Name: Detección eléctrica de sustratos de células para la evaluación en tiempo real de perfiles toxicológicos de estructuras metal-orgánicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Aprende a evaluar la toxicidad de estructuras metal-orgánicas en células epiteliales pulmonares humanas mediante ECIS en tiempo real. Este método de alta eficiencia permite monitorear continuamente sin reactivos externos.

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Este trabajo fue financiado en parte por el programa T32 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS, por sus siglas en inglés) (T32 GM133369) y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF 1454230 por sus siglas en inglés). Además, se agradece la asistencia y el apoyo de las Instalaciones de Investigación Compartidas de WVU y la Biofísica Aplicada.

1. Síntesis ZIF-8
<ol><li>Para el propósito de este ejemplo, utilice una relación de masa de 1:10:100 (metal:enlazador:disolvente) para sintetizar el ZIF-8. Para ello, mida el hexahidrato de nitrato de zinc y registre la medición. Utilice el ejemplo de relación de masa para calcular la cantidad necesaria para el enlazador, el 2-metilimidazol y el solvente (es decir, metanol).</li>
	<li>Coloque el hexahidrato de nitrato de zinc y el enlazador en dos viales de vidrio diferentes. Agregue la mitad de la cantidad calculada de metanol al hexahidrato de nitrato de zinc y la otra mitad al enlazador. Deje que cada solución se disuelva.</li>
	<li>Combine las dos soluciones (es decir, soluciones que contengan el metal y el enlazador, respectivamente). Coloque el recipiente con la solución combinada para la reacción en una placa de agitación y agite a 700 rpm durante 24 h a temperatura ambiente (RT).</li>
</ol>2. Colección ZIF-8
<ol><li>Una vez concluida la reacción anterior (es decir, después de 24 h), coloque la solución en tubos de centrífuga de 50 ml y centrifugue a 3.075 x g durante 5 min (use cantidades iguales y equilibre el rotor). Retire cualquiera de los sobrenadantes de los tubos centrífugos.</li>
	<li>Agregue metanol (5-15 mL) a los tubos de centrífuga y vuelva a dispersar las partículas.</li>
	<li>Repita los pasos de centrifugación y lavado al menos de dos a cuatro veces más. Después del último lavado, descargue el sobrenadante. NOTA: Los pasos de lavado eliminan cualquier especie no precipitada.</li>
	<li>Retire las tapas de los tubos y coloque cinta parafilm sobre la parte superior; Posteriormente, haz agujeros en el parafilm. Colocar el/los tubo/s que contiene la muestra en una cámara de vacío a RT para que se seque durante 24 h.</li>
</ol>3. Morfología de la superficie ZIF-8 (microscopía electrónica de barrido [SEM])
<ol><li>Monte los polvos secos de ZIF-8 en cinta de carbón y pulverize durante 120 s con oro-paladio para evitar cualquier carga que pueda ocurrir durante el análisis SEM.</li>
	<li>Ajuste la tensión de aceleración del microscopio a 15 kV. Enfoca las partículas y ajusta el aumento (se utilizaron aumentos de 500x, 1.000x, 1.500x, 4.000x, 10.000x, 20.000x, 30.000x y 40.000x).</li>
	<li>Visualice las partículas bajo el aumento que permite una evaluación clara del tamaño de partícula y la morfología (se recomienda considerar rangos para partículas de 5 μm, 10 μm y 20 μm).</li>
	<li>Recopile datos de al menos tres campos de visión diferentes y, para cada uno, considere diferentes aumentos.</li>
</ol>4. Composición elemental de ZIF-8
<ol><li>Siga los pasos para la obtención de imágenes SEM.</li>
	<li>Utilizando la unidad de espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDX) del microscopio SEM, analice la composición elemental de la muestra.</li>
	<li>Asegúrese de que el voltaje de aceleración y el aumento del SEM coincidan con el monitor EDX. Apague la cámara infrarroja del microscopio SEM.</li>
	<li>En el monitor EDX, vaya a Recopilar espectro e introduzca un tiempo de recogida de 200 s. Esto se recomienda para evitar la carga y desintegración de partículas que podrían dar lugar a evaluaciones falsas.</li>
	<li>Recopile datos de al menos tres campos de visión diferentes. Una vez finalizada la recopilación, analice los datos e identifique los elementos de interés.</li>
</ol>5. Cultivo celular
<ol><li>El cultivo inmortalizó las células BEAS-2B en medios suplementados con suero fetal bovino (FBS) al 5% y penicilina/estreptomicina al 0,2%. NOTA: Se deben utilizar pasajes entre 5 y 10 para asegurarse de que no se hayan producido cambios fenotípicos en el lote de células que se está utilizando37 (todos los reactivos se enumeran en la Tabla de Materiales).</li>
	<li>Tome una placa de cultivo celular de 100 mm y coloque 10 ml del medio en la placa. Agregue 1 ml de la solución celular BEAS-2B a la placa.</li>
	<li>Coloque la placa en una incubadora (37 °C, 5% CO2) y deje que las células crezcan.</li>
	<li>Revise la placa después de 24 h para determinar si las células han alcanzado el 80% de confluencia. En este caso, la confluencia del 80% se refiere al porcentaje de la superficie cubierta por células adheridas. De lo contrario, cambie el medio y deje que las células crezcan hasta alcanzar el nivel de confluencia del 80%.</li>
</ol>6. Recuento de células
<ol><li>Una vez que las células de la placa hayan alcanzado una confluencia del 80%, retire el medio de la placa. Lave la placa con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Retire el PBS de la placa. Añadir 2 mL de tripsina a la placa y colocarla en la incubadora (37 °C, 5% CO 2) durante2 min.</li>
	<li>Agregue 2 ml de medio a la placa y pipetee el medio hacia arriba y hacia abajo para eliminar las células de la placa. Transfiera la solución a un tubo de 15 ml y centrifugue a 123 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante del tubo y agregue 2 ml de medio. Pipetea el medio hacia arriba y hacia abajo para redispersar las células.</li>
	<li>Con un tubo de 1,5 ml, agregue 20 μl de azul de tripano y luego 20 μl de la solución celular (proporción 1:1 de azul de tripano:solución celular).</li>
	<li>Coloque 10 μL de la mezcla de células en un portaobjetos de vidrio y colóquelo en un contador automático de células. Espere hasta que la pantalla se enfoque, luego seleccione capturar.</li>
	<li>La pantalla muestra el número de células vivas y la viabilidad de las células. El rango de medición se extiende de 1 x 104 a 1 x 107 celdas.</li>
	<li>Alternativamente, cuente las células manualmente con un hemocitómetro.<ol><li>Para ello, agregue 15-20 μL de la solución celular tratada con azul de tripano al hemocitómetro.</li>
		<li>Utilice un microscopio vertical con un enfoque objetivo de 10x en las líneas de cuadrícula del hemocitómetro.</li>
		<li>Cuenta el número de celdas en los cuatro cuadrados exteriores y divide el número entre cuatro. Luego, multiplícalo por 10,000 para obtener el número de recuento de células vivas.</li>
		<li>Para calcular la viabilidad celular, sume el recuento de células vivas y muertas para obtener el recuento total de células y, posteriormente, divida el recuento de células vivas por el recuento total de células.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Preparación de la dosis ZIF-8
<ol><li>Prepara una solución madre ZIF-8 de 1 mg/ml. Para ello, mida la cantidad de ZIF-8 y añada agua desionizada (DI) a las partículas hasta alcanzar una concentración de 1 mg/mL.</li>
	<li>Sonicar (poner el sonicador en sónicos) la solución madre ZIF-8 durante 2 min a intervalos de 30 s en un baño de agua.</li>
	<li>Realice diferentes dosis de ZIF-8 para exposiciones celulares calculando la cantidad de solución madre y el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) necesarios para alcanzar las dosis deseadas utilizando la ecuación C1V1 = C 2 V2. Las dosis oscilarán entre 0 y 950 μg/mL. NOTA: En este experimento se seleccionaron dosis de 0 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL y 950 μg/mL.</li>
</ol>8. Concentración inhibitoria media máxima (IC 50)
<ol><li>Después del recuento celular, siembre las células BEAS-2B a una densidad de 4 x 104 células/ml en una placa de 96 pocillos, con un volumen de 100 μl/pocillo.<ol><li>Para alcanzar una densidad de 4 x 104 células/ml, utilice C 1 V1= C 2 V2para calcular la cantidad de solución celular necesaria para combinar con el medio.</li>
		<li>Asegúrese de mantener los pocillos en blanco para cada dosis; deje estos pozos vacíos hasta la exposición a ZIF-8.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque la placa de 96 pocillos en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 y deje que las células crezcan hasta convertirse en una monocapa confluente durante 24 h.</li>
	<li>Retire los medios de los pocillos y exponga las células BEAS-2B a dosis de ZIF-8 que oscilan entre 0 y 950 μg/ml. Agregue 100 μL de ZIF-8 a sus respectivos pocillos en blanco y celulares.</li>
	<li>Vuelva a colocar las placas de 96 pocillos en la incubadora durante un tiempo de exposición de 48 h.</li>
	<li>Después de la exposición, añadir 10 μL de 4-[3-(4-idofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benceno disulfonato (WST-1) a cada pocillo (pocillos en blanco y celulares) e incubar durante 2 h. Los medios de comunicación se quedan en los pozos; La relación es de 1:10 (reactivo:medio).</li>
	<li>Lea los cambios en la absorbancia en un lector de placas utilizando una absorbancia de 485 nm.</li>
	<li>Calcule la viabilidad de la célula a través del software para determinar el valor IC 50 (consulte la sección10 ).</li>
</ol>9. Detección de impedancia de sustrato de celda eléctrica (ECIS)
<ol><li>Utilice una placa de 96 pocillos (96W10idf) para realizar el análisis ECIS. La placa28 contiene electrodos de conexión de dedos interdigitados que cubren un área de aproximadamente 4 mm2.</li>
	<li>Primero, pruebe que todos los pozos estén siendo leídos por los sensores. Para ello, coloque la placa de 96 pocillos en la estación de pocillos y haga clic en el botón Configuración .</li>
	<li>Si los pozos están conectados correctamente, aparecerá el color verde; Todos los pozos no conectados se identificarán en rojo. Si surge tal caso, retire y vuelva a insertar la placa del pocillo y vuelva a hacer clic en el botón Configurar , hasta que todos los pocillos ofrezcan lecturas verdes viables.</li>
	<li>Estabilice los electrodos durante 40 minutos con 200 μL de medio por pocillo para evitar la deriva de potencial. Agregue 200 μL de medio a cada pocillo que se utilice y luego coloque la placa de 96 pocillos en la estación ECIS. Haga clic en Configuración/Verificación para asegurarse de que la placa esté conectada correctamente. Haga clic en Estabilizar.</li>
	<li>Una vez completada la estabilización, retire la placa de la estación y retire el medio de cada pocillo.</li>
	<li>Siembre las células BEAS-2B a una densidad de 4 x 104 células/ml, con un volumen de 100 μl por pocillo, en los pocillos que contienen las células y coloque la placa en la estación ECIS de la incubadora.</li>
	<li>En el monitor, haga clic en Comprobar para determinar que todos los electrodos son leídos por los sensores de la estación.</li>
	<li>Configure la medición del curso de tiempo seleccionando Frecuencia múltiple/Tiempo (MFT). El programa medirá cada pocillo en siete frecuencias diferentes.</li>
	<li>Haga clic en Inicio y deje que funcione durante 24 horas para que las células puedan formar una monocapa confluente.</li>
	<li>Después de 24 h, los pocillos que contienen células mostrarán una mayor resistencia en el monitor. Este es un indicador de que las células se han unido a los electrodos.</li>
	<li>Presione Pausa en el monitor para detener la recopilación de datos.</li>
	<li>Realice las dosis de ZIF-8 en, por encima y por debajo del valor IC50 calculado siguiendo los pasos descritos en la sección 7 anterior.</li>
	<li>Exponga las nanopartículas ZIF-8 a sus respectivos pocillos en blanco y celdas a un volumen de 100 μL por pocillo y vuelva a colocar la placa de 96 pocillos en la estación.</li>
	<li>Haga clic en Verificar nuevamente en el monitor para asegurarse de que los sensores estén leyendo todos los electrodos. Haga clic en Reanudar y deje que el sistema funcione durante 72 h para monitorear el comportamiento celular y la conexión.</li>
	<li>Una vez finalizada la recopilación de datos, haga clic en Finalizar en el monitor. Para guardar el archivo, haga clic en Archivo > Guardar como. Guarde los datos como un archivo de hoja de cálculo.</li>
	<li>Para obtener los parámetros alfa, haga clic en Modelo. En la ventana emergente de la pantalla, haga clic en Pozo de solo medios, luego seleccione el pozo que solo tiene medios.</li>
	<li>Haga clic en Establecer referencia. En el monitor, haga clic en Buscar.</li>
	<li>Si el pozo que se muestra en el sistema no es el mismo que el elegido, repita el paso 9.16.</li>
	<li>Haga clic en Establecer. Haga clic en Ajustar rango T para determinar el rango de tiempo deseado para la recopilación de datos.</li>
	<li>Mientras se procesa, haga clic en Alfa. Cuando el sistema termine el análisis, haga clic en Guardar RbA y guárdelo como un archivo de hoja de cálculo. NOTA: Consulte el manual del ECIS, que se puede encontrar en el sitio web del fabricante38.</li>
</ol>10. Análisis de datos
<ol><li>SEM<ol><li>Abra el software de imágenes para analizar las imágenes SEM. Haga clic en Archivo > Abrir y, a continuación, seleccione la imagen que desea analizar.</li>
		<li>Haga clic en Imagen > escriba > 8 bits para convertir la imagen a escala de grises y realizar la operación de umbral.</li>
		<li>Calibra la medida de distancia de píxeles a micras. Haga clic en la herramienta Línea recta y trace la longitud de cada partícula que se desea medir.</li>
		<li>Haga clic en Analizar y, a continuación, en Establecer escala. La distancia conocida se establecerá en la longitud del tamaño de la barra de escala en la imagen SEM. La unidad de longitud conocida se establecerá en micras. Marque Global y presione Aceptar.</li>
		<li>Haga clic en la herramienta Línea recta y trace el diámetro de la partícula, luego seleccione Analizar y medir. Registre el resultado de la longitud.</li>
		<li>Repita el procedimiento para todas las imágenes recopiladas. Promedie todos los diámetros de al menos 60 partículas para una evaluación estadística adecuada.</li>
	</ol></li>
	<li>EDX<ol><li>Promedie todos los porcentajes de peso de cada elemento a partir de todas las imágenes recopiladas (consulte la sección EDX anterior).</li>
		<li>Usando una hoja de cálculo, trace un gráfico de barras de cada elemento en el eje x y su porcentaje de peso elemental promedio en el eje y.</li>
	</ol></li>
	<li>IC50<ol><li>Promedie los pocillos en blanco y promedie los pocillos de dosis para cada réplica.</li>
		<li>Calcule el blanco ajustado restando el promedio del blanco de control del promedio del blanco de dosis. Calcule el valor real de la celda para cada dosis restando el blanco ajustado del valor medio de la dosis.</li>
		<li>Reste el valor en blanco ajustado para cada dosis del valor de control promedio. Calcule la viabilidad celular de cada dosis utilizando la ecuación: viabilidad celular = (valor de celda real/(valor de control - valor en blanco ajustado)) x 100.</li>
		<li>Repita esto para todas las demás réplicas.</li>
		<li>Promedie la viabilidad celular de cada réplica para obtener la viabilidad celular final de cada dosis.</li>
		<li>En el software, elija la pestaña XY en la pantalla.</li>
		<li>Introduzca los valores de concentración (dosis) en la columna X y la viabilidad celular (%) de cada dosis en la columna Y.</li>
		<li>Transforme los valores X haciendo clic en Analizar > Transformar > Aceptar y Transformar X = Log(X).</li>
		<li>Normalice los valores Y seleccionando la hoja de datos transformados , haciendo clic en Analizar y, a continuación, seleccionando Normalizar.</li>
		<li>Seleccione la hoja de datos Normalizar de transformar , haga clic en Analizar y seleccione Regresión no lineal (ajuste de curva). Seleccione Dosis-Respuesta-Inhibición y haga clic en Log(Inhibidor) Vs. Pendiente variable de respuesta (cuatro parámetros). Haga clic en Aceptar para ver los resultados.</li>
	</ol></li>
	<li>ECIS<ol><li>De la hoja de cálculo, tome las columnas de resistencia (ohmios) para cada réplica (pocillos en blanco y pocillos de dosis) y promedie juntos a partir de la frecuencia de 4.000 Hz. Esta frecuencia permite la evaluación del contacto célula-célula38.</li>
		<li>Calcule la resistencia corregida restando el blanco promedio de la dosis promediada para cada réplica. Promediar la resistencia corregida para las réplicas para cada dosis.</li>
		<li>Repita los mismos pasos para los valores alfa para calcular el parámetro alfa promedio. Represente el eje x como tiempo (h) y el eje y como los valores medios de resistencia/alfa para cada valor de dosis.</li>
	</ol></li>
</ol>11. Análisis estadístico
<ol><li>SEM<ol><li>Realice una desviación estándar en el archivo de hoja de cálculo donde se calcularon los diámetros promedio de las partículas ZIF-8.</li>
		<li>Utilizando la función STDEV en la hoja de cálculo, resalte los datos de las 60 partículas y haga clic en Enter. Grafique la desviación estándar para cada diámetro promedio calculado.</li>
	</ol></li>
	<li>EDX<ol><li>De forma similar a SEM (pasos 11.1.1-11.1.2), calcule la desviación estándar para cada composición elemental media utilizando la función STDEV en la hoja de cálculo. Grafique las desviaciones estándar para cada composición elemental promedio.</li>
	</ol></li>
	<li>IC50<ol><li>Abra el software utilizado para calcular el IC50 y haga clic en Hoja de datos agrupados.</li>
		<li>Ingrese las dosis de ZIF-8 en las filas etiquetadas como Grupo A, Grupo B, etc. Introduzca la viabilidad celular media para cada dosis y replique en la columna correspondiente a la dosis de ZIF-8.</li>
		<li>Haga clic en Analizar y, en Análisis de columnas, seleccione ANOVA de un factor (y no paramétrico o mixto).</li>
		<li>En la pestaña Diseño experimental , seleccione Sin coincidencia ni emparejamiento. En Distribución gaussiana de residuos, seleccione Sí usar ANOVA. Por último, seleccione Sí Usar prueba de ANOVA ordinaria en Asumir SD iguales.</li>
		<li>En la pestaña Comparaciones múltiples , seleccione Comparar la media de cada columna con la media de una columna de control. Haga clic en Aceptar para ver los resultados.</li>
	</ol></li>
</ol>

Evaluación de los cambios en el comportamiento de las células inducidos por MOF mediante la detección eléctrica del sustrato de la célula

Los autores no reportan conflictos de interés en este trabajo.

Un análisis anterior mostró que ECIS podría usarse para evaluar el comportamiento de las células expuestas a analitos (es decir, nanotubos de carbono35, fármacos43 o nanoarcillas16). Además, Stueckle et al. utilizaron ECIS para evaluar la toxicidad de las células BEAS-2B expuestas a nanoarcillas y sus subproductos y encontraron que el comportamiento celular y la unión dependían de las características fisicoquímicas de dichos materiales<sup class="xre...

Las estructuras metal-orgánicas (MOF) son híbridos formados a través de la combinación de iones metálicos y enlazadores orgánicos 1,2 en disolventes orgánicos. Debido a la variedad de tales combinaciones, los MOF poseen diversidad estructural3, porosidad sintonizable, alta estabilidad térmica y altas áreas superficiales 4,5. Tales características los hacen candidatos atractivos en una variedad de aplicaciones, desde el almacenamiento de gas 6,7 hasta la catálisis8,9, y desde los agentes de contraste 10,11 hasta las unidades de administración de fármacos 12,13. Sin embargo, la aplicación de los MOF en esas aplicaciones ha suscitado preocupaciones en relación con su seguridad tanto para los usuarios como para el medio ambiente. Estudios preliminares han demostrado, por ejemplo, que la función celular y el crecimiento cambian tras la exposición de las células a iones metálicos o enlazadores utilizados para la síntesis de MOF 1,14,15. Por ejemplo, Tamames-Tabar et al. demostraron que ZIF-8 MOF, un MOF basado en Zn, estaba provocando más cambios celulares en una línea celular de cáncer de cuello uterino humano (HeLa) y una línea celular de macrófagos de ratón (J774) en relación con los MOF basados en Zr y Fe. Tales efectos se debieron presumiblemente al componente metálico de ZIF-8 (es decir, Zn), que podría inducir la apoptosis celular tras la desintegración del marco y la liberación del ion Zn1. De manera similar, Gandara-Loe et al. demostraron que HKUST-1, un MOF basado en Cu, causó la mayor reducción en la viabilidad de las células de retinoblastoma de ratón cuando se usó en concentraciones de 10 μg/mL o más. Esto se debió presumiblemente al ion metal Cu incorporado durante la síntesis de este marco, el cual, una vez liberado, podría inducir estrés oxidativo en las células expuestas15.
Además, el análisis mostró que la exposición a MOF con diferentes características fisicoquímicas podría dar lugar a respuestas variables de las células expuestas. Por ejemplo, Wagner et al. demostraron que ZIF-8 y MIL-160 (un marco basado en Al), utilizados en la exposición de una célula epitelial bronquial humana inmortalizada, condujeron a respuestas celulares dependientes de las propiedades fisicoquímicas de los marcos, a saber, hidrofobicidad, tamaño y características estructurales16. Complementariamente, Chen et al. demostraron que una concentración de 160 μg/mL de MIL-100(Fe) expuesta a células hepáticas humanas normales (HL-7702) causó la mayor pérdida de viabilidad celular, presumiblemente debido al componente metálico de este marco específico (es decir, Fe17).
Si bien estos estudios clasifican los efectos nocivos de los MOF en los sistemas celulares en función de sus características fisicoquímicas y concentraciones de exposición, lo que plantea posibles preocupaciones con la implementación del marco, especialmente en los campos biomédicos, la mayoría de estas evaluaciones se basan en ensayos colorimétricos de un solo punto de tiempo. Por ejemplo, se demostró que cuando se utilizaron ensayos de bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) tetrazolio (MTT) y sal de tetrazolio soluble en agua (WST-1), estos reactivos bioquímicos podían dar lugar a falsos positivos en sus interacciones con las partículas a las que también estaban expuestas las células18. Se demostró que la sal de tetrazolio y los reactivos rojos neutros poseen una alta afinidad de adsorción o unión a las superficies de las partículas, lo que resulta en interferencia de la señal del agente19. Además, para otros tipos de ensayos, como la citometría de flujo, que anteriormente se había demostrado que se utilizaba para evaluar los cambios en las células expuestas a los MOF20,21, se demostró que los principales problemas deben evitarse si se quiere considerar un análisis viable de los efectos nocivos de las partículas. En particular, deben abordarse los rangos de detección de los tamaños de las partículas, especialmente en poblaciones mixtas como las que ofrecen los MOF o las referencias de las partículas utilizadas para la calibración antes de los cambios celulares22. También se demostró que el colorante utilizado durante el marcaje celular para tales ensayos de citometría también podría interferir con las nanopartículas a las que las células fueron expuestas23.
El objetivo de este estudio era utilizar un ensayo de evaluación de alto rendimiento en tiempo real para evaluar los cambios en el comportamiento celular tras la exposición a un MOF seleccionado. Las evaluaciones en tiempo real pueden ayudar a proporcionar información sobre los efectos dependientes del tiempo, en relación con las ventanas de exposición16. Además, proporcionan información sobre los cambios en las interacciones célula-sustrato, la morfología celular y las interacciones célula-célula, así como la forma en que dichos cambios dependen de las propiedades fisicoquímicas de los materiales de interés y de los tiempos de exposición24,25 respectivamente.
Para demostrar la validez y aplicabilidad del enfoque propuesto, se utilizaron células epiteliales bronquiales humanas (BEAS-2B), ZIF-8 (un marco hidrofóbico de imidazolatozeolítico 16) y detección de impedancia eléctrica de sustrato celular (ECIS). Las células BEAS-2B representan un modelo de exposición pulmonar 26 y se han utilizado previamente para evaluar los cambios en la exposición de las células a nanoarcillas y sus subproductos degradados térmicamente26,27,28, así como para evaluar la toxicidad de los nanomateriales, como los nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT)18. Además, estas células se han utilizado durante más de 30 años como modelo para la función epitelial pulmonar29. Se eligió ZIF-8 debido a su amplia implementación en catálisis30 y como agentes de contraste31 para la bioimagen y la administración de fármacos32 y, por lo tanto, por el potencial extendido de exposición pulmonar durante tales aplicaciones. Por último, ECIS, la técnica no invasiva en tiempo real, se utilizó previamente para evaluar los cambios en la adherencia, proliferación, motilidad y morfología celular 16,26 como resultado de una variedad de interacciones entre analitos (tanto materiales como fármacos) y células expuestas en tiempo real16,18,28. ECIS utiliza una corriente alterna (CA) para medir la impedancia de las celdas inmovilizadas en electrodos de oro, y los cambios de impedancia brindan información sobre los cambios en la resistencia y la capacitancia en la interfaz célula-sustrato de oro, la función de barrera inducida por las interacciones célula-celda y la cobertura de la capa sobre celda de dichos electrodos de oro33,34. El uso de ECIS permite realizar mediciones cuantitativas a una resolución a nanoescala de forma no invasiva y en tiempo real26,34.
Este estudio evalúa y compara la simplicidad y facilidad de evaluación de los cambios inducidos por MOF en el comportamiento celular en tiempo real con las evaluaciones de ensayos de un solo punto. Un estudio de este tipo podría extrapolarse aún más para evaluar los perfiles celulares en respuesta a la exposición a otras partículas de interés, lo que permitiría realizar pruebas de partículas seguras por diseño y ayudar posteriormente a la implementación. Además, este estudio podría complementar los ensayos genéticos y celulares que son evaluaciones de un solo punto. Esto podría conducir a un análisis más informado de los efectos nocivos de las partículas en la población celular y podría utilizarse para detectar la toxicidad de dichas partículas de una manera de alto rendimiento16,35,36.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 4-[3-(4-idofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benceno disulfonato (ensayo WST-1)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5015944001</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25255-056</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>1300 Series A2 campana de biohumos</td><td>Thermo Scientific</td><td>323TS</td><td></td></tr><tr><td>2510 Branson sonicador de baño</td><td>Equipos de proceso & Suministro, Inc.&nbsp;</td><td>251OR-DTH</td><td></td></tr><tr><td>2-metilimidazol, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>693-98-1</td><td></td></tr><tr><td>5 mL microtubo estéril</td><td>Argos Technologies</td><td>T2076S-CA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL&nbsp; tubos&nbsp;</td><td>Placas</td><td></td> de pocillos Falcon 352098 <td></td></tr><tr><td>96W10idf</td><td>Biofísica Aplicada&nbsp;</td><td>96W10idf PET</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biorender</td><td>Biorender N/A</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL contador de células automatizado</td><td>Life Technologies</td><td>C0916-186A-0303</td><td></td></tr><tr><td>Denton Desk V pulverizador catódico y recubridor de carbono</td><td>Denton Vacuum</td><td>N/A sulfóxido</td><td></td></tr><tr><td>de dimetlio&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Cytiva modificado</td><td></td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle medium</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>ECIS-Z&Theta;</td><td>Biofísica Aplicada&nbsp;</td><td>ABP 1129</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Versión 2301</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon (15 mL)</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Lector de placas OPTIMA</td><td>BMG LABTECH</td><td>413-2132</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software (9.0.0)</td><td>GraphPad Software, LLC</td><td>versión 9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2</td><td>Incubadora Thermo Scientific</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Hitachi S-4700 Microscopio electrónico de barrido por emisión de campo equipado con rayos X de dispersión de energía&nbsp;</td><td>Hitachi High-Technologies Corporation</td><td>S4700 y EDAX TEAM software</td><td></td>de análisis</tr><tr><td>Software ImageJ Institutos</td><td>Nacionales de Salud</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Células epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas</td><td>Colección de cultivo tipo americano</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Congelador isotemp</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol, 99%</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Película de sellado Parafilm</td><td>The Lab Depot</td><td>HS234526A</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Steptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004220</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall T 6000B</td><td>DU PONT</td><td>&nbsp; T6000B</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano, solución al 0,4% en PBS</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>Cámara</td> de vacío 1691049 <td></td></tr><tr><td></td><td>Belart</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de zinc hexahidratado, 98% extra puro</td><td>Acros Organic</td><td>101-96-18-9</td><td></td></tr></tbody></table>

detección eléctrica de sustratos de células para la evaluación en tiempo real de perfiles toxicológicos de estructuras metal-orgánicas

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

Los marcos metal-orgánicos (MOF) son híbridos formados a través de la coordinación de iones metálicos y enlazadores orgánicos en disolventes orgánicos. La implementación de MOF en aplicaciones biomédicas e industriales ha generado preocupaciones con respecto a su seguridad. En este trabajo, se evaluó el perfil de un MOF seleccionado, un marco de imidazol zeolítico, tras la exposición a células epiteliales pulmonares humanas. La plataforma para la evaluación fue una técnica en tiempo real (es decir, detección de impedancia eléctrica de sustrato de célula [ECIS]). Este estudio identifica y discute algunos de los efectos nocivos del MOF seleccionado en las células expuestas. Además, este estudio demuestra los beneficios de utilizar el método en tiempo real frente a otros ensayos bioquímicos para evaluaciones celulares completas. El estudio concluye que los cambios observados en el comportamiento celular podrían insinuar una posible toxicidad inducida por la exposición a MOF de diferentes características fisicoquímicas y la dosis de esos marcos que se utilizan. Al comprender los cambios en el comportamiento celular, se prevé la capacidad de mejorar las estrategias de seguridad por diseño de los MOF que se utilizarán para aplicaciones biomédicas mediante la adaptación específica de sus características fisicoquímicas.

Utilizando una línea celular modelo in vitro común39 (BEAS-2B), este estudio tuvo como objetivo demostrar la viabilidad y aplicabilidad de ECIS para evaluar los cambios en el comportamiento celular tras la exposición a un MOF sintetizado en laboratorio. La evaluación de estos cambios se complementó con el análisis a través de ensayos colorimétricos convencionales.
En primer lugar, se evaluaron las características fisicoquímicas del marco para asegurar la reprod...

El siguiente estudio evalúa el perfil toxicológico de un marco metal-orgánico seleccionado utilizando la detección eléctrica de impedancia de sustrato de celda (ECIS), una técnica de detección de alto rendimiento en tiempo real.

Detección eléctrica de sustratos de células para la evaluación en tiempo real de perfiles toxicológicos de estructuras metal-orgánicas

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...

Mi investigación tiene como objetivo evaluar los cambios en el comportamiento de las células epiteliales pulmonares humanas tras la exposición a estructuras orgánicas metálicas, híbridos formados por la combinación de iones metálicos en enlazadores orgánicos en disolventes orgánicos. Esta investigación demostró que la composición física y química de las estructuras orgánicas metálicas, así como sus proporciones de exposición celular, afectan el comportamiento de las células epiteliales pulmonares humanas de una manera dependiente del tiempo y la dosis. Esto se puede registrar en un alto rendimiento en tiempo real.Nuestra investigación ayuda a evaluar y comprender los mecanismos de toxicidad de los marcos orgánicos metálicos al exponerse a los sistemas celulares. El método actual permite la monitorización continua de células en tiempo real y con un alto rendimiento. Además, este método no depende de ningún reactivo externo y, por lo tanto, reduce cualquier posible interferencia que puedan tener con los marcos utilizados para la exposición.Nuestro laboratorio continuará centrándose en la comprensión y evaluación de los mecanismos de toxicidad asociados con la exposición a nanomateriales, así como en el uso de dicha información para sintetizar sistemas nuevos y seguros que podrían implementarse en aplicaciones biomédicas con riesgos mínimos para el usuario o el medio ambiente.

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Bioengineering

Bioingeniería

El transistor orgánico electroquímico está integrado con células vivas y se utiliza para controlar el flujo de iones a través de la barrera epitelial intestinal. En este estudio, un incremento en el flujo de iones, relacionados con la alteración de las uniones estrechas, inducida por la presencia de la EGTA quelante de calcio (ácido etilenglicol-bis (beta-aminoetil éter)-N, N, N ', N'-tetra acético ácido), se mide.

Detección de barrera interrupción del tejido con un transistor orgánico Electroquímica

Los ensayos de neurotoxicidad in vitro mejorados ayudarían a la identificación de nuevos compuestos neuroprotectores. Se presenta la utilidad de un analizador celular basado en impedancia en tiempo real para determinar la citotoxicidad y la citoprotección en líneas celulares neuronales y para delinear la participación de las vías de segundo mensajero, obteniendo así información sobre el mecanismo de la neuroprotección.

Cell Analyzer basados ​​en impedancia Real-Time como una herramienta para delinear vías moleculares implicadas en la neurotoxicidad y neuroprotección en una línea celular neuronal

Este manuscrito describe cómo preparar biochips fluídicos con células epiteliales branquiales de trucha arco iris para su uso en un sensor de impedancia de sustrato de celda eléctrica portátil de campo.  También se describe el protocolo para realizar una prueba rápida de toxicidad del agua potable con el sensor.

Preparación y ensayo de impedancia basada en biochips fluido con células RTgill-W1 para evaluación rápida de muestras de agua potable para la toxicidad

El objetivo del estudio fue evaluar el impacto biológico de 15 componentes del humo de cigarrillo utilizando una combinación de un analizador de células en tiempo real basado en impedancia y una plataforma basada en cribado de alto contenido (HCS) para la evaluación toxicológica in vitro. Este estudio proporciona información sobre las dosis efectivas, la toxicidad y los modos de acción de los compuestos probados.

Análisis alta Content Screening para evaluar los efectos toxicológicos de nocivo Componentes y potencialmente perjudicial (HPHC)

Este protocolo describe una estrategia general para regenerar comerciales microelectrodos de oro vestidas para un analizador de célula libre de etiqueta para ahorro en los alta ejecución costos ofmicrochip-ensayos. El proceso de regeneración incluye la digestión de la tripsina, enjuague con agua y etanol y un paso de giro, que permite el uso repetido de los microchips.

Regeneración de microelectrodos de oro vestidas para un analizador en tiempo real de la célula

Este manuscrito describe el uso de reporteros fluorógenos genéticamente codificados en una aplicación de imágenes de células vivas para el examen de estrés oxidativo inducido por xenobióticos. Este enfoque experimental ofrece inigualable resolución espaciotemporal, la sensibilidad y especificidad evitando muchas de las deficiencias de los métodos convencionales usados para la detección de estrés oxidativo toxicológica.

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

Este procedimiento se estableció para ser utilizado para el desarrollo de cultivos hepáticos 3D avanzados in vitro, que pueden proporcionar una evaluación más fisiológicamente relevante de los peligros genotóxicos asociados con exposiciones nanomateriales a lo largo de un régimen de dosis aguda o repetida a largo plazo.

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Aquí, presentamos el protocolo de fabricación de un dispositivo basado en transistor de efecto de campo modulado por carga orgánica (OCMFET) para la interfaz celular in vitro . El dispositivo, llamado matriz micro OCMFET, es un dispositivo flexible, de bajo costo y sin referencias, que permitirá el monitoreo de las actividades eléctricas y metabólicas de los cultivos celulares electroactivos.

In vitro Análisis celular multiparamétrico mediante matrices de transistores de efecto de campo moduladas por carga micro orgánica

Los estudios magnéticos ex situ pueden proporcionar directamente información masiva y local en un electrodo magnético para revelar su mecanismo de almacenamiento de carga paso a paso. En esta invención, se demuestra que la resonancia de espín electrónico (ESR) y la susceptibilidad magnética monitorean la evaluación de especies paramagnéticas y su concentración en un marco metal-orgánico (MOF) redox-activo.

Caracterización magnetométrica de intermedios en la electroquímica de estado sólido de estructuras metal-orgánicas redox-activas

Este trabajo ha discutido el protocolo para diseñar y desarrollar un dispositivo E-Eye-Enable POCT para detectar Fe, Cr, As y F en muestras ambientales, muestras biológicas y alimentos y bebidas. Se han analizado casi 2000 muestras y los resultados concuerdan con la técnica estándar de oro.

Técnica avanzada de detección E-Eye guiada por TD-DFT para la cuantificación in situ de Fe, Cr, F y As en muestras ambientales, biológicas y alimentarias

Aprende a evaluar la toxicidad de estructuras metal-orgánicas en células epiteliales pulmonares humanas mediante ECIS en tiempo real. Este método de alta eficiencia permite monitorear continuamente sin reactivos externos.

Detección eléctrica de sustratos de células para la evaluación en tiempo real de perfiles toxicológicos de estructuras metal-orgánicas (Video) | JoVE Journal

Detección eléctrica de sustratos de células para la evaluación en tiempo real de perfiles toxicológicos de estructuras metal-orgánicas

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