Name: Evaluación del impacto de un nuevo sistema de procesamiento de celdas de enfriamiento en la instalación de aislamiento de celdas de islotes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Aprenda a evaluar un sistema de procesamiento de células refrigerado para mejorar la viabilidad celular en entornos GMP. Este método utiliza células mononucleares humanas y centrifugación con gradiente de densidad.

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Los autores desean agradecer al Instituto Europeo de Genómica para la Diabetes (ANR-10- LABEX-0046 a FP) y al Instituto Metabólico de Qatar - Hamad Medical Corporation, Qatar. Los autores agradecen también al Centro de Investigación Médica de Hamad Medical Corporation por el apoyo de las tarifas de procesamiento de artículos.

Este protocolo utilizó sangre entera descartada que no era apta para su uso según las directrices institucionales de descarte. No se requiere aprobación del comité de ética ni consentimiento informado.
1. Configuración del procesador de células refrigerado
NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en un entorno de sala limpia, y el personal debe cumplir con los procedimientos de vestimenta para sala limpia.
<ol>
	<li>Compra de equipos
	<ol>
		<li>Compre una tapa de plexiglás de repuesto. Compre el sistema de enfriamiento, refrigerador con controlador de temperatura de flujo de gas refrigerado mecánicamente, secador de aire, regulador de presión y caudal, y la garantía (opcional). Consulte Tabla de Materiales para referencias. 
		NOTA: El costo total es de $16,133 sin incluir gastos de envío ni aduaneros.</li>
		<li>Pedir aire seco médico, un gas médico comprimido que cumpla con la norma estándar (referencia de la farmacopea europea 1238), al proveedor local de gases médicos. Compre 2 cilindros de 6,8 m3 (47 L: 23 cm x 153 cm; diámetro x longitud).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación del equipo (Figura 1 y Figura 2)
	<ol>
		<li>Introduzca el equipo en la sala limpia GMP (desinfecte antes de ingresar a la sala limpia según los procedimientos GMP).</li>
		<li>Para el aire comprimido de grado médico, instale una línea de gas en lugar de colocar el cilindro de gas directamente en la sala limpia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modificación del procesador celular para enfriamiento
	<ol>
		<li>Primero, retire la cubierta de plexiglás. Guarde la cubierta original de plexiglás por si surge un problema con la garantía. Perfore un orificio en la tapa de repuesto del procesador celular con un diámetro que coincida y se ajuste al diámetro externo de la boquilla del dispositivo de enfriamiento para evitar que se agriete la cubierta de la centrífuga (se recomienda 13,3 mm).</li>
		<li>Fije los soportes junto con una pieza circular de espuma. Esto se realiza para evitar roturas y/o rayaduras en la tapa, mantener la boquilla del refrigerador en su lugar sobre el procesador celular, proteger la tapa de doblarse excesivamente debido a la alta presión del aire inyectado, soportar el peso de la boquilla y, finalmente, garantizar la máxima seguridad al operador para tener acceso libre y seguro a todas las funciones necesarias del procesador celular durante el procedimiento experimental.</li>
		<li>Conecte el sistema de enfriamiento al procesador celular fijando la boquilla de enfriamiento al orificio en el plexiglás. Fíjela con soportes y almohadillas de espuma.</li>
		<li>Coloque la unidad de refrigeración hasta 2,44 m (8 pies) de distancia de la boquilla. Ubique el controlador de temperatura en un gabinete separado y colóquelo a no más de 1,83 m (6 pies) de la unidad de refrigeración.</li>
		<li>Establezca el punto de consigna del refrigerador en -40 °C para enfriar la corriente de aire en el refrigerador. La temperatura del aire de salida se indica continuamente en el indicador digital con una resolución de 0,1 °C. Establezca la temperatura de salida digitalmente en 0,1 °C mediante el controlador de temperatura.</li>
		<li>Controle la presión y el caudal del suministro de aire en el módulo regulador de presión y caudal (Figura 2) antes de alimentar al refrigerador. Ajuste estos valores a 55 psi y 4 SCFM, respectivamente, para alcanzar las condiciones óptimas en una corriente de aire enfriada a -30 °C ± 2 °C.</li>
		<li>Verifique que el suministro de gas médico esté regulado a una presión de salida de 5 bar y que dure al menos 90 minutos, ya que esto es necesario para que el aire comprimido alcance -30 °C. 
		&#8203;NOTA: El aire seco médico es un gas médico comprimido, y el aire seco completamente presurizado cumple con la norma estándar.</li>
		<li>Suministre 5 bar desde una boquilla de refrigeración conectada a la tapa del procesador celular a través de un orificio perforado en la cubierta de la centrífuga. Inyecte el aire médico enfriado dentro del recipiente de centrifugación del procesador celular (Figura 2). Seleccione la posición de inyección de aire de manera que el aire enfriado se dirija perpendicularmente al borde de aluminio del rotor de la centrífuga.</li>
		<li>Al preparar el procesador celular, asegúrese de que el rotor esté a temperatura ambiente (18 °C). Establezca el termorregulador automático del sistema de enfriamiento en -30 °C y dirija inyecciones de aire frío al rotor. 
		NOTA: Se probaron diferentes condiciones experimentales para alcanzar un gradiente de temperatura óptimo de +4 °C, lo cual es necesario para superar la termorresistencia del sistema separador de células del procesador celular y el calentamiento del rotor durante la centrifugación. El termorregulador programado mantendrá la temperatura objetivo óptima dentro de la máquina de procesamiento celular durante el procedimiento, especialmente durante la centrifugación, en una temperatura de sala limpia de +18 °C.
		<ol>
			<li>Configure el procesador celular con la primera fase de preenfriamiento para enfriar el procesador (sin el kit del procesador celular) a +3 °C durante 30 a 45 minutos, y la segunda fase de preenfriamiento debe ejecutarse con el kit preenfriado a +4 °C a 134 x g, durante 5 minutos.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Recuento de partículas en suspensión en el aire
<ol>
	<li>Evalúe el cumplimiento del dispositivo de enfriamiento con el entorno de sala limpia GMP según la norma ISO 14644-1 para evaluar el impacto de los dispositivos térmicos durante la fase de operación.</li>
	<li>Utilice el monitoreo del recuento de partículas para proporcionar evidencia de que se alcanza el nivel requerido de limpieza en los puntos críticos de control en reposo y durante la operación.
	<ol>
		<li>El número mínimo de ubicaciones de muestreo depende del área medida. Calcule este número mediante la ecuación 
		<img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/65321/65321eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
		&#8203;donde A es el área de la sala limpia o del espacio controlado con aire limpio en m2, y NL es el número de ubicaciones de muestreo redondeado al número entero superior.</li>
		<li>El volumen de muestreo en aire es el volumen mínimo en cada ubicación. Asegúrese de que el volumen de aire sea suficientemente grande como para contar 20 partículas del tamaño más grande especificado. Calcule el volumen de muestreo en aire mediante la ecuación 
		V= 20/C x 1000 
		donde V es el volumen mínimo de una sola muestra por ubicación, expresado en L, y C es el límite de clase (número de partículas/m3).</li>
		<li>Para cada ubicación, según el área, utilice una o más muestras. Asegúrese de que el volumen mínimo muestreado en cada ubicación sea de 2 L y de que el tiempo mínimo de muestreo sea al menos 1 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Antes del muestreo, purgue el dispositivo contador de partículas con un filtro de purga. Retire el filtro y colóquelo junto con la sonda isocinética para el muestreo.</li>
	<li>Coloque el instrumento contador de partículas en la ubicación de muestreo identificada. Inicie la recolección de muestras desde la pantalla principal del dispositivo contador de partículas.</li>
	<li>Una vez finalizado el muestreo, lleve el dispositivo contador de partículas a la siguiente ubicación. Cuando se hayan completado todas las ubicaciones de muestreo, revise los datos e imprima un informe.</li>
	<li>Cuando la concentración promedio de partículas en todos los puntos de muestreo del área esté por debajo del límite de clase indicado en Tabla 1, considere que la sala cumple con la concentración de partículas permitida.</li>
</ol>
3. Preparación del gradiente y procesamiento de la separación celular
<ol>
	<li>Antes de comenzar el experimento, enfríe previamente los gradientes de densidad ligera y pesada, así como los kits del procesador celular, durante la noche a +4 °C en un refrigerador.</li>
	<li>Enfríe previamente el procesador celular durante 45 minutos en reposo (es decir, encienda el procesador celular antes de su uso). Mantenga la temperatura entre +2 °C y +5 °C. Inserte el kit del procesador celular previamente enfriado a +4 °C.</li>
	<li>Para el mezclador de gradiente estándar con doble camisa refrigerado con etanol (opcional; Figura 3), conecte las dos cámaras de vidrio y colóquelas sobre un agitador magnético. Sujete con una pinza el tubo entre las dos cámaras. Enfríe el mezclador de gradiente con un refrigerador circulante de etanol a 0 °C.</li>
	<li>Primero, prepare la carga de la capa pesada en la parte inferior de la bolsa llenando la cámara con 130 mL de gradiente de densidad pesada (HD; 1,087 g/mL). Cargue a una velocidad de bomba de 150 mL/min.</li>
	<li>Una vez que el gradiente pesado esté en la bolsa, agregue 130 mL de densidad alta (HD) al vaso frontal y 140 mL de gradiente de densidad baja (LD; 1,063 g/mL) al vaso trasero (pinza cerrada).</li>
	<li>Suelte la pinza hemostática/abrazadera entre las dos cámaras y cree un gradiente continuo a una velocidad de bomba de 50 mL/min.</li>
	<li>Prepare con anticipación células mononucleares de capa de buffy humana para su purificación a partir de múltiples capas de buffy anonimizadas agrupadas, obtenidas de residuos de sangre total (se agregaron de 40 mL a 60 mL de sangre total a 10 bolsas de buffy coat), según la disponibilidad del banco de sangre.
	<ol>
		<li>Separación de MNC
		<ol>
			<li>Utilice centrifugación en gradiente de densidad para el aislamiento de células mononucleares humanas de baja densidad. Para ello, siga los pasos descritos a continuación.</li>
			<li>Para la preparación celular, calcule el volumen de sangre (sangre total anticoagulada o buffy coat suspendido). Diluya la sangre con una solución tampón 2 a 4 veces su volumen mediante inversión suave. Cuanto más diluida esté la sangre, mayor será la pureza de las células mononucleares.</li>
			<li>Prepare el tampón mezclando tampón fosfato con un anticoagulante. Calcule el número de tubos necesarios dividiendo el volumen de sangre entre 35 mL y vierta 15 mL de solución de gradiente de densidad 1,073 en cada tubo.</li>
			<li>Deposite gradualmente 35 mL de la suspensión sanguínea diluida sobre el gradiente de densidad, dejándola fluir suavemente sobre la superficie del gradiente mediante una jeringa de 60 mL conectada a una aguja; para volúmenes pequeños, use una pipeta. Evite perturbar la interfase, ya que esto daría lugar a una capa de mononucleares deficiente.</li>
			<li>Centrifugue a 400 x g durante 20 minutos a 20 °C sin frenado (aceleración&#160;0, desaceleración&#160;0). Tras la centrifugación, recoja cuidadosamente la capa de interfase de células mononucleares utilizando una pipeta estéril de transferencia. Transfiera las células a otro tubo cónico nuevo de 50 mL.</li>
			<li>Lave las células dos veces con tampón (PBS con anticoagulante añadido). Para el primer lavado, complete el tubo que contiene las células con tampón hasta 50 mL. Centrifugue a 300 x g durante 10 minutos a 20 °C para formar el sedimento celular (aceleración&#160;9, desaceleración&#160;0). Retire cuidadosamente todo el sobrenadante.</li>
			<li>Realice el segundo lavado para eliminar las plaquetas. Reuspenda el sedimento hasta un volumen final de 50 mL con tampón. Centrifugue a 200-300 x g durante 10 minutos a 20 °C (aceleración&#160;9, desaceleración&#160;0).</li>
			<li>Reconstituya las células hasta un volumen final de 5 mL; estas células deben tener una gravedad específica similar a la de las MNC de baja densidad &#60;1,073. Mida la densidad específica del gradiente con un densitómetro.</li>
			<li>Reuspenda el sedimento hasta un volumen final de 100 mL con 95 mL de medio de gradiente de alta densidad (1,083 g/mL) en una bolsa de transferencia. Utilice este producto para la purificación mediante un separador celular. El volumen final de 100 mL contiene células y medio de gradiente de alta densidad 1,083. 
			NOTA: La capa de buffy puede almacenarse en el refrigerador durante la noche en PBS que contenga 0,5 % de BSA o plasma autólogo. La capa de buffy también puede lavarse.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cargue por la parte superior los gradientes preformados con un máximo de 30 mL de MNC aisladas de la capa de buffy suspendidas en 100 mL de medio concentrado de conservación, utilizando una bomba peristáltica a 25 mL/min. Mantenga el gradiente a +4 °C.</li>
	<li>Mida continuamente la temperatura interna del procesador celular con una sonda térmica previamente calibrada. Utilizando un termopar digital conectado a una sonda térmica estéril, supervise la temperatura de los gradientes y de las células durante el proceso.</li>
</ol>
4. Optimización de diferentes pasos de la carga en gradiente
<ol>
	<li>Inserte el kit del procesador celular preenfriado a +4 °C. Cargue el gradiente denso (130 mL) a +4,5 °C. Al finalizar la carga del gradiente, configure la centrífuga a una velocidad relativamente baja (537 x g) para minimizar el calor generado por el rotor.</li>
	<li>Apague el procesador celular para permitir que el sistema hidráulico regrese a los niveles previos al funcionamiento y libere el aire.</li>
	<li>Reinicie el procesador celular a 537 x g y agregue los gradientes de alta (130 mL) y baja (140 mL) densidad para crear un gradiente de densidad continuo a +4,3 °C y un caudal de 50 mL/min.</li>
	<li>Cargue la capa leucocitaria (30 mL) con 100 mL de medio de almacenamiento frío a +6 °C y un caudal de 25 mL/min. Añada 50 mL (25 mL x 2) de solución de lavado.</li>
	<li>Después de 5 min a +5 °C, recoja el gradiente centrifugado en 12 botellas a un caudal de 100 mL/min.</li>
	<li>Llene los tubos con medio de lavado (M199 + 20% albúmina humana + 10% penicilina estreptomicina). Llene el tubo 1 con 100 mL de medio de lavado y 150 mL de células, y los tubos 2-12 con 225 mL de medio de lavado y 25 mL de células.</li>
</ol>

Advancements in Cooling Cell Processors for Enhanced Viability in Cell Therapy

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+centrifugal+blood+cell+processor+for+washing+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates.</a> Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).</li>
<li>Lake, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+human+islets+utilizing+discontinuous+albumin+gradient+on+IBM+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator.</a> Diabetes. 38, 143-145 (1989).</li>
<li>Ricordi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+and+allotransplantation+in+22+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases.</a> Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).</li>
<li>Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+separation+utilizing+a+closed+automated+purification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet separation utilizing a closed automated purification system.</a> Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).</li>
<li>Bampton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Australian+experience+with+total+pancreatectomy+with+islet+autotransplantation+to+treat+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis.</a> ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).</li>
<li>Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRISM%3A+A+Novel+Human+Islet+Isolation+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique.</a> Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).</li>
<li>Shimoda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+purification+method+using+large+bottles+effectively+achieves+high+islet+yield+from+pig+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas.</a> Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).</li>
<li>Noguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Purification+from+Large+Mammals+and+Humans+Using+a+COBE+2991+Cell+Processor+versus+Large+Plastic+Bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health-Sponsored+Clinical+Islet+Transplantation+Consortium+Phase+3+Trial%3A+Manufacture+of+a+Complex+Cellular+Product+at+Eight+Processing+Facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities.</a> Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).</li>
<li>Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cooling+systems+during+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of cooling systems during islet purification.</a> Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).</li>
<li>Rilo, H. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+islet+number+and+viability+obtained+during+purification+on+Euro-Collins-Ficoll+gradients+processed+on+a+refrigerated+or+nonrefrigerated+COBE+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator.</a> Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+purification+using+bovine+serum+albumin%3A+The+importance+of+density+gradient+temperature+and+osmolality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality.</a> Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreatic+islet+isolation+around+Europe%3A+results+of+a+survey+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study.</a> Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+of+pancreatic+digest+before+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Storage of pancreatic digest before islet purification.</a> Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).</li>
<li>Amrani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effects+of+temperature+on+the+efficacy+of+the+University+of+Wisconsin+solution+when+used+for+cardioplegia+at+moderate+hypothermia.+Comparison+with+the+St.+Thomas+Hospital+solution+at+4+degrees+C+and+20+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C.</a> Circulation. 86, 280-288 (1992).</li>
<li>Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+hypothermic+cardiac+storage+with+University+of+Wisconsin+solution.+An+assessment+with+human+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).</li>
<li>Adewola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+cooling+systems+for+the+COBE+2991+cell+separator+used+in+the+purification+of+human+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans.</a> Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).</li>
<li>Keymeulen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+standardized+beta-cell+grafts+in+a+liver+segment+of+IDDM+patients%3A+graft+and+recipients+characteristics+in+two+cases+of+insulin-independence+under+maintenance+immunosuppression+for+prior+kidney+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft.</a> Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).</li>
<li>de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in type 1 diabetes.</a> BMJ. 342, (2011).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lemarie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+single-platform+method+for+the+enumeration+of+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells.</a> Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Las instalaciones de aislamiento de islotes de todo el mundo han adoptado durante décadas la purificación de islotes humanos en un procesador celular reutilizado. Aunque algunas instalaciones de producción de islotes continúan procesando islotes en un procesador de celdas no refrigerado, la mayoría de los centros utilizan una versión refrigerada del procesador de celdas 10,11,15. Los centros colocan el procesador de celdas en un...

El trasplante de islotes para la diabetes tipo 1 grave puede restaurar la secreción endógena de insulina y se ha convertido en el estándar de atención en varios países1. El aislamiento de islotes es un procedimiento de varios pasos que incluye la digestión enzimática y mecánica tibia del páncreas, seguida de fases enfriadas para la recuperación del tejido digerido y la purificación de los islotes con gradientes de densidad continuos o discontinuos en un procesador celular. El enfriamiento rápido ralentiza la fase de digestión enzimática y protege los islotes de las enzimas digestivas liberadas por las células acinares contaminantes. El procesador celular fue diseñado originalmente para separar los componentes celulares de la sangre a temperatura ambiente2. Fue reutilizado para purificar los islotes pancreáticos humanos de Langerhans en 19893. Durante tres décadas, los islotes humanos han sido purificados para ensayos clínicos y, más recientemente, para el tratamiento estándar, ya sea en un procesador de células con gradientes discontinuos4 o gradientes de densidad continuos1 hecho con un creador de gradientes1 o un mezclador equivalente operado por ordenador5,6,7. Otros grupos han informado de la purificación de islotes de grandes mamíferos y humanos utilizando grandes botellas de plástico cilíndricas8,7,9, lo que mejoró sustancialmente la eficacia de la purificación y la calidad de los islotes.
De hecho, considerando el estándar de oro para purificar islotes humanos para trasplantes clínicos10,11, el procesador de células fabricado estaba sin refrigeración. Como consecuencia directa de la falta de refrigeración, los islotes estuvieron expuestos al aumento de las temperaturas durante la etapa de purificación. Durante la centrifugación, se produce un aumento incontrolado de la temperatura debido a la fricción mecánica del rotor12,13. Los procesadores celulares se adaptaron con un sistema de enfriamiento en centros de aislamiento de islotes que aumentó estadísticamente la secreción de insulina inducida por glucosa y la viabilidad celular, confirmando la ventaja de mantener los islotes pancreáticos a bajas temperaturas durante el procedimiento de purificación14,15.
Cabe señalar que a finales de la década de 1980, se construyeron 10 prototipos refrigerados para reducir el daño de los islotes durante la purificación en gradiente de densidad, pero no recibieron más atención. Los prototipos de procesadores de celdas se basaron en el enfriamiento del huso y la cuba con polietilenglicol refrigerado. En particular, las soluciones de purificación de islotes, incluidas las soluciones de preservación de órganos y los gradientes de densidad de polisacáridos, pueden ser perjudiciales para la viabilidad de los islotes cuando se utilizan a temperatura ambiente o por encima de ella16,17,18. Se evaluó una comparación de diferentes estrategias de enfriamiento del procesador de celdas para la purificación de celdas de islotes versus el procesador de celdas no refrigerado original para combatir el aumento incontrolado de temperatura que ocurre debido a la fricción del rotor. Se han hecho varios intentos para enfriar el procesador celular durante la purificación de los islotes humanos. El procesador de celdas puede alojarse temporal o permanentemente en una cámara frigorífica especialmente diseñada para mantener una temperatura de 0-8 °C19 durante la centrifugación en gradiente que se utiliza actualmente en los centros de aislamiento de islotes de la Universidad de Illinois Chicago19, Universidad de Miami14, University of Oxford facilities15y la Universidad de San Francisco (la unidad de enfriamiento personalizada encierra el procesador de celdas). Otra modificación incluye el enfriamiento del núcleo del eje del procesador de celdas con un sistema de enfriamiento que utiliza enfriamiento de nitrógeno líquido controlado electrónicamente en Ginebra, Suecia y la República Checa15,19. Otra alternativa a mediados de 2000 fue la refrigeración del núcleo del procesador de la célula con una unidad de aire acondicionado12 o mediante la refrigeración líquida del eje en la Universidad de Lille.
Las modificaciones de enfriamiento del procesador de celdas no están fácilmente disponibles y conllevan riesgos (humedad, acumulación de condensación) dentro de los entornos de salas limpias GMP, incluida la pérdida de garantía y la negativa del constructor a reparar la máquina. En consecuencia, algunos centros de islotes, incluyendo Milán, Italia, Oslo, Noruega y Edimburgo, Escocia, no utilizan un sistema de enfriamiento para los procesadores de celdas durante el proceso de purificación de islotes15.
El estudio actual fue diseñado para probar la efectividad de un refrigerador fácilmente disponible recientemente desarrollado junto con un sistema de procesador de celdas mínimamente modificado. Brevemente, el enfriador a base de aire descrito aquí es un intercambiador de calor refrigerado mecánicamente que controla la temperatura de 1 pie cúbico estándar por minuto (SCFM) de gas seco entre -40 °C y -100 °C. Este sistema de refrigeración requiere un suministro de aire médico seco. El aire fluirá a través de la línea y el intercambiador de calor y saldrá a través de la boquilla (7,9 mm). Un calentador ubicado dentro de la boquilla suministra calor para controlar la temperatura de la corriente de aire. Se compró una cubierta de centrífuga de plástico sólido de repuesto y se hicieron modificaciones mínimas. Se perforó un orificio de 13,3 mm de diámetro en la tapa y se suministró aire enfriado desde la boquilla del enfriador al procesador de celdas a través del orificio en la tapa de la centrífuga. El aire medicinal enfriado se inyectó dentro del recipiente de centrifugación del procesador de celdas con control constante de la temperatura de los líquidos o gradientes de densidad.
Evaluamos el rendimiento técnico del procesador de celda refrigerada y el impacto del elemento de refrigeración en el entorno de la sala limpia GMP. El objetivo principal era lograr una temperatura robustamente baja (<10 °C) durante la purificación de los islotes humanos para preservar la viabilidad. Utilizando una separación de la densidad de la capa leucocitaria como proxy del aislamiento de los islotes, determinamos la eficacia de este protocolo de enfriamiento en la viabilidad celular.

<table><tbody><tr><td><Equipo>fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aire contra partículas</td><td>Lasair III&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AirJet XR40&nbsp;</td><td>SP Scientific</td><td>FTS system XR40</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de bioseguridad</td><td>Thermo Scientific</td><td>EQ-1301</td><td></td></tr><tr><td>Enfriador de enfriamiento circulante</td><td>Julabo</td><td>CF30</td><td></td></tr><tr><td>COBE 2991&nbsp;</td><td>Terumo BCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de enfriamiento cónica</td><td>Biorep</td><td>CCT-01</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de degradado de doble camisa&nbsp;</td><td>personalizado en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KJT-Termómetro de termopar Hanna</td><td>Instruments HI93551N</td><td></td><td>Para medir la temperatura de los líquidos</td></tr><tr><td>Agitador magnético&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880014</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica&nbsp;</td><td>Termómetro MasterFlex</td><td>MK-77921-79</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Extech Instruments</td><td>RMS 430</td><td>Para temperatura COBE</td></tr><tr><td>Baño de perlas sin agua</td><td>Cole-Parmer</td><td>10122-00</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Materiales y reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD kit de enumeración de células madre</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>344563</tr><tr><td>Kit de tubos COBE 2911</td><td>Terumo BCT</td><td>90819</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Cónicos 250ml</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>Densidad de gradiente 1.1</td><td>Biochrom&nbsp;</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>Botellas desechables graduadas</td><td>Thermo fisher</td><td>382019-1000</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina humana 20%&nbsp;</td><td>Kedrion Biopharma&nbsp;</td><td>8091600</td><td></td></tr><tr><td>M199 solución de lavado&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>99-784-CM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Masterflex</td><td>Masterflex</td><td>96400-6</td><td></td></tr><tr><td>Medical Dry Air</td><td>Linde Healthcare</td><td>Medi On 22</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-estreptomicina&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Thermoprobe</td><td>Biorep</td><td>TC-02</td><td>Thermosensor</td></tr><tr><td>Trypan azul&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Universidad de Wisconsin Belzer (UW)&nbsp;</td><td>Puente de la Vida&nbsp;</td><td>RM/N 4055</td><td>Medio de conservación</td></tr></tbody></table>

evaluación del impacto de un nuevo sistema de procesamiento de celdas de enfriamiento en la instalación de aislamiento de celdas de islotes

Evaluation of the Impact of a New Cooling Cell Processor System on Islet Cell Isolation Facility

El equipo de terapia celular estándar, incluido el procesador de células de referencia para purificar islotes humanos para el trasplante clínico, rara vez se refrigera, lo que podría exponer las células a temperaturas elevadas durante la etapa de centrifugación. Los sistemas de enfriamiento personalizados tienen un beneficio directo en la viabilidad y función de los islotes humanos. El presente estudio fue diseñado para probar la efectividad de un sistema de procesador de celdas refrigeradas recientemente desarrollado y fácilmente disponible que requiere modificaciones mínimas y para evaluar su impacto en la viabilidad de las celdas humanas y el entorno de la sala limpia GMP. El sistema de enfriamiento, un intercambiador de calor refrigerado mecánicamente a -30 °C, se utilizó para suministrar aire seco de grado médico enfriado al recipiente del procesador de celdas a través de un orificio perforado en la tapa de la centrífuga. Con la disponibilidad limitada de donantes de páncreas en Qatar, la validación del sistema se realizó con purificación continua en gradiente de densidad de la capa de leucemia de médula ósea humana agrupada. La esterilidad, la turbulencia y el recuento de partículas se midieron en ambientes de sala limpia de clase C y clase B. No se desarrollaron turbulencias alrededor del procesador de celda enfriada y no se generaron partículas en el aire de 0,5 μm y 5 μm en exceso según las normas GMP de sala limpia. Al principio y al final de las etapas de recolección, la temperatura aumentó respectivamente a 21,50 °C ± 0,34 °C y 21,93 °C ± 0,20 °C en el procesador de celda no refrigerada y a solo 10,9 °C ± 0,17 °C y 11,16 °C ± 0,35 °C en el procesador de celda refrigerada (p <0,05). El procesador de celda refrigerada mejoró la recuperación (98%) de la fracción de celda mononuclear y la viabilidad (100% ± 2%) del posprocesamiento. El nuevo sistema de refrigeración reduce eficazmente el calor producido por el procesador de celdas sin tener impacto de partículas en el entorno de la sala limpia GMP. El procesador de celda refrigerada descrito aquí es un método económico (16.000 dólares sin incluir impuestos, despacho de aduanas y transporte) y mínimamente invasivo para proporcionar una refrigeración robusta. Actualmente, esta tecnología en la instalación de terapia celular GMP se está aplicando al aislamiento y trasplante de células de islotes humanos para el programa clínico.

Primero se cuantificó el impacto del procesador de células refrigerado en la sala limpia GMP. Los métodos estandarizados utilizaron un contador de partículas para medir la contaminación por partículas en el aire en un entorno de sala limpia clase C y clase B según la clasificación GMP, en puntos críticos cercanos al sistema procesador de células y al sistema de enfriamiento por aire presurizado. Los resultados demostraron que no se generó turbulencia alrededor del equipo. Los datos registrados mostraron que no hubo exces...

El protocolo aquí describe un sistema de procesador de celda de enfriamiento personalizado que es compatible con una sala limpia de buenas prácticas de fabricación (GMP) para mejorar el posprocesamiento de la viabilidad de la celda.

Evaluación del impacto de un nuevo sistema de procesamiento de celdas de enfriamiento en la instalación de aislamiento de celdas de islotes

Standard cell therapy equipment, including the gold standard cell processor to purify human islets for clinical transplantation, is rarely refrigerated, ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (I parte: la digestión y la acumulación de tejido de páncreas), utilizando un método modificado automatizado.

Aislamiento humanos islote pancreático: Parte I: La digestión y la acumulación de tejido pancreático

Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (parte II: el saneamiento y la cultura de los islotes), utilizando un método modificado automatizado.

De páncreas humano de aislamiento Islet: Parte II: Purificación y Cultura de los islotes

Un dispositivo de microfluidos perifusion islote fue desarrollado para la evaluación de la dinámica de la secreción de insulina de los islotes y varias imágenes simultáneas de fluorescencia de la entrada de calcio mitocondrial y los posibles cambios.

A multi-paramétricos Islet Sistema Perifusion dentro de un dispositivo de microfluidos Perifusion

El trasplante de islotes aislados se ha propuesto ser un tratamiento potencial para la diabetes tipo 1. Aquí se describe un método para aislar los islotes de páncreas de ratón y trasplantarlas en el espacio subcapsular del riñón.

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La oferta de la diabetes tipo 2 isletas para la investigación es insuficiente. Aquí compartimos nuestro protocolo para el aislamiento de islotes de pacientes sometidos a pancreatectomía parcial. Este enfoque representa un lugar único para la obtención de islotes de diabetes tipo 2 y clínicamente emparejado sujetos no diabéticos en un número suficiente de estudios básicos y clínicos.

El aislamiento de islotes humanos de pacientes parcialmente Pancreatectomized

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Este protocolo proporciona una guía paso a paso para la adquisición de un páncreas porcino para el aislamiento y la purificación de los islotes.

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Aislamiento y purificación de islotes pancreáticos a partir de ratas Lewis mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad

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Evaluación del impacto de un nuevo sistema de procesamiento de celdas de enfriamiento en la instalación de aislamiento de celdas de islotes (Video) | JoVE Journal

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