Name: Protocolo de ensayo de cizallamiento para la determinación de las propiedades del material unicelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprende a cuantificar propiedades mecánicas de células cancerosas y no cancerosas mediante dispositivos microfluídicos. Este método permite identificar biomarcadores mecánicos para el diagnóstico temprano del cáncer.

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Los autores agradecen a los investigadores anteriores del grupo Soboyejo en el Instituto Politécnico de Worcester que fueron pioneros en esta técnica: los doctores Yifang Cao, Jingjie Hu y Vanessa Uzonwanne. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer (NIH/NCI K22 CA258410 a M.D.). Las figuras fueron creadas con BioRender.com.

1. Preparación para el ensayo de cizallamiento unicelular
<ol><li>Cultivo celular<ol><li>Sembrar aproximadamente 50.000 células individuales suspendidas en una placa de Petri de 35 mm x 10 mm que contenga 2 ml de medios de cultivo. NOTA: Vórtice las células suspendidas antes de la siembra para separar los agregados celulares.</li>
		<li>Incubar las células a 37 °C y dejar entre 10 y 48 h para la unión celular y la formación completa de proteínas citoesqueléticas. NOTA: Considere la duración de la unión celular, así como las tasas de proliferación y crecimiento, para garantizar un crecimiento y unión celular adecuados evitando la agregación celular. Estos parámetros varían según el tipo de célula.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Experimento de ensayo de cizallamiento
<ol><li>Preparación de medios de flujo viscoso de ensayo de cizallamiento<ol><li>Para asegurar un medio de flujo ligeramente viscoso (0.015-0.02 Pa·s), medir y agregar 0.05% en peso de metilcelulosa no tóxica y no alergénica (4 Pa·s) a los medios de cultivo.</li>
		<li>Para asegurar una mezcla homogénea, precaliente el medio de cultivo base durante ~10-20 min a una temperatura de ~60-70 °C con un agitador magnético/placa caliente. Mientras agita continuamente el medio, agregue suavemente la metilcelulosa de modo que se disperse rápidamente, para evitar la coagulación de las partículas de metilcelulosa. Permita que este proceso continúe durante ~ 15-24 h para garantizar una solución clara de medios + celulosa. NOTA: Evite el calentamiento excesivo de la solución.</li>
		<li>Para medir la viscosidad del medio de flujo, pruebe ~ 0.5-1 ml del medio de flujo representativo con un reómetro. A partir de la lectura, determine la viscosidad del fluido y utilice este valor para representar la viscosidad del medio fluido de corte (μ) para calcular la tensión de cizallamiento utilizando la ecuación (2).</li>
	</ol></li>
	<li>Configuración del aparato de corte<ol><li>Configure el sistema de ensayo de cizallamiento de jeringas duales (60 ml o 100 ml) conectadas a una bomba de jeringa programable para la infusión y extracción de los medios de cultivo viscosos (Figura 1).</li>
		<li>Conecte ambas jeringas a la cámara de flujo a través de tubos de 1/16 de pulgada y conectores de tubos.</li>
		<li>Sujete una junta de goma para proporcionar un flujo controlado y uniforme en celdas individuales a lo largo de la trayectoria de flujo (Figura 1). La junta de goma viene en diferentes tamaños dependiendo del perfil de flujo a alcanzar (laminar o turbulento) y el área de observación deseada (por ejemplo, longitud de 22.5 mm, ancho de 2.5 mm y altura de 0.254 mm) (Figura 1).</li>
		<li>Programe la bomba para infundir y extraer un cierto volumen de líquido (por ejemplo, 60 ml) a una velocidad designada (por ejemplo, 1 ml/min) y seleccione las jeringas correspondientes (por ejemplo, 60 ml). NOTA: Tenga en cuenta los ajustes preestablecidos máximos de volumen de infusión y extracción para evitar atascos o mal funcionamiento. Utilice la ecuación (2) para el cálculo de la velocidad de cizallamiento de la bomba requerida (suponiendo que se conozcan la tensión y la viscosidad requeridas).</li>
	</ol></li>
	<li>Configuración previa al cizallamiento<ol><li>Llene la jeringa con el medio de flujo viscoso preparado.</li>
		<li>Conecte la jeringa, llena con 60 o 100 ml (o según sea necesario) de medios de flujo viscoso, y una jeringa vacía de 60 ml a sus respectivas ubicaciones en la bomba de jeringa programable. A través de tubos y conectores de tubos, conecte ambas jeringas a la cámara de flujo.</li>
		<li>Para garantizar una fácil identificación de celdas individuales y una conexión sujeta entre la cámara de flujo y la placa de Petri, conecte la junta de goma a la cámara de flujo.</li>
		<li>Aspirar los medios de cultivo celular de la placa de Petri que contiene las células de interés.</li>
		<li>Lave las células muertas y las células sueltas con solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
		<li>Aspirar el PBS.</li>
		<li>Inserte y fije la cámara de flujo y la junta de goma (~34 mm x 9 mm) en la placa de Petri (35 mm x 10 mm) que contiene las celdas adheridas.</li>
		<li>Coloque la cámara de flujo microfluídico + células en un plato cultivado en un microscopio invertido, con un objetivo de microscopio lo suficientemente alto como para obtener imágenes de alta calidad con altos valores de píxeles (generalmente entre 40x y 63x aumento) y un monitor de visualización.</li>
		<li>Seleccione la opción de imagen en vivo (lapso de tiempo en algún software) del software del microscopio en el monitor de visualización. Asegúrese de que el software del microscopio en la PC tenga una funcionalidad t (lapso de tiempo) o pueda tomar grabaciones de video.</li>
		<li>Enfocar el objetivo del microscopio, asegurando un contraste adecuado y bordes de celda distintos. Esto es necesario para el análisis de imágenes después del cizallamiento. Mueva la etapa del microscopio para asegurarse de que las células sean claramente visibles en el monitor de la pantalla y sean imágenes en vivo.</li>
		<li>Seleccione una celda o varias celdas distintas dentro de la trayectoria de imagen/flujo de la cámara de flujo instalada + placa de Petri (el área/trayectoria creada por la instalación de la junta en la cámara de flujo).</li>
	</ol></li>
	<li>Cizalladura e imágenes<ol><li>Para mantener un flujo uniforme continuo, seleccione velocidades de infusión y extracción similares y asegure el flujo laminar del líquido, generalmente entre 1 ml / min y 5 ml / min. Para regímenes de flujo laminar bajos, asegúrese de que el número de Reynold de Re &lt; 100.</li>
		<li>Haga clic en Ejecutar en la bomba de cizalla para inyectar y extraer el fluido de cizallamiento (medio viscoso preparado) a una velocidad continua. Asegúrese de que no haya burbujas durante la infusión de líquido, ya que esto podría introducir estrés externo no contabilizado en las células.</li>
		<li>Comience a grabar un video haciendo clic en grabar en el software del microscopio antes de que el líquido de cizallamiento infundido haga contacto con la(s) célula(s) de interés bajo el microscopio.</li>
		<li>Continúe grabando durante 7 minutos, o durante la duración deseada de la exposición al estrés, o hasta que la(s) cel(s) de interés corte el fondo del plato. Haga clic en detener grabación en el software del microscopio cuando la ejecución se complete como se desea.</li>
		<li>Guarde la grabación y extráigala como .tiff archivos. Preferiblemente, extraiga imágenes a 1 fotograma por segundo para facilitar el análisis.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tratamiento de datos
<ol><li>Procedimiento de correlación de imágenes digitales (análisis de imágenes)<ol><li>Si la grabación del microscopio se extrajo como un archivo de vídeo, conviértalo en fotogramas de imagen (preferiblemente .tiff formato de archivo).</li>
		<li>Importe las imágenes derivadas de la grabación del ensayo de cizallamiento al software Davis 10.1.2 (software DIC) para rastrear el movimiento de las estructuras con patrones naturales de la celda ubicando cada bloque de píxel (subconjunto) de la imagen de referencia en las nuevas imágenes respectivas (imágenes deformadas) (Figura 2).</li>
		<li>Para una correlación optimizada, utilice un tamaño de subconjunto de 31 x 31 píxeles, un tamaño de paso (distancia de deformación de cada subconjunto) de 20 píxeles y la suma de la opción de pista diferencial , que rastrea la deformación de una nueva imagen con respecto a la última imagen. El resultado de esta correlación es una gráfica de tiempo de deformación (Figura 3) que se puede exportar como un archivo .csv para su posterior análisis en MATLAB.</li>
		<li>Planifique la región de interés para una sola celda elegida. Seleccione puntos arbitrarios dentro de la celda asignada para realizar un seguimiento de la deformación. Para una forma irregular, como la celda, use una máscara de polígono para trazar la geometría de la celda.</li>
		<li>Después del mapeo, elija puntos específicos en la célula (núcleo o citoplasma) a analizar haciendo clic en agregar galgas extensométricas y dibujando galgas extensométricas individuales en puntos dentro del límite celular definido.</li>
		<li>Haga clic en Ejecutar para comenzar el procesamiento de la deformación y obtener datos de deformación frente al tiempo.</li>
		<li>Haga doble clic (o haga clic con el botón derecho) en el gráfico de tiempo de deformación generado y seleccione exportar datos como una hoja de cálculo.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Caracterización de propiedades mecánicas
<ol><li>Caracterización de propiedades viscoelásticas<ol><li>Guarde el archivo .csv que contiene los datos de tiempo de deformación del software DIC en una carpeta separada para facilitar la lectura de MATLAB.</li>
		<li>Ejecute MATLAB y haga clic en la pestaña del editor para abrir una página de editor para escribir un código que lea la hoja de cálculo, celda por celda.</li>
		<li>Cambie la ruta de MATLAB (la ruta de la carpeta que accede al archivo de interés) para acceder a la carpeta que contiene los datos a analizar, por ejemplo, Usuarios / Nombre de usuario / Escritorio / datos.</li>
		<li>En la página del editor de MATLAB, acceda a los datos de la hoja de cálculo mediante el código personalizado. Por ejemplo: a1= xlsread('data','run1','A4:A183'), donde a1 representa el identificador, xlsread es la función de MATLAB que lee el archivo .csv (en este caso, como una hoja de cálculo), data es el nombre del archivo, run1 es el nombre de la hoja y A4:A183 es el rango de datos de interés en la celda A de los datos de la hoja de cálculo que se van a analizar. Para un ajuste completo, analice x e y (tiempo y tensión, respectivamente). Por ejemplo: a1=xlsread('data','run1','A4:A183'); b1=xlsread('data','run1','B4:B183'); a1 = x (tiempo) y b1 = y (tensión).</li>
		<li>En MATLAB, haga clic en Aplicaciones | Ajustador de curvas | Ecuación personalizada. Borre la ecuación personalizada representativa e introduzca la ecuación del modelo viscoelástico [ecuación (1)], donde ε representa la variable x y t representa la variable y. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65333/65333eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) Aquí, ε representa la deformación, σ representa el esfuerzo cortante, η1 representa la viscosidad, E representa la elasticidad, t representa el tiempo y τ representa el tiempo de relajación, que caracteriza el tiempo máximo requerido para que la celda vuelva a su forma original después de la deformación primaria. Se expresa como τ = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65333/65333eq02.jpg" style="margin: auto;">, donde η2 es el término de viscosidad secundario para el segundo guión (Figura 4).</li>
		<li>Reasignar nuevas variables a los parámetros viscoelásticos dentro de la interfaz de ecuaciones personalizadas. (ε, η1, E, σ, t y τ = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65333/65333eq02.jpg" style="margin: auto;">) representará (x, a, b, K, y y c), respectivamente. Aquí, x e y son las variables independientes y dependientes, respectivamente. El esfuerzo cortante (σ) se puede determinar utilizando la ecuación (2): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/65333/65333eq03.jpg" style="margin: auto;">(2) Aquí, μ representa la viscosidad del medio fluido de corte, Q es el caudal de la bomba, y w y h son el ancho y la altura del canal de flujo que se muestra en la Figura 1C, respectivamente.</li>
		<li>Haga clic en Seleccionar datos para seleccionar el tiempo (a1) y la deformación (b1) para cada conjunto de datos. </li>
		<li>Asegúrese de que la opción de casilla Ajuste automático esté marcada. Esto ejecuta el ajuste automáticamente cuando se seleccionan datos (x e y).</li>
		<li>Seleccione los métodos de ajuste para ajustar las condiciones de contorno. Haga clic en Opciones avanzadas en la categoría Métodos y seleccione Mínimos cuadrados no lineales. En Robusto, seleccione Desactivado y, en Algoritmo, seleccione Región de confianza. Deje todos los demás parámetros como están.</li>
		<li>Las nuevas variables post-ajuste (a, b y c) representan las propiedades viscoelásticas, viscosidad, elasticidad y tiempo de relajación (η1, E, EQUAT), de la célula, respectivamente (Figura 5).</li>
		<li>Busque un valor R-cuadrado alto del ajuste (R2 &gt; 80%) para asegurarse de que la salida de datos pueda considerarse un ajuste real del modelo viscoelástico (Figura 3)</li>
	</ol></li>
</ol>

Mejora del diagnóstico dirigido del cáncer mediante la cuantificación de la mecánica de una sola célula

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que revelar.

El método de ensayo de cizallamiento, que incluye la creación de un entorno pseudomecanobiológico para simular la interacción de las células con el microambiente mecánico circundante y sus respuestas a las tensiones mecánicas, ha producido un catálogo de propiedades mecánicas celulares, cuyos patrones muestran atipia física conservada entre líneas celulares cancerosas 3,4,5,7,8 <sup ...

El estudio de las diferencias biofísicas entre las células cancerosas y no cancerosas permite nuevas oportunidades diagnósticas y terapéuticas1. Comprender cómo las diferencias en biomecánica / mecanobiología contribuyen a la progresión tumoral y la resistencia al tratamiento revelará nuevas vías para la terapia dirigida y el diagnóstico temprano2.
Si bien se sabe que las propiedades mecánicas de las células cancerosas difieren de las células normales (por ejemplo, la viscoelasticidad de la membrana plasmática y la envoltura nuclear)3,4,5, faltan métodos robustos y reproducibles para medir estas propiedades en células vivas6. El método de ensayo de cizallamiento se utiliza para cuantificar las propiedades mecánicas de las células sometiendo células individuales a tensión de cizallamiento del fluido y analizando sus respuestas individuales y resistencia a la tensión aplicada 3,4,5,7,8,9. Aunque se han utilizado varios métodos y técnicas para caracterizar las propiedades mecánicas de células individuales, éstas tienden a afectar las propiedades del material celular i) perforando/dañando la membrana celular debido a la profundidad de indentación, geometrías complejas de la punta o rigidez del sustrato asociado con la microscopía de fuerza atómica (AFM)10,11, ii) induciendo fotodaño celular durante el atrapamiento óptico 12, 13, o iii) inducir estados complejos de estrés asociados a la aspiración de micropipetas14,15. Estos efectos externos están asociados con incertidumbres significativas en la precisión de las mediciones de viscoelasticidad celular 6,16,17.
Para abordar estas limitaciones, el método de ensayo de cizallamiento descrito aquí proporciona un enfoque altamente controlable y simple para simular el flujo fisiológico en el cuerpo sin afectar las propiedades del material celular en el proceso. Las tensiones de cizallamiento de fluidos en este ensayo representan tensiones mecánicas experimentadas por las células en el cuerpo, ya sea por fluidos dentro del intersticio tumoral o en la sangre durante la circulación18,19,20. Además, estas tensiones fluidas promueven diversos comportamientos malignos en las células cancerosas, incluyendo progresión, migración, metástasis y muerte celular 19,21,22,23 que varían entre células tumorigénicas y no tumorígenas. Además, las características mecánicas alteradas de las células cancerosas (es decir, a menudo son "más blandas" que las células normales que se encuentran dentro del mismo órgano) les permiten persistir en microambientes tumorales hostiles, invadir los tejidos normales circundantes y hacer metástasis a sitios distantes24,25,26. Al crear un entorno pseudobiológico donde las células experimentan niveles fisiológicos de estrés de cizallamiento del fluido, se logra un proceso que es fisiológicamente relevante y no destructivo para la célula. Las respuestas celulares a estas tensiones de cizallamiento de fluido aplicadas nos permiten caracterizar las propiedades mecánicas celulares.
Este documento proporciona un protocolo de ensayo de cizallamiento para el estudio exhaustivo de las propiedades mecánicas y el comportamiento de las células cancerosas y no cancerosas bajo estrés de cizallamiento aplicado. Las células responden a las fuerzas externas de manera elástica y viscosa y, por lo tanto, pueden idealizarse como un material viscoelástico3. Esta técnica se clasifica en: (i) cultivo celular de células individuales dispersas, (ii) aplicación controlada de esfuerzo cortante de fluido, (iii) imágenes in situ y observación del comportamiento celular (incluida la resistencia al estrés y la deformación), (iv) análisis de deformación de células para determinar el grado de deformación, y (v) caracterización de las propiedades viscoelásticas de células individuales. Al interrogar estas propiedades y comportamientos mecánicos, la mecanobiología celular compleja se puede destilar a datos cuantificables. Un protocolo que describe este método permite la catalogación y comparación entre varios tipos de células malignas y no malignas. La cuantificación de estas diferencias tiene el potencial de establecer biomarcadores diagnósticos y terapéuticos.

<table><tbody><tr><td><CULTIVO > CÉLULAS FUERTES</Tripsina ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>,25%, EDTA 2,21 mM, bicarbonato de sodio 1x[-] Corning</td><td></td><td>25-053-CI</td><td>Para el desprendimiento celular del sustrato en cultivos celulares</td></tr><tr><td>15 mL Tubos de centrífuga</td><td>Falcon by Corning</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos de</td> <td>centrífugaFalcon by Corning</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para cultivo de células estériles</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x</td><td>Corning</td><td>10-013-cv</td><td>O cualquier otro medio para el cultivo de células. DMEM se utilizó para el cultivo de células U87</td></tr><tr><td>Guantes</td><td>: cualquiera</td><td></td><td>Para el cultivo de células estériles</td></tr><tr><td>: Heracell Vios 160i CO2 Incubadora</td><td>Thermo Scientific</td><td>51033770</td><td>Para la incubación durante el cultivo celular</td></tr><tr><td>Capucha</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para el cultivo de células estériles</td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para el cultivo de células estériles</td></tr><tr><td>Puntas de micropipeta</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para cultivo celular estéril</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica/any</td><td></td><td>Para cultivo celular estéril</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato sin calcio y magnesio PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para cultivo celular estéril</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para cultivo celular estéril</td></tr><tr><td>Precision GP 10 incubadora de líquidos</td><td>Matraz Thermo Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>T25 Corning</td><td></td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td><ENSAYO > CORTE FUERTE</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL Vaso de precipitados</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para crear DMEM + metilcelulosa medios de cizallamiento viscosos</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de flujo + junta de goma</td><td>Glycotech</td><td>31-001 Kit de cámara de</td><td>flujo circular (para placas de cultivo de tejidos de 35 mm)</td></tr><tr><td>Reómetro híbrido</td><td>HR-2 Discovery Reómetro</td><td></td> híbrido <td>Para la determinación de la viscosidad del fluido de cizallamiento</td></tr><tr><td>Barra de agitación magnética</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para crear medios de cizallamiento viscosos DMEM + metilcelulosa</td></tr><tr><td>Placa de agitación magnética</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para crear DMEM + metilcelulosa medios de cizallamiento viscosos</td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para aumentar la viscosidad de DMEM en medios de flujo Bomba de</td></tr><tr><td>jeringa</td><td>KD Scientific Geminin 88 plus</td><td>788088</td><td>Para programar la infusión y extracción de fluidos</td></tr><tr><td>Jeringas, tubos y conectores</td><td></td><td></td><td>Para la configuración del aparato de cizallamiento</td></tr><tr><td><fuerte>SOFTWARE</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ABAQUS</td><td>Software de</td> correlación de imágenes digitales Simulia <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>LaVision, Alemania</td><td>DAVIS 10.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagen</td><td>Leica/cualquier software</td><td></td><td></td>de microscopio</tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB MATLAB_R2020B</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo de ensayo de cizallamiento para la determinación de las propiedades del material unicelular

Shear Assay Protocol for the Determination of Single-Cell Material Properties

La biomecánica irregular es un sello distintivo de la biología del cáncer sujeto a un extenso estudio. Las propiedades mecánicas de una célula son similares a las de un material. La resistencia de una célula al estrés y la tensión, su tiempo de relajación y su elasticidad son propiedades que se pueden derivar y comparar con otros tipos de células. La cuantificación de las propiedades mecánicas de las células cancerosas (malignas) frente a las normales (no malignas) permite a los investigadores descubrir aún más los fundamentos biofísicos de esta enfermedad. Si bien se sabe que las propiedades mecánicas de las células cancerosas difieren consistentemente de las propiedades mecánicas de las células normales, falta un procedimiento experimental estándar para deducir estas propiedades de las células en cultivo. 
Este documento describe un procedimiento para cuantificar las propiedades mecánicas de células individuales in vitro utilizando un ensayo de cizallamiento de fluidos. El principio detrás de este ensayo consiste en aplicar tensión de cizallamiento de fluido en una sola célula y monitorear ópticamente la deformación celular resultante a lo largo del tiempo. Las propiedades mecánicas celulares se caracterizan posteriormente mediante el análisis de correlación digital de imágenes (DIC) y el ajuste de un modelo viscoelástico apropiado a los datos experimentales generados a partir del análisis DIC. En general, el protocolo descrito aquí tiene como objetivo proporcionar un método más eficaz y específico para el diagnóstico de cánceres difíciles de tratar.

El protocolo de ensayo de cizallamiento junto con el análisis de deformación utilizando DIC y un modelo viscoelástico tiene éxito en la cuantificación de las propiedades mecánicas de una sola célula in vitro. Este método se ha probado en líneas celulares humanas y murinas, incluidas células mamarias humanas normales (MCF-10A)3,4,9, células de cáncer de mama triple negativo menos metastásico (MDA-MB-468)3, células de cáncer de mama triple negativo (MDA-MB-231)3, células de osteosarcoma hum...

Este protocolo describe la cuantificación de las propiedades mecánicas de líneas celulares cancerosas y no cancerosas in vitro. Las diferencias conservadas en la mecánica de las células cancerosas y normales pueden actuar como un biomarcador que puede tener implicaciones en el pronóstico y el diagnóstico.

Protocolo de ensayo de cizallamiento para la determinación de las propiedades del material unicelular

Irregular biomechanics are a hallmark of cancer biology subject to extensive study. The mechanical properties of a cell are similar to those of a ...

Las características físicas del cáncer son temas relativamente nuevos y emocionantes en la investigación del cáncer. Nuestra investigación busca caracterizar específicamente las propiedades mecánicas tanto de los cánceres como de las células no cancerosas para comprender mejor los mecanismos físicos por los cuales las células cancerosas sobreviven a las fuerzas de cizallamiento en el cuerpo e invaden el sistema inmunológico. El desarrollo reciente en mi período de investigación es el uso de dispositivos microfluídicos y técnicas de alto rendimiento para estudiar a mayor escala, la deformabilidad celular y las propiedades viscoelásticas de las células, y también en la identificación de nuevos biomarcadores como la regulación de proteínas citoesqueléticas y proteínas de matriz extracelular para el diagnóstico temprano del cáncer.Los desafíos experimentales actuales involucrados en este campo son la complejidad del microambiente tumoral, el rendimiento de escala, la traducción clínica, la estandarización y reproducibilidad, y la integración de datos multimodales. Entonces, algunos de los hallazgos significativos que he establecido en este campo de mi investigación anterior y de mi investigación actual es que las células cancerosas se pueden distinguir de las células normales en función de sus respuestas a los factores estresantes mecánicos. Y la medida en que resisten los estresores mecánicos depende de la integridad estructural, que está dictada en una medida razonable por la presencia de proteínas citoesqueléticas como la actina filamentosa y otras proteínas estructurales dentro de la célula.Nuestro protocolo ofrece un enfoque simple, repetible y no destructivo para caracterizar mecánicamente las células cultivadas. Esto contrasta con otras técnicas como AFM y pinzas ópticas, que requieren un cierto nivel de experiencia técnica para realizar un experimento en un rendimiento relativamente bajo. Dentro del uso de la técnica de ácido de cizallamiento, avanzará en gran medida la caracterización mecánica de una sola célula, y también ayudará en muchas áreas transversales diferentes, como el diagnóstico de enfermedades raras, el diagnóstico y la atención personalizados, y el monitoreo de las interacciones farmacológicas unicelulares.

shear-assay-protocol-for-determination-single-cell-material

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Una célula de cizallamiento es desarrollado para mediciones de dispersión de neutrones de ángulo pequeño en el plano gradiente de velocidad-velocidad de cizallamiento y se usa para caracterizar fluidos complejos. Mediciones espacialmente resueltas en la dirección del gradiente de velocidad son posibles para el estudio de los materiales de cizalla-anillado. Las aplicaciones incluyen investigaciones de dispersiones coloidales, soluciones de polímeros, y estructuras auto-ensambladas.

Medición material Microestructura Bajo Flujo de 1-2 Plano de Flujo de ángulo pequeño dispersión de neutrones

Este ensayo de adhesión de flujo proporciona un modelo de impacto simple de la máxima de las interacciones célula-célula epitelial T. Una bomba de jeringa se utiliza para generar la tensión de cizallamiento, y la microscopía confocal captura imágenes para la cuantificación. El objetivo de estos estudios es cuantificar eficazmente la adhesión de células T usando condiciones de flujo.

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Aquí, se presenta un flujo de trabajo para el análisis de expresión cultura y genes de células endoteliales bajo tensión de esquileo líquido. Incluido es un arreglo físico para simultáneamente y monitoreo de múltiples cámaras de flujo en un entorno controlado y el uso de un RNA de referencia exógena para PCR cuantitativa.

Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo

Aquí, describimos el uso de un biorreactor de microfluidos un mayor rendimiento juntado con un microscopio de fluorescencia para el análisis de los efectos de la tensión de esquileo de aeruginosa de los Pseudomonas biofilms expresando proteínas fluorescentes verdes, como instrumento establecido, la determinación de la cobertura de biofilm, tasa de crecimiento y características morfológicas.

Análisis de la célula de tensión de esquileo en vivo en Pseudomonas aeruginosa mediante un sistema de microfluidos superior rendimiento automatizado

Este protocolo describe la generación de esferoides derivados del paciente, y el análisis posterior, incluyendo la cuantificación de la proliferación, las pruebas de citotoxicidad, la citometría de flujo, la tinción de inmunofluorescencia y la toma de imágenes confocales, con el fin de evaluar la droga potencial de los candidatos como terapias antineoplásicas. Este protocolo apoya la medicina de precisión con la identificación de medicamentos específicos para cada paciente y etapa de la...

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

Describimos un método en solución para aplicar una cizalla uniforme a los receptores de superficie plaquetaria usando viscometry de placa cónica. Este método también se puede utilizar más ampliamente para aplicar cizallamiento a otros tipos de células y fragmentos de células y no necesita apuntar a un par de ligando-receptor específico.

Un ensayo de cizalla uniforme para los receptores humanos de plaquetas y de superficie celular a través de Viscometry de placa cónica

Aquí se presenta un método para fenotipar mecánicamente células individuales utilizando una plataforma microfluídica basada en electrónica llamada detección mecano-nodo-poro (mecano-NPS). Esta plataforma mantiene un rendimiento moderado de 1-10 células/s mientras mide las propiedades biofísicas elásticas y viscosas de las células.

Detección de poro de nodo mecánico: una plataforma rápida y sin etiquetas para mediciones viscoelásticas unicelulares multiparamétricas

Aquí se presenta una técnica basada en citometría de flujo que permite medir simultáneamente el número de divisiones celulares, el fenotipo celular superficial y el parentesco celular. Esas propiedades se pueden probar estadísticamente utilizando un marco basado en permutaciones.

Evaluación simultánea del parentesco, el número de división y el fenotipo mediante citometría de flujo para células madre y progenitoras hematopoyéticas

Describimos un protocolo para aislar y cultivar células endoteliales de venas safenas humanas (hSVECs). También proporcionamos métodos detallados para producir esfuerzo cortante y estiramiento para estudiar el estrés mecánico en hSVEC.

Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento

Este método mide la propensión de una célula a romper dúplex de ADN inmovilizado que presentan ligandos para informar sobre las fuerzas de tracción celular relativas. Los oligonucleótidos fluorescentes rotos se introducen en la célula y se analizan mediante citometría de flujo, registrando la historia mecánica de la célula. Esto permite la medición de alto rendimiento de la generación de fuerza celular en el contexto del mecanofenotipado celular.

Medición de citometría de flujo de alto rendimiento del mecanotipo celular basada en la ruptura y la entrega de sondas de tensión de ADN en las células

Aquí presentamos un protocolo para obtener suspensiones unicelulares de alta calidad de córneas completas de ratón mediante digestión secuencial con colagénasa A y tripsina. Este método produce células individuales viables con alta integridad de ARN, haciéndolas compatibles con aplicaciones posteriores como la secuenciación de ARN unicelular y el citometradory de flujo.

Un protocolo para la extracción de suspensión de célula única de córneas de ratón

Aprende a cuantificar propiedades mecánicas de células cancerosas y no cancerosas mediante dispositivos microfluídicos. Este método permite identificar biomarcadores mecánicos para el diagnóstico temprano del cáncer.

Protocolo de ensayo de cizallamiento para la determinación de las propiedades del material unicelular

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