Fluorometría funcional dirigida al sitio en células nativas para estudiar la excitabilidad del músculo esquelético
2 de junio de 2023
La fluorometría funcional dirigida al sitio es un método para estudiar los movimientos del dominio de la proteína en tiempo real. La modificación de esta técnica para su aplicación en células nativas ahora permite la detección y el seguimiento de movimientos de un solo sensor de voltaje de canales Ca2+ dependientes de voltaje en fibras musculares esqueléticas aisladas murinas.
CaV1.1, un miembro de los canales iónicos dependientes de voltaje, tiene cuatro sensores de voltaje distintos. La evidencia sugiere que algunos sensores de voltaje contribuyen más a la activación del receptor de rianodina o a la corriente de calcio. Nuestro objetivo es poder identificar el papel preciso de cada sensor de voltaje en el acoplamiento excitación-contracción y la activación del canal de calcio.
El acoplamiento excitación-contracción se ha estudiado desde principios de los años 50, sin embargo, los detalles moleculares de cómo ocurre este proceso aún se desconocen. El reciente avance en la estructura microscópica ciroelectrónica del canal, la caracterización de la nueva proteína accesoria CaV1.1, el descubrimiento de la variante de empalme alternativo del canal y la identificación de mutaciones causantes de enfermedades han reavivado el interés en este campo. Muchas técnicas se utilizan en nuestro campo, desde la electrofisiología clásica y la biología molecular hasta técnicas más novedosas como la microscopía crioelectrónica, la simulación dinámica molecular, la degradación de proteínas dirigidas y la fluorometría funcional dirigida al sitio, así como células modificadas o modelos animales.
Actualmente, el combustible enfrenta varios desafíos experimentales. En un músculo esquelético, el tráfico adecuado y la comunicación entre CaV1.1 y RyR1, junto con muchas proteínas reguladoras, es crucial para apoyar el acoplamiento excitación-contracción. Los métodos para estudiar directamente estas interacciones proteína-proteína entre CaV1.1 y RyR1 faltan o están incompletos.
El laboratorio del Dr. Martin Schneider ha estado trabajando en el acoplamiento excitación-contracción durante décadas, caracterizando los mecanismos de detección de voltaje en CaV1.1, la liberación de calcio y los eventos localizados de liberación de calcio, conocidos como chispas de calcio. Recientemente, nuestro laboratorio ha estado implementando nuevas técnicas ópticas para investigar varios pasos del acoplamiento excitación-contracción y el movimiento del sensor de voltaje en células musculares adultas funcionales. Si bien esto se ha hecho anteriormente en un sistema de expresión heterólogo, nuestro protocolo ahora permite rastrear cambios conformacionales en sensores de voltaje CaV1.1 durante un potencial de acción propagado en su entorno nativo.
Nuestra nueva técnica nos permitirá investigar el movimiento preciso del sensor de voltaje necesario para el acoplamiento excitación-contracción. Queremos saber qué residuo de carga en cada S4 es crítico para su función, o exactamente cada translocación de S4, y toda esa translocación está relacionada con la apertura de CaV1.1 o la activación del receptor de rianodina.
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Descripción general
Este estudio investiga el movimiento de los sensores de voltaje en los canales de calcio activados por voltaje Kv1.1, cruciales para el acoplamiento excitación-contracción en el músculo esquelético murino. Mediante el uso de fluorometría funcional dirigida a sitios específicos, los investigadores permiten el seguimiento en tiempo real de estos movimientos de dominios proteicos dentro de su contexto celular nativo.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Acoplamiento excitación-contracción
- Canales iónicos activados por voltaje
- Movimientos de dominios proteicos
Antecedentes
- Kv1.1 tiene cuatro sensores de voltaje distintos vinculados a la señalización de calcio.
- Comprender sus funciones precisas podría esclarecer los mecanismos detrás de la contracción muscular.
- Las técnicas anteriores carecían de la capacidad para estudiar estas dinámicas en entornos nativos.
Métodos Utilizados
- Fluorometría funcional dirigida por sitio
- Fibras musculares esqueléticas de ratón
- Marcaje con proteína fluorescente y registro de corriente iónica
Resultados principales
- Seguimiento en tiempo real de los movimientos del sensor de voltaje durante los potenciales de acción.
- Cambios de configuración en los sensores de voltaje Kv1.1 correlacionados con el acoplamiento excitación-contracción.
- Validación del efecto de residuos de carga específicos en la funcionalidad del sensor de voltaje.
Conclusiones
- El estudio proporciona información sobre el comportamiento dinámico de los sensores de voltaje críticos para la función muscular.
- Esta metodología mejora la comprensión tanto de la fisiología normal como de los estados patológicos relacionados con la excitación muscular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La fluorometría funcional con dirección específica en células musculares esqueléticas nativas permite el análisis en tiempo real de los cambios conformacionales en canales iónicos regulados por voltaje, aportando directamente información para la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en la investigación de la excitabilidad muscular. Este enfoque reduce la brecha entre sistemas heterólogos y modelos fisiológicamente relevantes, mejorando la confianza predictiva en carteras dirigidas a canales iónicos. Su integración apoya decisiones más informadas de avance o interrupción en las etapas de descubrimiento y preclínica centradas en indicaciones neuromusculares y canalopatías.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la función del sensor de voltaje en fibras musculares nativas para una validación sólida del blanco.
- Clarifica la contribución mecanicista de dominios específicos del canal al acoplamiento excitación-contracción.
- Apoya la confianza predictiva al vincular reorganizaciones estructurales con resultados funcionales en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Facilita la reducción del riesgo biológico al confirmar la interacción con el blanco en contextos fisiológicamente relevantes.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas de fibras musculares validados para la selección posterior de moduladores que afecten la conformación o función del canal.
- Permite lecturas cuantitativas y reproducibles mediante fluorescencia y electrofisiología para la estandarización de ensayos.
- Facilita la escalabilidad y el reutilización de la plataforma al adaptar el protocolo a otros canales iónicos y proteínas.
- Mejora la fiabilidad de la evaluación de compuestos mediante la integración de mediciones estructurales y funcionales en tiempo real.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad al utilizar fibras musculares murinas adultas para lograr continuidad traslacional.
- Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar información mecanicista sobre los defectos en el acoplamiento excitación-contracción.
- Facilita la alineación de biomarcadores mediante la medición cuantitativa de la dinámica del sensor de voltaje vinculada a resultados funcionales.
- Reduce el riesgo en programas preclínicos dirigidos a canalopatías iónicas al validar hipótesis mecanicistas en tejido nativo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la identificación de compuestos líder y estudios mecanicistas preclínicos, particularmente para programas de canales iónicos y excitabilidad muscular.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al medir directamente los movimientos del sensor de voltaje durante los potenciales de acción.
- Selección: Proporciona sistemas listos para ensayos, reproducibles, con salidas cuantitativas de fluorescencia y corriente.
- Análisis: Ofrece mediciones cuantitativas con resolución temporal de cambios conformacionales para análisis comparativo entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Mantiene continuidad al utilizar fibras musculares nativas, favoreciendo la alineación de biomarcadores y modelos de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable adaptable a otros canales iónicos y proteínas de membrana en tejidos musculares y excitables.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas de canales iónicos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de ensayos funcionales en sistemas nativos.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir la reducción temprana de riesgos mecanicistas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de programas dirigidos a canales iónicos y al músculo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología, imágenes de fluorescencia y biología molecular para el diseño de constructos y la interpretación de datos.
- Necesita instrumentación especializada para la grabación simultánea de fluorescencia y corriente en fibras musculares.
- Exige estandarización entre equipos para lograr reproducibilidad en diferentes dianas de canales iónicos y constructos.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir optimización de los protocolos de transfección y marcado.
- Las limitaciones potenciales incluyen tinción de fondo y artefactos por movimiento, lo que exige controles experimentales cuidadosos.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
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Introduction
2:55
Construct Design for Transfecting Cysteine‐Engineered Voltage‐Gated Ca2+ Channels in Murine Isolated Skeletal Muscle Fibers
4:05
Assessment of EGFP‐Positive Fiber Electrical Activity, Cysteine Staining, and Signal Acquisition
