Name: Enriquecimiento de la biblioteca de ARNm y bisulfito-ARNm para la secuenciación de nueva generación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda el enriquecimiento de bibliotecas de ARNm y secuenciación bisulfito-ARNm para analizar la metilación 5-metilcitosina en cáncer pancreático. Este método permite identificar ARN diferencialmente metilados implicados en la progresión tumoral.

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Este trabajo contó con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán. [NSTC 111-2314-B-006-003]

1. Purificación de ARN poli(A)
NOTA: Utilice el ARN total tratado con DNasa I y examine la calidad e integridad del ARN total mediante la evaluación de electroforesis en gel capilar o convencional antes de proceder a la purificación del ARN poli(A). Los investigadores deberían ser capaces de identificar las bandas ribosómicas de ARNr 28S y 18S en el campo de alto peso molecular y la banda de ARNr 5,8S en el campo de bajo peso molecular sin ninguna banda de frotis significativa en el electroferograma. Los pasos de purificación siguen esencialmente las instrucciones del fabricante con pequeñas modificaciones indicadas en los pasos específicos. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo.
<ol><li>Preparación<ol><li>Caliente el reactivo, el tampón de lavado, las perlas de oligo(dT) y el tampón de lisis a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de realizar los siguientes procedimientos.</li>
		<li>Para el aislamiento de ARN enriquecido con poli(A), prepare 10-20 μg de una alícuota de ARN total de alta calidad como material de partida transfiriendo una cantidad adecuada de ARN a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml libre de nucleasa. Incubar en el bloque de calor a 70 °C durante 5 min, luego mantener en hielo durante 2 min. NOTA: Las cantidades de ARN total como material de partida deben ajustarse adecuadamente en función de la cantidad deseada de ARNm y de la naturaleza de las células utilizadas. Empíricamente, el ARN enriquecido con poli(A) puede representar una abundancia del 1-5% en el ARN total. Una alícuota de 10 μg de ARN total de alta calidad debe proporcionar ARN enriquecido con poli(A) de alta calidad en el rango de 100-500 ng para la conversión posterior de bisulfito.</li>
		<li>Mientras tanto, vuelva a suspender completamente las perlas de oligo(dT). Transfiera las cantidades requeridas de suspensión de perlas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, luego colóquelo en el imán durante 3 minutos hasta que las perlas magnéticas formen un gránulo. NOTA: Utilice 50 μL de góligo (dT) para 10 μg de entrada total de ARN. El volumen de las cuentas en este paso podría optimizarse aún más dependiendo de las celdas utilizadas.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas de oligo(dT) con cantidades iguales (el volumen de la suspensión de perlas utilizado en el paso 1.1.3.) de tampón de lisis y colóquelas en el imán durante 3 min antes de retirar el sobrenadante. NOTA: No seque demasiado las cuentas; El usuario debe proceder rápidamente al paso 1.2.1.</li>
	</ol></li>
	<li>La primera ronda de purificación<ol><li>Agregue tampón de lisis al tubo de muestra de ARN (relación de volumen 4:1) y mezcle bien antes de transferirlo a las perlas de oligo(dT). NOTA: Si el volumen de la muestra de ARN es de 20 μL, agregue 80 μL de tampón de lisis.</li>
		<li>Vuelva a suspender la mezcla de tampón de lisis de ARN y las perlas de oligo(dT) por completo pipeteando al menos 10 veces.</li>
		<li>Deje que las muestras se incuben con rotación continua durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Coloque la muestra en el imán durante 5 minutos o hasta que el sobrenadante esté claro; Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Agregue 600 μL de tampón de lavado 1 a las perlas y mezcle con cuidado para volver a suspender las perlas.</li>
		<li>Coloque el tubo en el imán durante 5 minutos o hasta que el sobrenadante esté claro, deseche el sobrenadante y repita el paso de lavado 1.2.5 una vez.</li>
		<li>Lave las perlas añadiendo 300 μL de tampón de lavado 2 y vuelva a suspenderlas suavemente.</li>
		<li>Coloque el tubo en el imán durante 5 minutos o hasta que el sobrenadante esté claro, deseche el sobrenadante y repita el paso de lavado 1.2.7 una vez.</li>
		<li>Añadir 30 μL de Tris-HCl frío 10 mM (tampón de elución) al tubo de muestra e incubar a 70 °C durante 5 min.</li>
		<li>Transfiera rápidamente el tubo al imán y, cuando la suspensión esté limpia después de 20 s o más, transfiera el sobrenadante que contiene ARN enriquecido con poli(A) eluido al nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>La segunda ronda de purificación<ol><li>Agregue 120 μL (4 veces el volumen de la muestra eluida) de tampón de lisis a la muestra de ARN eluido y mezcle bien.</li>
		<li>Lave las perlas utilizadas en la primera ronda de purificación con una cantidad igual de tampón de lisis que en el paso 1.1.4, pipetee 10 veces para volver a suspender las perlas y luego colóquelas en el imán durante 5 minutos antes de desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Transfiera la mezcla de tampón de ARN: lisis a las perlas lavadas y mezcle bien pipeteando al menos 10 veces.</li>
		<li>Incubar la muestra con rotación continua durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Repita los pasos 1.2.4 a 1.2.8 para eliminar la sal y otros subtipos de ARN. NOTA: El volumen del tampón de lavado se puede reducir a 300 μL del tampón de lavado 1 y a 150 μL del tampón de lavado 2.</li>
		<li>Añadir 25 μL (volumen deseado) de 10 mM de Tris-HCl frío (tampón de elución) al tubo de muestra e incubar a 70 °C durante 5 min.</li>
		<li>Transfiera rápidamente el tubo al imán y, cuando la suspensión esté limpia después de 20 s o más, transfiera el sobrenadante que contiene ARN enriquecido con poli(A) eluido a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
		<li>Transfiera 2,2 μL a tubos de 8 tiras para evaluar la calidad de la cantidad y calidad del ARN mediante ensayos de alta sensibilidad de ARN.</li>
		<li>Almacenar la muestra a -20 °C durante períodos cortos y a -70 °C durante un período más largo. NOTA: Este puede ser un punto de pausa en el protocolo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Conversión de bisulfito
NOTA: Todos los pasos de centrifugación se realizaron a temperatura ambiente. Los procedimientos se realizan esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero con un paso adicional 2.2 para añadir la(s) secuencia(s) de ARNm de control de espiga antes del paso 2.3 de la reacción del bisulfito.
<ol><li>Transfiera 19 μL de muestra de ARN enriquecido con poli(A) purificado a un tubo de 8 tiras de 0,2 mL.</li>
	<li>Agregue 1,0 μL de control de espiga, que esté libre de cualquier modificación en la proporción de cantidad predeterminada de 1:10.000 (es decir, 0,1 ng de ARNm de luciferasa: 1 μg de ARN enriquecido con poli(A) purificado) en la muestra de ARN del paso 2.1. NOTA: La secuencia de control de la espiga puede ser ARN luciferasa de luciérnaga, luciferasa Renilla o secuencia de ARN transcrita in vitro sin citosinas metiladas.</li>
	<li>Agregue 130 μL de regente de conversión al tubo e invierta suavemente varias veces para una mezcla completa.</li>
	<li>Coloque el tubo en la máquina de PCR y realice tres ciclos de calentamiento a 70 °C durante 10 minutos, seguidos de la incubación a 64 °C durante 45 minutos cada uno y luego un paso final para enfriar a 4 °C.</li>
	<li>Coloque la columna en el tubo de recolección y transfiera 250 μL de tampón de unión de ARN a la columna.</li>
	<li>Transfiera la muestra del paso 2.4 a la columna del paso 2.5 y pipetee bien.</li>
	<li>Agregue 400 μL de etanol al 95-100% a la columna, cierre rápidamente la tapa e invierta varias veces.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C y desechar el flujo.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón de lavado de ARN a la columna.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C y desechar el flujo.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón de desulfonación e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C y desechar el flujo.</li>
	<li>Añadir 400 μL de tampón de lavado de ARN y centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C y desechar el flujo. Repita este paso una vez.</li>
	<li>Centrifugar de nuevo a 10.000 × g durante 2 min a 25 °C para eliminar completamente el tampón de lavado residual. NOTA: El otro paso de centrifugación 2.14 durante 2 minutos antes de la elución es eliminar completamente el tampón de lavado. El paso de lavado se realiza dos veces para lavar el componente con alto contenido de sal del reactivo de bisulfito y el tampón de desulfonación en la columna.</li>
	<li>Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
	<li>Añadir 20-30 μL de H2O libre de nucleasa a la columna y dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 min.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 × g durante 30 s a 25 °C.</li>
	<li>Transferir 2,2 μL a tubos de 8 tiras para la evaluación de la cantidad y calidad del ARN.</li>
	<li>Almacenar la muestra de ARN tratada con bisulfito a -20 °C durante períodos cortos y a -70 °C durante un período más largo. NOTA: Este puede ser un punto de pausa en el protocolo.</li>
</ol>3. Preparación de la biblioteca de ARNm tratada con bisulfito
NOTA: Siga la sección 4 del protocolo de instrucciones de preparación de la biblioteca para su uso con ARNm purificado o ARN agotado con ARNr. El primer paso de cebado debe seguir el protocolo de ARN FFPE ya que el tratamiento con bisulfito fragmenta el ARN. Realice cada paso en la campana de flujo laminar y agregue la mezcla de reacción en una rejilla de enfriamiento enfriada con hielo.
<ol><li>Cebado del ARN de entrada<ol><li>Transfiera la cantidad deseada de muestra de ARNm tratada con bisulfito en un total máximo de 5 μL o agregue H2O libre de nucleasa para hacer un total de 5 μL. NOTA: Se recomienda un mínimo de 10 ng de ARNm tratado con bisulfito como entrada para este tipo de preparación de la biblioteca de ARN y para generar la molaridad final del producto de la biblioteca de 4 nM.</li>
		<li>Añadir 1 μL de cebador aleatorio (lila) a la muestra y mezclar mediante pipeteo.</li>
		<li>Coloque el tubo de muestra en la máquina de PCR preajustada a 65 °C y tape a 105 °C durante 5 minutos y manténgalo a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntesis de ADNc de primera cadena<ol><li>Agregue 4 μL de tampón de reacción de síntesis (lila), 8 μL de reactivo de especificidad de hebra (marrón) y 2 μL de mezcla de enzimas de síntesis (marrón) a la muestra, lo que hace un volumen total de 20 μL. Mezcle bien pipeteando al menos 10 veces y gire rápidamente.</li>
		<li>Coloque el tubo de muestra en la máquina de PCR preajustado a 25 °C durante 10 minutos, 42 °C durante 50 minutos, 70 °C durante 15 minutos y manténgalo a 4 °C. NOTA: Para insertos de más de 200 bases, se sugiere un período de incubación de 50 min a 42 °C; para un tamaño de plaquita inferior a 200 bases, se sugiere un período de incubación de 15 min a 42 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntesis de ADNc de segunda cadena<ol><li>Agregue 8 μL de tampón de reacción de síntesis con la mezcla de dUTP (naranja), 4 μL de mezcla de enzimas de síntesis (naranja) y 48 μL de H2O sin nucleasa. Mezcle bien pipeteando al menos 10 veces y gire rápidamente.</li>
		<li>Coloque el tubo de muestra en la máquina de PCR preajustada a 16 °C durante 1 h con la tapa puesta o ≤40 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación de ADNc bicatenario con perlas de purificación de ADN<ol><li>Precaliente las perlas de purificación de ADN durante 30 minutos antes de realizar la purificación y el vórtice para volver a suspender las perlas.</li>
		<li>Añadir 144 μL de perlas de purificación de ADN resuspendidas a la muestra de ADNc del paso 3.3.2 y mezclar bien pipeteando al menos 10 veces.</li>
		<li>Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
		<li>Coloque el tubo de muestra en una rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara y luego, retire el sobrenadante y guarde las perlas que contienen ADN.</li>
		<li>Añadir 200 μL de etanol al 80% recién hecho al tubo con las perlas manteniendo la muestra en la gradilla magnética e incubar a temperatura ambiente durante 30 s.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y repita el paso 3.4.5 una vez, pero esta vez retire con cuidado todo el sobrenadante residual.</li>
		<li>Seque las perlas al aire durante 1-5 minutos mientras mantiene la muestra en el imán. NOTA: No seque demasiado las cuentas; El color debe ser marrón oscuro.</li>
		<li>Retire la muestra de la gradilla magnética y eluya el ADN añadiendo 53 μL de tampón 0,1x TE (10 mM de Tris-HCl y 1 mM de EDTA, pH 8,0) a las perlas. Mezclar bien pipeteando al menos 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 2 min.</li>
		<li>Coloque el tubo en la rejilla magnética durante 5 minutos o hasta que la solución esté clara.</li>
		<li>Transfiera 50 μL de sobrenadante que contenga ADNc bicatenario a un nuevo tubo de 8 tiras. NOTA: El protocolo se puede detener en este punto y la muestra se puede almacenar a -30 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación final de la biblioteca de ADNc<ol><li>Agregue 7 μL de tampón de reacción de pulido final (verde) y 3 μL de mezcla de enzimas de pulido final (verde) a la muestra de ADNc bicatenario eluido.</li>
		<li>Mezcle la mezcla pipeteando 10 veces con un ajuste de volumen de 50 μL sin crear burbujas, luego gire rápidamente la muestra.</li>
		<li>Coloque la muestra en una máquina de PCR e incube a 20 °C durante 30 min, 65 °C durante 30 min y manténgala a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligadura de adaptadores<ol><li>Divida el adaptador (rojo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Agregue 2,5 μL del adaptador diluido, 1 μL de potenciador de ligadura (rojo) y 30 μL de Mezcla Maestra de Ligadura (rojo) a la muestra.</li>
		<li>Mezcle la mezcla pipeteando 10 veces con un ajuste de volumen de 80 μL sin crear burbujas, luego gire rápidamente la muestra.</li>
		<li>Colocar la muestra en una máquina de PCR e incubar a 20 °C durante 15 min.</li>
		<li>Añadir 3 μL de la mezcla de uracilo ADN glicosilasa y ADN glicosilasa-liasa endonucleasa VIII (azul) a la muestra y pipetear bien.</li>
		<li>Vuelva a colocar la muestra en la máquina de PCR e incube a 37 °C durante 15 min con la tapa ajustada a 75 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación de ADNc tratados con reacción de ligadura NOTA: La selección de tamaño con las cuentas SPRIselect o, opcionalmente, con las cuentas AMpure XP se pueden utilizar para este propósito18.<ol><li>Precalienta las perlas 30 min antes de realizar la purificación y el vórtice para volver a suspenderlas.</li>
		<li>Transfiera 25 μL de perlas resuspendidas a la muestra de ADNc del paso 3.6.6 y mezcle bien pipeteando al menos 10 veces.</li>
		<li>Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
		<li>Coloque el tubo de muestra en una rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara y luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 8 tiras y deseche las perlas.</li>
		<li>Añadir 10 μL de perlas resuspendidas al sobrenadante y mezclar bien pipeteando al menos 10 veces.</li>
		<li>Coloque el tubo de muestra en una rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara y luego deseche el sobrenadante y no altere las perlas.</li>
		<li>Añadir 200 μL de etanol al 80% recién hecho al tubo con las perlas manteniendo la muestra en la gradilla magnética e incubar a temperatura ambiente durante 30 s.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y repita el paso 3.7.7 una vez, pero esta vez retire con cuidado todo el sobrenadante residual.</li>
		<li>Seque las perlas al aire durante 1-5 minutos mientras mantiene la muestra en el imán. NOTA: No seque demasiado las cuentas; El color debe ser marrón oscuro.</li>
		<li>Retire la muestra de la gradilla magnética y eluya el ADN añadiendo 17 μL de tampón TE 0,1x a las perlas. Mezclar bien pipeteando al menos 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 2 min.</li>
		<li>Coloque el tubo en la rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara.</li>
		<li>Transfiera 15 μL de sobrenadante, que contiene dsDNA preparado para el extremo diana, a un nuevo tubo de 8 tiras.</li>
	</ol></li>
	<li>Enriquecimiento por PCR de ADN ligado por adaptador<ol><li>Agregue 25 μL de mezcla maestra (azul), 5 μL de cebador adaptador 5' y 5 μL de cebador adaptador 3' a la muestra de ADN ligada al adaptador. Mezcle bien pipeteando al menos 10 veces.</li>
		<li>Coloque la muestra en la máquina de PCR y realice la amplificación por PCR siguiendo los siguientes pasos: (1) 98 °C durante 30 s, (2) 98 °C durante 10 s, (3) 65 °C durante 75 s, (4) 65 °C durante 5 min y (5) mantener a 4 °C; en el que los pasos (2) y (3) deben repetirse para un número de ciclo N + 2 donde N es igual a la cantidad de entrada de ARN en el manual de instrucciones. Esto significa que se necesitan 2 ciclos adicionales debido a la selección del tamaño de las muestras de doble cara realizada en el paso 3.7. NOTA: Por ejemplo, se recomendarían 8 ng de la entrada de ARNm purificado con 9-10 ciclos de PCR; pero con ADNc ligado de doble cara y tamaño seleccionado en el paso 3.7, el ciclo de PCR recomendado sería de 11-12 ciclos.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación de librerías amplificadas por PCR<ol><li>Precaliente las perlas de purificación de ADN durante 30 minutos antes de realizar la purificación y el vórtice para volver a suspender las perlas.</li>
		<li>Transfiera 45 μL (0,9x) de perlas resuspendidas al producto de PCR del paso 3.8.2 y mezcle bien pipeteando al menos 10 veces.</li>
		<li>Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
		<li>Coloque el tubo de muestra en una rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara y luego retire el sobrenadante y conserve las perlas que contienen ADN.</li>
		<li>Añadir 200 μL de etanol al 80% recién hecho al tubo con las perlas, dejar la muestra en la gradilla magnética y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 s.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y repita el paso 3.9.5 una vez, pero esta vez retire con cuidado todo el sobrenadante residual.</li>
		<li>Seque las perlas al aire durante 1-5 minutos mientras mantiene la muestra en el imán. NOTA: No seque demasiado las cuentas; El color debe ser marrón oscuro.</li>
		<li>Retire la muestra de la rejilla magnética y agregue 22 μL de tampón TE 0.1x a las perlas para eluir el ADN. Mezclar bien pipeteando al menos 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante 2 min.</li>
		<li>Coloque el tubo en la rejilla magnética y déjelo reposar durante 5 minutos o hasta que la solución esté clara a temperatura ambiente.</li>
		<li>Transfiera 20 μL de sobrenadante a un nuevo tubo de 8 tiras.</li>
		<li>Transfiera 2,2 μL a tubos de 8 tiras para evaluar la calidad de la cantidad y calidad de la biblioteca. NOTA: La cantidad de la biblioteca también se puede detectar mediante qPCR (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Almacene la muestra de la biblioteca bsRNA-seq a -20 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>

Creación de bibliotecas robustas de bisulfito-ARNm para el mapeo de todo el transcriptoma

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<li>Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+5-methylcytosine+%28m5C%29+RNA+Methyltransferases%3A+Mechanisms%2C+Cellular+Functions%2C+and+Links+to+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease.</a> Genes. 10 (2), 102(2019).</li>
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<li>Leger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+modifications+detection+by+comparative+Nanopore+direct+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing.</a> Nature Communications. 12 (1), 7198(2021).</li>
<li>Mateos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+m6A+and+m5C+RNA+modifications+at+single-molecule+resolution+from+Nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+parameters+in+RNA+bisulfite+sequencing+data+generation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Genomics+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis.</a> NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045(2022).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+calibration+of+epitranscriptomic+maps+using+a+synthetic+modification-free+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library.</a> Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).</li>
<li>Chao, H. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

En este protocolo, se logró una línea detallada de enriquecimiento de poli(A), conversión de bisulfito y preparación de bibliotecas mediante la utilización de componentes estandarizados. Un análisis de secuenciación adicional proporcionó la identificación de ARNm 5-metilcitosina en muestras de interés.
El paso crítico es la calidad del material de partida (ARN total), ya que la degradación del ARN afectaría la tasa de recuperación de la purificación del ARN poli(A). La muestra debe manipularse...

Entre los más de 150 tipos de modificaciones postranscripcionales1, se ha identificado la modificación de la 5-metilcitosina (m5C) en varios tipos de ARN, incluidos el ARN ribosómico, el ARN de transferencia, el ARN mensajero, el micro ARN, el ARN largo no codificante, el ARN de bóveda, el ARN potenciador y los ARN pequeños específicos del cuerpocajal 2. El ARN m 5 C se asocia con diversos mecanismos biológicos y patológicos, como la regulación del desarrollo radicular de las plantas3, la expresión génica viral4 y la progresión del cáncer5. El objetivo de este protocolo es proporcionar canales optimizados para caracterizar el perfil de modificación de ARNm m5C de todo el transcriptoma de muestras biológicas en diferentes etapas de desarrollo o en el entorno de la enfermedad. Se desarrolló la secuenciación de bisulfito en todo el transcriptoma para caracterizar las posiciones y los niveles cuantitativos de metilación de citosina en el ARN convertido en bisulfito a una resolución de pares de bases 6,7,8,9. Esto es particularmente útil cuando se estudia la asociación de m5C con la expresión génica y el destino del ARN que está involucrado en los mecanismos de regulación biológica en las células. En la célula de mamífero, hay dos lectores de m 5 C conocidos: ALYREF puede reconocer m 5 C en el núcleo y sirve como transportador de núcleo de ARNm a citosol10, mientras que YBX1 puede reconocer m5C en elcitoplasma y aumentar la estabilización del ARNm11. Se reportaron ARNm aberrantes m5C relacionados con vías inmunes en células T CD4+ de lupus eritematoso sistémico12. Los estudios han revelado una asociación entre la modificación del ARNmm 5C y la modulación de la inmunidad contra el cáncer y la progresión del cáncer13,14. Por lo tanto, el mapeo del perfil de modificación de m5C en el ARNm puede proporcionar información crucial para dilucidar la posible maquinaria reguladora.
Para investigar las funciones funcionales de la modificación delARN m 5 C en determinadas condiciones biológicas, los enfoques basados en la conversión de bisulfito (bsRNA-seq) y basados en el enriquecimiento de la afinidad de anticuerpos, como m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq y 5-Aza-seq, pueden combinarse con la plataforma de secuenciación de alto rendimiento para proporcionar una detección eficiente de regiones y secuencias diana con las modificaciones m5C a escala de todo el transcriptoma15, 16. La ventaja de este protocolo proporciona el panorama completo de ARN m 5 C con una resolución de una sola base, ya que el enfoque basado en el enriquecimiento de afinidad de anticuerpos se basa en la disponibilidad de anticuerpos de alta calidad y podría lograr la resolución de unsolo fragmento del panorama de metilación de m5C17.
Todas las muestras de ARN se procesarán con dos rondas de enriquecimiento de ARNm utilizando perlas de oligo(dT), tres ciclos de reacción de bisulfito y la preparación de la biblioteca de secuenciación. Para controlar la calidad del ARN, cada muestra de ARN se examinará mediante electroforesis en gel capilar antes y después de los procedimientos de purificación del ARNm y reacción de bisulfito para evaluar la distribución de los fragmentos. Las bibliotecas purificadas se examinarán por sus cualidades de amplicón de PCR, fragmentos de distribución de tamaño de ADN mediante electroforesis en gel capilar y sus cantidades totales se examinarán mediante ensayos cuantitativos basados en colorantes de fluorescencia antes de la secuenciación. El sistema también se puede utilizar para analizar un amplio espectro de muestras biológicas, como productos agrícolas, viriones aislados, líneas celulares, organismos modelo y especímenes patológicos.

<table><tbody><tr><td>Sistema bioanalizador de electroforesis Agilent 2100</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td>Detección de calidad de ARN Cuentas</td></tr><tr><td>AMpure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>purificar Bioanalizador de</td></tr><tr><td>ADN kit de alta sensibilidad de ADN</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>5067-4626 Detección de</td><td>calidad de ADN</td></tr><tr><td>Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>5067-1513</td><td>ARN detección de calidad</td></tr><tr><td>DiaMag02 - rack magnético</td><td>Diagenode, Denville, NJ</td><td>B04000001</td><td>asistencia en la preparación de bibliotecas</td></tr><tr><td>DiaMag1.5 - rack magnético</td><td>Diagenode, Denville, NJ</td><td>B04000003 asistencia de</td><td>purificación de ARN poli(A)</td></tr><tr><td>Kit de purificación DIRECT de ARNm de Dynabeads</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>61011</td><td>purificación de ARN poli(A); Tampón de lavado 1 y tampón de lavado 2</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>J.T.Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>EZ Kit de metilación de ARN</td><td>Zymo, Irvine, CA</td><td>R5002</td><td>tratamiento con bisulfito</td></tr><tr><td>Luciferasa de luciérnaga ARNm</td><td>Promega, Madison, WI, EE. UU</td>. <td>L4561</td><td>pico en control seqeunce </td></tr><tr><td>KAPA Kits de cuantificación de bibliotecas</td><td>Roche, Suiza</td><td>KK4824</td><td>Cuantificación de bibliotecas</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de nanogotas</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td>Detección de cantidad de ARN total</td></tr><tr><td>NEBNext multiplex Oligos para illumina (índice Primer set1)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>E7335S preparación de</td><td>la biblioteca</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/65352/65352eq01.jpg" style="margin: auto; "> Kit de preparación de bibliotecas de ARN direccional para Illumina</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>Preparación de bibliotecas E7760S</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>4641010</td><td></td></tr><tr><td>Fluorómetro Qubit 2.0 </td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td>Detección de cantidad de ARN</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Q32854</td><td>Detección de cantidad</td></tr><tr><td>de ADN Qubit Kit de ensayo ARN HS Qubit Thermo</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Q32852</td><td>Detección de cantidad de ARN</td></tr></tbody></table>

enriquecimiento de la biblioteca de arnm y bisulfito-arnm para la secuenciación de nueva generación

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

Las modificaciones postranscripcionales del ARN en varios tipos de transcripciones de ARN se asocian con una regulación diversa del ARN en las células eucariotas. Se ha demostrado que las modificaciones aberrantes del ARN 5-metilcitosina y la expresión desregulada de las metiltransferasas de ARN están asociadas con diversas enfermedades, incluidos los cánceres. Se desarrolló la secuenciación de bisulfito en todo el transcriptoma para caracterizar las posiciones y los niveles cuantitativos de metilación de citosina en el ARN convertido en bisulfito a la resolución de pares de bases. En este documento, este protocolo presenta los procedimientos de dos rondas de purificación de ARN poli(A), tres ciclos de reacción de bisulfito y la preparación de la biblioteca en detalle para permitir el mapeo de todo el transcriptoma de los sitios de modificación del ARNm 5-metilcitosina. La evaluación de la cantidad y calidad del ARN después de la reacción principal es esencial para controlar la integridad del ARN y es un paso crítico para garantizar bibliotecas de secuenciación de alta calidad. Lo ideal es que los procedimientos se puedan completar en tres días. Con este protocolo, el uso de ARN total de alta calidad como entrada puede crear bibliotecas robustas de bisulfito-ARNm para la secuenciación de próxima generación a partir de la muestra de interés.

Se generaron una serie de bibliotecas de bsRNA-seq a partir de las líneas celulares19 siguiendo los procedimientos de este informe (Figura 1). Después de la purificación total del ARN acompañada del tratamiento con DNasa realizado en muestras de líneas celulares y la calidad comprobada por electroforesis en gel y espectrofotometría UV-Vis (A260/A280), la muestra de ARN puede proceder al enriquecimiento de poli(A) ARN. Para determinar si la doble purif...

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo fácil de seguir para llevar a cabo la purificación del ARN poli(A), la conversión de bisulfito y la preparación de bibliotecas utilizando equipos estandarizados para una muestra biológica de interés.

Enriquecimiento de la biblioteca de ARNm y bisulfito-ARNm para la secuenciación de nueva generación

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...

Esta investigación tiene como objetivo estudiar el papel de la metilación del ARN, específicamente la modificación de la 5-metilcitosina, en el cáncer de páncreas. Las preguntas que queremos responder son cómo la regulación positiva o negativa de cierta metiltransferasa de ARN afecta a los fenotipos de las células cancerosas y también, a través de qué sustratos de ARN. Este estudio proporciona el panorama completo de ARN m5C a una resolución de una sola base con equipos estandarizados.A partir de este estudio utilizando bisulfito RNA seq, los resultados vinculan la asociación de la modificación del ARN m5C con una mala diferenciación de las células cancerosas. Esto debería allanar el camino para futuros estudios que permitan discernir los efectos de los pasajeros frente a los efectos de los impulsores de la enfermedad de m5C específico en los transcritos de ARN. Con esta técnica, podemos identificar el conjunto de ARN diferencialmente metilados que pueden participar en la progresión tumoral.Además, los experimentos con bases de una sola molécula pueden proporcionar un papel regulador más detallado del ARN específico m5C.

enrichment-mrna-bisulfite-mrna-library-preparation-for-next

Research

Investigación

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Biology

Biología

Aquí se describe un método para la preparación de los dos pares de solo lectura y final Illumina Sec-mRNA bibliotecas genómicas para el análisis de expresión genética basado en la amplificación del ARN T7 lineal. Este protocolo requiere solamente 10 nanogramos de ARN total a partir bibliotecas y genera muy consistente que representa transcripciones conjunto.

Solo lectura y pareadas final Sec ARNm bibliotecas de Illumina de 10 nanogramos ARN total

Un flujo de trabajo simplificado para estudiar la metilación del ADN y los cambios de expresión génica a principios del estrés de la vida se muestra. A partir de la separación materna de los ratones recién nacidos y el aislamiento de los tejidos cerebrales discretas, que representan un protocolo para aislar al mismo tiempo el ADN y el ARN de golpes de tejido cerebral para la secuenciación de bisulfito y posterior análisis de RT-PCR.

Análisis Optimizado de la metilación del ADN y la expresión génica de áreas pequeñas, anatómicamente definidas del cerebro

Los microRNAs (miRNAs) son una clase ampliamente conservada de moléculas reguladoras. Aquí describimos un método de clonación de miRNA que se basa en dos potentes pasos de ligadura seguidos de una secuenciación de alto rendimiento. Nuestro método permite una cuantificación precisa de miRNAs en todo el genoma.

Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

Secuenciación de bisulfito de representación reducida mejorada es un método para la preparación de bibliotecas de secuenciación para el análisis de metilación del ADN basado en la digestión de enzimas de restricción combinada con la conversión de bisulfito de citosina. Este protocolo requiere 50 ng de material de partida y produce datos de resolución de pares de bases en regiones genómicas ricas en GC.

Enhanced reducido Representación bisulfito secuenciación para la Evaluación de la metilación del ADN en la Resolución Base Par

La secuenciación de amplicones de bisulfito (BSAS) es un método para cuantificar la metilación de citosina en regiones genómicas específicas de interés. Este método utiliza la conversión de bisulfito emparejada con la amplificación por PCR de las regiones objetivo antes de la secuenciación de próxima generación para producir una cuantificación absoluta de la metilación del ADN a un nivel específico de base.

Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

Este protocolo describe un método para asignación pre-mRNA 3' final sitios de procesamiento.

Extremo 3' secuencia biblioteca elaboración con Sec2 A

Aquí, describimos el protocolo y la implementación de metil-Seq, una plataforma de epigenómica, utilizando un modelo de rata para identificar cambios epigenéticos asociados a la exposición de estrés crónico. Los resultados demuestran que la plataforma de metil-Seq de la rata es capaz de detectar diferencias de metilación que surgen de la exposición del estrés en ratas.

Una plataforma de metil-Seq de rata para identificar cambios epigenéticos asociados a la exposición de estrés

Presentamos un protocolo detallado de reparación de la biblioteca de ARN pequeño con menos sesgo que los métodos estándar y una mayor sensibilidad para los ARN de 2'-O-metil. Este protocolo se puede seguir utilizando reactivos caseros para ahorrar costos o usar kits para mayor comodidad.

Mejora de ARN pequeño-seq: Menos sesgo y mejor detección de 2'-O-Metil RNAs

Aquí se describen las etapas de la recolección de muestras y la preparación de RIBO-seq en bacterias. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con estas directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es simple, utiliza equipos de laboratorio estándar y tarda siete días desde la lisis hasta la obtención de bibliotecas.

RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS

Aquí, presentamos un protocolo para la selección in vitro de represores transcripcionales (ETR) diseñados con una alta eficiencia de silenciamiento estable, estable y a largo plazo y una baja actividad fuera del objetivo en todo el genoma. Este flujo de trabajo permite reducir un repertorio inicial y complejo de ETR candidatos a una lista corta, adecuada para una evaluación posterior en entornos terapéuticamente relevantes.

In vitro Selección de represores transcripcionales diseñados para el silenciamiento epigenético dirigido

Aprenda el enriquecimiento de bibliotecas de ARNm y secuenciación bisulfito-ARNm para analizar la metilación 5-metilcitosina en cáncer pancreático. Este método permite identificar ARN diferencialmente metilados implicados en la progresión tumoral.

Enriquecimiento de la biblioteca de ARNm y bisulfito-ARNm para la secuenciación de nueva generación

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