia
<ol><li>Coloque las células en placas de 96 pocillos compatibles con microscopía, recubiertas con poli-D-lisina (100 μg/mL).</li>
	<li>Fije las células en PFA al 2% helado durante 10 minutos y lávelas 3 veces con PBS.</li>
	<li>Realice inmunofluorescencia utilizando los procedimientos estándar3,7 para PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 e ID3 (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Mantenga las celdas en PBS + NaN3 (0,1%) a 4 °C en la oscuridad.</li>
</ol>6. Microscopía y análisis de imágenes
<ol><li>Tome imágenes con epifluorescencia o microscopía confocal y realice recuentos celulares utilizando herramientas de software estándar de análisis de imágenes, como contadores de células.</li>
</ol>

"Ordeño cerebral" de ratas para el aislamiento de células progenitoras de oligodendrocitos y tronco neural

<ol><li>Visvader, J. E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+designs+of+stem+cell+hierarchies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific designs of stem cell hierarchies.</a> Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).</li>
<li>Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+quiescent+and+active+neural+stem+cells+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain.</a> The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).</li>
<li>Kazanis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subependymal+zone-derived+oligodendroblasts+respond+to+focal+demyelination+but+fail+to+generate+myelin+in+young+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).</li>
<li>Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+CNS+myelin-from+mechanisms+to+experimental+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6">https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6</a> (2013).</li>
<li>Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).</li>
<li>McClenahan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+and+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+brain+of+live+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats.</a> Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).</li>
<li>Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+germinal+layer+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).</li>
<li>Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+converts+transit-amplifying+neurogenic+precursors+in+the+adult+brain+into+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells.</a> Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).</li>
<li>Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+proliferation+on+the+surface+of+the+adult+rat+striatal+wall+after+focal+ependymal+loss+by+intracerebroventricular+injection+of+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).</li>
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<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).</li>
<li>Calzolari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+clonal+expansion+and+limited+neural+stem+cell+self-renewal+in+the+adult+subependymal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone.</a> Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).</li>
<li>Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractone-heparan+sulphates+mediate+FGF-2+stimulation+of+cell+proliferation+in+the+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone.</a> Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Obernier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+is+sustained+by+symmetric+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).</li>
<li>Delgado, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+stem+cells+from+quiescence+reveals+gliogenic+domains+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain.</a> Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).</li>
<li>Kalamakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescence+modulates+stem+cell+maintenance+and+regenerative+capacity+in+the+aging+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain.</a> Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).</li>
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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses que declarar.

Las células madre y progenitoras son relativamente escasas en el tejido cerebral de los mamíferos. Además, las NSC se encuentran en áreas inaccesibles para realizar biopsias fáciles y seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Por lo tanto, la única forma de trabajar experimentalmente con este tipo de células, hasta ahora, ha sido su aislamiento postmortem. A continuación se describe paso a paso un método que permite la recolección única o repetida de NSC y OPC de ratas vivas, llamado ordeño. El método se basa en dos características clave: i) las NSC u OPC están separadas por la monocapa de células ependimarias del LCR, que fluye dentro del sistema ventricular del cerebro; ii) las células ependimarias y los progenitores neurales mantienen contacto entre ellas y con otros tipos de células vecinas a través de integrinas. Por lo tanto, el cóctel de liberación inyectado en áreas específicas de los ventrículos para permitir la desconexión de las NSC, u OPC, del parénquima cerebral contiene neuraminidasa, una toxina que se dirige específicamente y mata las células ependimarias10,11, y un anticuerpo bloqueador de la integrina-β1. También contiene FGF2, ya que este factor de crecimiento es esencial para la supervivencia y el mantenimiento de las NSC en el nicho y en el cultivo15,16. Se ha demostrado previamente7 que este protocolo es bien tolerado por los animales; en este informe, se confirma además que el daño a las células ependimarias, inducido por el cóctel de liberación como requisito previo para la liberación de NSC/OPC en el LCR, está limitado alrededor del nivel rostrocaudal de la inyección. Esto ha sido de vital importancia, ya que el protocolo debe preservar la función homeostática del cerebro, incluido el propio nicho de células madre, y no debe comprometer el bienestar a largo plazo de los animales. La inyección estereotáxica del cóctel de liberación es de gravedad leve y nunca ha resultado en la muerte. Además, la realización de biopsias líquidas de la cisterna magna es un procedimiento rápido y mínimamente invasivo que puede repetirse varias veces consecutivas.
Es importante destacar que las muestras de NSC aisladas mediante ordeño reflejan fielmente el conjunto endógeno de NSC. El perfil de los progenitores de las ZEE puede verse influido por la inyección i.c.v. de FGF2. Cuando esto sucede, el perfil de las células derivadas del ordeño se ve afectado de la misma manera. Además, trabajos experimentales previos han indicado que las NSC aisladas a través del ordeño de la ZEE tienen un potencial de autorrenovación limitado, un comportamiento similar al de las NSC endógenas, como se revela con estrategias in vivo, transgénicas y de destino celular14,17. Las NSC cerebrales postnatales se mantienen en quiescencia, rara vez transitan hacia la activación mitótica para generar progenie neurogénica y gliogénica18,19,20. En este caso, se proporciona evidencia de que la fracción de células derivadas del ordeño que expresan GFAP y se espera que incluyan NSC de buena fe co-expresan ID3, un marcador de NSC inactivas21. La presencia enriquecida de NSC quiescentes, que luego se siembran en el medio NSC típicamente utilizado para el cultivo de NSC aisladas postmortem, parece limitar el potencial de expansión de las NSC recolectadas (por ejemplo, un proceso crucial si las células se utilizaran para trasplantes autólogos). Esto se debe a que estos medios están diseñados específicamente para la supervivencia y la expansión mitótica de las NSC activadas; por lo tanto, la generación de protocolos que permitan la activación mitótica eficiente y rápida de las NSC inactivas aumentará el valor y el alcance del uso del ordeño.
En general, estos datos indican que el ordeño permite la toma de muestras de NSCs y OPCs cerebrales postnatales (dependiendo del nivel rostrocaudal de la inyección del cóctel de liberación) de ratas vivas. Este trabajo indica la factibilidad de realizar biopsias líquidas sucesivas en el mismo animal, incluso en períodos de tiempo significativos después de la inyección del cóctel de liberación (por lo tanto, para planificar y realizar estudios experimentales longitudinales), ya que los neuroblastos permanecen agrupados en las paredes ventriculares incluso a los 8 meses después de la inyección. Estos métodos son de vital importancia porque permiten la investigación de eventos dentro de animales individuales que resultan en una reducción del ruido biológico generado por la variación fisiológica. Esto, a su vez, conduce a una mayor precisión y a la implementación de los principios de las "3R" (reemplazo, reducción y refinamiento). Los pasos clave futuros para la mejora del método serán la determinación del número máximo y el período de tiempo en que se pueden realizar biopsias líquidas después de un procedimiento de liberación, aunque la realización de procedimientos de liberación adicionales debería ser factible, si es necesario.

Las células madre específicas de tejido son células parcialmente comprometidas que pueden dar lugar a todas las poblaciones celulares que constituyen los tejidos respectivos. Además de ser multipotentes, son células que se autorrenuevan y son cruciales para mantener la homeostasis y la capacidad regenerativa de los tejidos1. Algunas células madre específicas de tejido permanecen en un estado activo y fuertemente proliferativo, como las células madre intestinales o hematopoyéticas. Otras, como las células madre cerebrales, permanecen en gran medida inactivas o inactivas2. En el cerebro adulto, las células madre neurales (NSC, por sus siglas en inglés) se pueden encontrar en áreas especializadas, a menudo llamadas nichos. Existen dos áreas bien descritas en la zona subependimaria (ZEE) de los ventrículos laterales y en la circunvolución dentada del hipocampo. El nicho de la ZEE genera el mayor número de células, principalmente neuroblastos que migran hacia los bulbos olfatorios y contribuyen a la población local de interneuronas; por el contrario, los oligodendroblastos generados migran al cuerpo calloso adyacente (CC)3. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) son células mitóticamente activas, ampliamente distribuidas por todo el sistema nervioso central, que: i) están comprometidas con el linaje oligodendroglial, ii) pueden migrar a sitios de desmielinización, y iii) pueden diferenciarse en oligodendrocitos mielinizantes. Las OPC también exhiben potencial de autorrenovación y quietud4.
Hasta ahora, el aislamiento y estudio de las NSC y OPC requería la disociación postmortem del tejido cerebral y de la médula espinal disecado. Para sortear esta limitación experimental, establecimos un método que permite, por primera vez, aislar las NSC y OPC cerebrales de animales vivos. Llamamos a este método "ordeño", porque permite múltiples colecciones de células, ya que sus reservas no se agotan. El protocolo se desarrolló en ratas, debido a su gran tamaño cerebral, dirigido principalmente a la ZEE, o CC, e incluye dos pasos principales. En primer lugar, las NSC u OPC se "eliminan" del tejido mediante la inyección intravenosa de un "cóctel de liberación" que contiene neuraminidasa, una toxina que induce la denudación de la pared ventricular, un anticuerpo que bloquea la integrina-β1 y el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2). El cóctel se inyecta estereotáxicamente bilateralmente dentro de los ventrículos laterales. Si el uso previsto es el aislamiento de las NSC, se dirigen a las áreas rostrales de los ventrículos laterales. Si el objetivo es aislar las OPC de forma más pura, el cóctel se inyecta caudalmente en la zona de la fimbría del hipocampo. En un segundo paso de "recolección", se realizan biopsias líquidas de líquido cefalorraquídeo (LCR) de la cisterna magna de ratas anestesiadas, sin necesidad de incisión. La biopsia líquida se mezcla con un medio de cultivo NSC y se puede mantener a 4 °C hasta la siembra.

<table><tbody><tr><td><cóctel fuerte>lanzamiento</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>y beta; Anticuerpo bloqueante de 1 integrina</td><td>BD Biosciences</td><td>#555002</td><td>clon NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Ha2/5, 1 mg/mL. Cualquier cuerpo abntibody con actividad de bloqueo debe ser apropiado.</td></tr><tr><td>Neuraminidasa de Clostridium perfringens (Clostridium welchii)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#N2876</td><td>Las neuraminidasas de otras fuentes (por ejemplo, de Vibrio cholerae) no han sido probadas.</td></tr><tr><td>FGF humano recombinante básico (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>#100-18B</td><td>mantenido como un 1 &mu; g/&mu; L de caldo, diluido en agua estéril a -20 °C; C</td></tr><tr><td><fuerte>Procedimientos quirúrgicos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 y micro; L Jeringa</td><td>Hamilton</td><td>#80330</td><td>Modelo 701 RN, Aguja Pequeña Removible, Calibre 26s, 2 pulg., estilo de punta 2</td></tr><tr><td>BD Jeringas de insulina microfinas de 1 mL</td><td>BD biosciences</td><td>04085-00</td><td>29 G x 12.7 mm</td></tr><tr><td>BETADINE CUT. SOL 10% FLx30ML</td><td>LAVIPHARM-CASTALIA</td><td>SKU:</td><td></td></tr> 5201048131168 <tr><td>Bupaq</td><td>RICHTERPHARMA</td><td>1021854AF</td><td>10 mL (buprenofina 0,3 mg/mL)</td></tr><tr><td>Digital Nuevo Estándar Estereotáxico, Ratas y Ratón</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Monitorización Homeotérmica</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td>ISOFLURIN 1.000 mg/g vapor de inhalación, líquido</td><td>Vetpharma Salud Animal</td><td>32509/4031</td><td></td></tr><tr><td>Ketamidor</td><td>RICHTER PHARMA</td><td>SKU:</td> 9004114002531 <td>Ketamina 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Sutura de nylon, Ethilon</td><td>Ethicon</td><td>D9635</td><td>Transparente, tamaño 5-0</td></tr><tr><td>Recortadoras quirúrgicas inalámbricas recargables</td><td>Stoelting</td><td>Artículo:51472</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí, estériles</td><td>Swann Morton</td><td>AW050</td><td></td></tr><tr><td>Scopettes Jr.&nbsp; Hisopos de 8 pulgadas</td><td>Birchwood Laboratories</td><td>34-7021-12P</td><td></td></tr><tr><td>Taladro estereotáxico de alta velocidad</td><td>Foredom</td><td>1474w/o1464</td><td></td></tr><tr><td>Stoelting' s Kit de Instrumento Estereotáxico Almacenamiento</td><td>Artículo</td><td>: 52189</td><td></td></tr><tr><td>Xylan 2%</td><td>Chanelle Pharmaceuticals</td><td>13764/03/19-5-2004</td><td>Xilacina, 25</td></tr> <tr><td>mL<fuerte>Manipulación de tejidos y células e inmunotinciones</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos apropiadas para microscopía</td><td>Greiner</td><td>#655866</td><td>Suplemento de microplaca de estrella de pantalla</td></tr><tr><td>B27</td><td>ThermoFisher Scientific A1486701</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Merck</td><td>P06-1391100</td><td>Fracción V,</td>citrato de choque</tr><tr><td></td><td>térmico Merck</td><td>71497</td><td>Citrato de sodio monobásico</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM1510S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck, Calbiochem</td><td>28718-90-3</td><td>Tinción nuclear, dilución: 1/1.000</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td>Alto contenido de glucosa, piruvato</td></tr> burro <tr><td>anti-cabra</td><td>Biotium</td><td>20016 o 20106 o 20048</td><td>Dilución: 1/1.000</td></tr><tr><td>burro anti-ratón</td><td>Biotium</td><td>20014 o 20105 o 20046</td><td>Dilución: 1/1.000</td></tr><tr><td>burro anti-conejo</td><td>Biotium</td><td>20015 o 20098 o 20047</td><td>Dilución: 1/1.000</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2 (o bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-GFAP</td><td>Abcam</td><td>ab53554</td><td>Dilución: 1/500</td></tr><tr><td>cabra anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-17320</td><td>Dilución: 1/200</td></tr><tr><td>ratón anti-ID3</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-56712</td><td>Dilución: 1/200</td></tr><tr><td>ratón anti-S100&beta;</td><td>Sigma</td><td>S2532</td><td>Dilución: 1/200</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Merck, Calbiochem</td><td></td><td>475904 Medio de montaje</td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td> 17502048 <td></td></tr><tr><td>Parafolmadehído</td><td>Merck</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lisina</td><td>Merck, Millipore</td><td>A-003-E</td><td>Solución, 1,0 mg/mL</td></tr> conejo <tr><td>anti-Doublecortin (DCX)</td><td>Abcam</td><td>ab18723</td><td>Dilución: 1/500</td></tr><tr><td>conejo anti-PDGFR&alfa;</td><td>Abcam</td><td>ab51875</td><td>Dilución: 1/200</td></tr><tr><td>conejo anti-&beta;- catenina</td><td>Abcam</td><td>ab16051</td><td>Dilución: 1/500</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Microscopía y análisis de imágenes</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td>SP6 y SP8</td><td></td></tr><tr><td>Análisis de imágenes</td><td>NIH, EE. UU.</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Análisis de imagen</td><td>Leica</td><td>LasX</td><td></td></tr></tbody></table>

el método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

Las células madre neurales (NSC) específicas de tejido permanecen activas en el cerebro postnatal de los mamíferos. Residen en nichos especializados, donde generan nuevas neuronas y glía. Uno de estos nichos es la zona subependimaria (ZEE; también llamada zona ventricular-subventricular), que se encuentra a lo largo de las paredes laterales de los ventrículos laterales, adyacente a la capa de células ependimarias. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) están abundantemente distribuidas por todo el sistema nervioso central, constituyendo un conjunto de células progenitoras proliferativas que pueden generar oligodendrocitos.
Tanto los NSC como los OPC exhiben potencial de autorrenovación y ciclos de inactividad/activación. Debido a su localización, el aislamiento y la investigación experimental de estas células se realiza post mortem. Aquí, describimos en detalle el "ordeño cerebral", un método para el aislamiento de NSCs y OPCs, entre otras células, de animales vivos. Este es un protocolo de dos pasos diseñado para su uso en roedores y probado en ratas. En primer lugar, las células se "liberan" del tejido a través de una inyección estereotáxica intracerebroventricular (i.c.v.) de un "cóctel de liberación". Los componentes principales son la neuraminidasa, que se dirige a las células ependimarias e induce la denudación de la pared ventricular, un anticuerpo bloqueante de la integrina-β1, y el factor de crecimiento de fibroblastos-2. En una segunda etapa de "recolección", se realizan biopsias líquidas de líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna, en ratas anestesiadas sin necesidad de incisión.
Los resultados presentados aquí muestran que las células aisladas conservan su perfil endógeno y que las NSC de la ZEE conservan su quiescencia. La denudación de la capa ependimaria se restringe al nivel anatómico de la inyección y el protocolo (liberación y recolección) es bien tolerado por los animales. Este novedoso enfoque allana el camino para realizar estudios longitudinales de neurogénesis endógena y gliogénesis en animales de experimentación.

Liberación y recopilación de NSC Las NSC de la ZEE están separadas del LCR solamente por la monocapa de células ependimarias, aunque permanecen en contacto directo con el contenido ventricular a través de procesos monociliados intercalados 8,9. La neuraminidasa actúa específicamente sobre las células ependimarias a través de la escisión de los residuos de ácido siálico y puede inducir la denudación de la pared ventricular. Esto conduce a la agrupación de neuroblastos en la superficie del ventrículo10,11. Además, se ha observado un flujo de neuroblastos en el LCR después de la inyección i.c.v. de un anticuerpo bloqueador de la integrina-β1, probablemente debido al aflojamiento de las uniones celulares interependimarias12. Estas observaciones han llevado al desarrollo de un protocolo que permite el aislamiento de las células madre y progenitoras del cerebro a través de un compromiso controlado de la integridad de las paredes del ventrículo lateral. En un primer paso, se induce la liberación del parénquima y el posterior flujo de NSC u OPC dentro del LCR a través de la inyección i.c.v. del cóctel de liberación. El cóctel se inyecta estereotáxicamente a una velocidad de 1 μL/min, bilateralmente (2 μL por inyección) en los ventrículos laterales (coordenadas dirigidas a las NSC de la ZEE: AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm; coordenadas dirigidas a las OPC CC: AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). El segundo paso ("recolección") consiste en la realización de biopsias líquidas de LCR de la cisterna magna. Las ratas necesitan ser anestesiadas y la biopsia se puede hacer con jeringas de 1 mL. El uso del dispositivo estereotáxico permite un éxito casi completo en la recuperación de aproximadamente 100 μL de LCR, sin necesidad de incisiones. La biopsia líquida se añade al medio de cultivo helado y se mantiene a 4 °C hasta la siembra durante &lt;3 h (el medio de cultivo NSC contiene medio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM], suplemento de B27 [2%], suplemento de N2 [1%], FGF2 [20 ng/ml] y factor de crecimiento epidérmico [EGF; 20 ng/ml]).
Evaluación histológica de la zona periventricular tras la inyección del cóctel de liberación Una primera cohorte de experimentos reveló que cuando se inyectan más de 3 μL de líquido, los ventrículos pueden dañarse debido a una lesión mecánica inespecífica (Figura 2B,C). La inyección lenta de 2 μL de cóctel de liberación condujo a la aparición de grupos de neuroblastos inmunopositivos a Dcx en la superficie ventricular. Estos grupos permanecieron visibles incluso a los 8 meses después de la inyección (Figura 2D). Como el método estaba destinado a estudios longitudinales, con el objetivo de realizar un seguimiento a largo plazo de los animales, se evaluó el daño tisular causado por el cóctel de liberación. La inmunotinción se realizó en secciones cerebrales de criostato de 14 μm de espesor para marcadores de células ependimarias, como S100β y β-catenina13, y se evaluó la integridad general de la capa ependimaria. Los sitios de denudación de la capa ependimaria estuvieron presentes solo cerca del nivel rostrocaudal de las inyecciones, con una disminución gradual de las perturbaciones de la capa ependimaria detectadas en las áreas más posteriores y más anteriores de la ZEE (Figura 2E, F) y que desaparecieron después de una distancia de ±2 mm del sitio de la inyección. Los resultados mencionados anteriormente muestran que la denudación parcial de la capa ependimaria causada por la inyección i.c.v. del cóctel de liberación es focal, restringida en la proximidad del sitio de inyección, y deja intacta el resto de la capa ependimaria periventricular.
Perfil de marcadores y comportamiento in vitro de las células colectadas Posteriormente, se evaluó el comportamiento in vitro y el perfil de marcadores de las células aisladas mediante el protocolo de ordeño. El rendimiento celular promedio de cada biopsia líquida es de aproximadamente 300 ± 45 células (por biopsia de 100 μL)7. Las biopsias de ordeño dieron como resultado cultivos de NSC con un promedio de 3,17 ± 0,45 de potencial de paso. Las células aisladas de ratas inyectadas con solución salina pudieron pasar en promedio 1,92 ± 0,76 veces; en contraste, los aislados vía ordeño llegaron incluso a nueve pasajes (p = 0,038, prueba t) (Figura 3A)7. La capacidad media de paso de los cultivos de neurosfera postmortem estándar derivados de SEZ es superior a 12 pasadas en nuestras manos. Debido a que se ha demostrado que el potencial de expansión in vivo de las NSC de las ZEE, como lo revelan los experimentos de mapeo del destino celular in vivo 14, es limitado, el ordeño produce células con un comportamiento in vitro significativamente diferente al de las células en cultivos estándar, aunque mucho más cercano al comportamiento de las NSC endógenas. Las células recolectadas se sembraron en pocillos recubiertos de poli-D-lisina. donde crecieron como monocapas adherentes y, más raramente, como neuroesferas (Figura 3B). Las células recién aisladas (recolectadas 3 días después de la inyección y fijadas 24 h después de la siembra) que eran inmunopositivas para el marcador astroglial GFAP también eran inmunopositivas para ID3, un marcador de quiescencia, y tenían la característica de morfología bipolar NSC (Figura 3C). Además, como se informó anteriormente7, una comparación inmunocitoquímica más detallada de las células derivadas de la biopsia y de las células derivadas de la autopsia de los mismos animales, a los 3 días después de la inyección (en busca de astrocitos GFAP+, neuroblastos Dcx+, progenitores de oligodendrocitos PDGFRa+ y células SOX2+ del linaje neural) mostró que el perfil de las células recolectadas era similar al de las células SEZ endógenas (Figura 3D). En particular, cuando se compararon las células derivadas de la biopsia y de los tejidos en diferentes condiciones (por ejemplo, la inyección de un cóctel de liberación con y sin FGF2), se encontró que el factor de crecimiento resultó en un aumento concomitante y significativo en la presencia de células SOX2+, así como en una disminución significativa en la presencia de neuroblastos Dcx+ en ambas muestras (Figura 3D). Estos datos confirmaron que cualquier cambio que aparezca en el perfil de las poblaciones endógenas de NSC se refleja en las muestras de células generadas por el ordeño.
<img alt="Diagrama de adhesión neuronal y bloqueo de anticuerpos β1-integrina en la configuración del experimento de biopsia líquida." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Resumen gráfico del ordeño. Sección coronal de un hemisferio encefálico con los principales puntos de referencia anatómicos (el ventrículo lateral, el cuerpo calloso suprayacente y la comisura anterior por debajo [tractos de sustancia blanca en gris] y la zona subependimaria en las paredes laterales [en azul]). El cóctel de liberación se inyecta en el ventrículo lateral, lo que compromete la integridad del tejido y libera células madre neurales cerebrales postnatales en el líquido cefalorraquídeo, del que se pueden extraer mediante biopsias líquidas. Abreviaturas: ZEE = zona subependimaria; VI = ventrículo lateral; LCR = líquido cefalorraquídeo; pbNSCs = células madre neurales cerebrales postnatales; β1-int = integrina beta1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Microscopía de fluorescencia de la regeneración del tejido neural con análisis de marcadores DCX, Sox2 y β-catenina." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Evaluación histológica de los efectos de las inyecciones i.c.v. (A-D) Imágenes de bajo aumento de la mitad dorsal del ventrículo lateral después de la inmunotinción para Dcx (en rojo, para marcar neuroblastos). (A) La simple inserción i.c.v. de una jeringa Hamilton no altera la citoarquitectura de la SEZ, mientras que la inyección i.c.v. de 10 mL (velocidad de infusión de 1 mL/min) conduce a un daño severo de la pared ventricular independientemente de su contenido. (B) Solución salina y (C) cóctel de liberación. (D) La inyección de 2 μL del cóctel de liberación conduce a un compromiso controlado de la pared ventricular, observado incluso a los 8 meses después de la cirugía. El detalle de mayor aumento de la pared de la ZEE a los 7 y 14 días después de la inyección se muestra en (E) y (F), respectivamente. Hay una estructura desorganizada, con neuroblastos Dcx+ (en verde) descansando en la superficie de la pared y las otras células del nicho (Sox2+, en blanco) descansando más profundamente. El tejido periventricular está dañado a nivel rostrocaudal de la inyección en el punto de tiempo de 2 meses (en G), mientras que el tejido está intacto a un nivel más caudal (en H) en el mismo animal. La pared ventricular se evalúa mediante inmunotinción para los marcadores ependimarios S100β y β-catenina. El detalle de la arquitectura típica de la muralla se muestra en (I). La tinción nuclear se realiza mediante DAPI (que se muestra en azul). Barras de escala = 300 μm (A-C, G, H, recuadros), 150 μm (D), 30 μm (E, F) y 50 μm (I). Esta figura es una modificación de McClenahan et al.13. Abreviaturas: ZEE = zona subependimaria; i.c.v = intracerebroventricular; Dcx = doble cortina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Análisis de diferenciación celular; gráfico de barras, microscopía fluorescente, imágenes histológicas, datos estadísticos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Evaluación de las células aisladas mediante ordeño. (A) Gráfico que muestra el número máximo de pasajes obtenidos por muestra de biopsia líquida de animales inyectados con solución salina (barras grises, total de 12 muestras), o después del ordeño (barras negras, total de 29 muestras, cóctel de liberación con neuraminidasa y anticuerpo bloqueador de integrina-β1). (B) Imagen representativa de microscopía confocal de células primarias obtenidas mediante ordeño, a los 3 días después de la inyección, inmunoteñidas contra GFAP e ID3. (C,D) Imágenes de campo claro de células aisladas 3 días después de la inyección, sembradas en pocillos recubiertos de poli-D-lisina y dejadas crecer en medio de proliferación de NSC durante 7 días. (E) Gráfico que muestra el perfil del tipo celular de las células aisladas mediante ordeño de la ZEE y de la población endógena de NSC de la ZEE de los mismos animales de experimentación. Las fracciones SOX2+ y Dcx+ aumentaron y disminuyeron significativamente, respectivamente, después de la coinyección de FGF2. (Análisis ANOVA de un factor por marcador, seguido de análisis post hoc; n = 4-6 animales por grupo experimental). Barras de escala = 100 μm (C,D) y 10 μm (B). Esta figura es una modificación de McClenahan et al.13. Abreviaturas: ZEE = zona subependimaria; DPI = días después de la inyección; NSC = células madre neurales; Dcx = doble cortina; GFAP = proteína ácida fibrilar glial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí se presenta un método para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos del cerebro de ratas vivas en detalle experimental. Permite múltiples colecciones de estas células de los mismos animales sin comprometer su bienestar.

El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...

Estamos trabajando con células madre neurales cerebrales, células muy dispersas que se agrupan dentro de microambientes especializados llamados nichos. Aunque contribuyen al olfato, la memoria y el aprendizaje, son extremadamente ineficientes para impulsar la regeneración. Así, investigamos sus propiedades y formas de manipularlos para aumentar la cicatrización del tejido nervioso.Hemos demostrado que la contribución de las células madre neurales cerebrales a la regeneración está limitada por factores endógenos y endógenos, como su potencial de diferenciación restringido y su dependencia de factores microambientales. Igualmente, hemos identificado propiedades clave que pueden ser utilizadas para diseñar estrategias para modular su capacidad. El protocolo de ordeño permite la recolección de células progenitoras de células progenitoras de células madre neurales del cerebro y de oligodendrocitos de animales vivos de experimentación.Así, permite un análisis más ininterrumpido de sus propiedades y la realización de estudios longitudinales. En la actualidad, no existen técnicas alternativas para el aislamiento de células madre y progenitoras murinas cerebrales de animales vivos de experimentación. El estándar de comparación actual es el aislamiento postmortem de tales células, lo que introduce varias incertidumbres experimentales y sesgos biológicos.Ahora estamos investigando cómo las células madre neurales del cerebro se activan por la quiescencia existente. También estamos comparando las propiedades de diferentes poblaciones progenitoras del cerebro. Por ejemplo, neurogénicos versus oligodendrogénicos, con el fin de definir sus propiedades diferenciales y sus adaptaciones a microambientes variados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra un protocolo detallado para aislar las paredes del ventrículo lateral del cerebro de ratón adulto y realizar la disociación enzimática del tejido para obtener células individuales. A continuación, estas células se someten a condiciones de cultivo específicas que potencian selectivamente la proliferación de células madre neurales y promueven su diferenciación en cocultivos de oligodendrocitos y astrocitos.

Obtención de un cultivo mixto de oligodendrocitos y astrocitos a partir de células madre neurales de ratón adulto

Este video muestra el proceso de aislar microvasos cerebrales de ratas sacrificadas. Incluye la disección del cerebro, la limpieza del tejido y la digestión mecánica, seguida de una centrifugación repetida para aislar la fracción pura de los microvasos.

Un método para el aislamiento de unidades neurovasculares a partir de cerebro de rata

Este video presenta un método para aislar células madre/progenitoras neurales del tejido periventricular de la médula espinal en ratas adultas. La técnica incluye la incubación de los fragmentos de tejido en una solución que contiene enzimas proteolíticas para alterar la matriz extracelular y liberar las células. Posteriormente, las células liberadas se colocan en un medio que contiene factores de crecimiento específicos que mejoran la proliferación de troncos y progenitores neurales y...

Aislamiento de células progenitoras madre neurales de la región periventricular de la médula espinal de una rata adulta

Este video muestra un método para aislar células primarias de oligodendrocitos de una suspensión de células neuronales obtenida de una cría de ratón utilizando separación magnética. La técnica emplea perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos específicos contra los antígenos de los oligodendrocitos, lo que permite el aislamiento selectivo de estas células.

Aislamiento de oligodendrocitos primarios murinos mediante perlas inmunomagnéticas

Las células madre neurales cosechadas desde el cerebro adulto están aumentando utilizan en aplicaciones que van desde la investigación básica del desarrollo del sistema nervioso para la exploración de potenciales aplicaciones clínicas en medicina regenerativa. Esto hace que el control riguroso de las condiciones de aislamiento y cultivo utilizadas para cultivar estas células críticas para sonar los resultados experimentales.

Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

La médula espinal de los mamíferos adultos contiene células madre/progenitoras neurales (NSPCs) que pueden ser aisladas y expandidas en cultivo. Este protocolo describe la recolección, el aislamiento, el cultivo y el paso de NSPC generados a partir de la región periventricular de la médula espinal adulta de la rata y de donantes de trasplante de órganos humanos.

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Los oligodendrocitos son las células mielinizantes del sistema nervioso central. Este protocolo describe un método para el aislamiento y cultivo de sus precursores, células progenitoras de oligodendrocitos, a partir de cortezas de rata, así como un método cuantitativo rápido y fiable para evaluar la oligodendrogénesis in vitro en respuesta a factores experimentales.

Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Este protocolo describe la fabricación de un sistema de cultivo celular para permitir la siembra de células madre en un andamio de polímero conductor en vitro la estimulación eléctrica y posterior en vivo la implantación del andamio sembrado de células madre usando un técnica mínimamente invasiva.

Eléctricamente conductivo andamio modular y entregar las células madre

Describimos el aislamiento Inmunomagnética de los oligodendrocitos primario de ratón, que permite el aislamiento rápido y específico de las células para el cultivo en vitro .

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

Describimos la producción de cultivos mixtos de astrocitos y células precursoras de oligodendrocitos derivadas de células madre neurales fetales o adultas que se diferencian en oligodendrocitos maduros, y el modelado in vitro de estímulos nocivos. El acoplamiento con una técnica de detección de alto contenido basada en células construye un sistema de detección de drogas confiable y robusto.

Diferenciación de cribado de alto contenido y análisis de maduración de cultivos de células precursoras de oligodendrocitos derivados de células madre neurales fetales y adultas

Aquí, describimos un sistema de nucleofección diseñado para mejorar la eficiencia de la entrega de genes en células madre neurales expandidas (NSC) aisladas de la zona subventricular murina adulta. Los hallazgos demuestran que este método mejora significativamente la perturbación génica en las NSC, superando la efectividad de los protocolos tradicionales de transfección y mejorando la tasa de supervivencia celular.

Aislamiento, expansión y nucleofección de células madre neurales de la zona subventricular murina adulta

Aprende el método de ordeño cerebral para aislar células madre neurales y progenitoras de oligodendrocitos en ratas vivas. Esta técnica permite estudios longitudinales sin comprometer el bienestar animal.

El método de ordeño cerebral para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas (Video) | JoVE Journal

El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas

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