Name: Generación de podocitos derivados de pacientes a partir de biopsias de piel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprende a generar podocitos derivados de pacientes mediante reprogramación episomal de fibroblastos dérmicos en células madre pluripotentes inducidas. Este método permite modelar enfermedades renales con células personalizadas.

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Este trabajo fue financiado por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) de la Universidad Friedrich-Alexander de Erlangen-Nürnberg con el número de subvención M4-IZKF-F009 otorgado a Janina Müller-Deile, y por Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) bajo el nombre de proyecto STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, número de subvención 01GM2202D otorgado a Janina Müller-Deile. Agradecemos a Annalena Kraus por el apoyo en la toma de imágenes SEM.

Uso de biopsias de piel para generar podocitos derivados de pacientes

<ol><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li>
<li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li>
<li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+glomerular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li>
<li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li>
<li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li>
<li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li>
<li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).</li>
<li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+podocytopathies%3A+a+unifying+view+of+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li>
<li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+protection+by+darbepoetin%3A+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+%26+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+expression%2C+behaviors%2C+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li>
<li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li>
<li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipping+your+feet+in+the+water%3A+podocytes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li>
<li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li>
<li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).</li>
<li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+%28FSGS%29+factor+suPAR+using+CytoSorb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li>
<li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia%3A+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li>
<li>Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+excretion+of+viable+podocytes+in+health+and+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).</li>
<li>Petermann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+that+detach+in+experimental+membranous+nephropathy+are+viable%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable.</a> Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).</li>
<li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li>
<li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li>
<li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+more+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).</li>
<li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114(2016).</li>
<li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo basado en cultivo celular combina la reprogramación episomal de fibroblastos dérmicos humanos en hiPSC específicas del paciente y la posterior diferenciación en podocitos derivados de hiPSC. Esto nos permite estudiar las alteraciones relacionadas con mutaciones de los podocitos de pacientes con enfermedad glomerular genética con respecto a la lesión de los podocitos. El protocolo para reprogramar fibroblastos dérmicos con un método libre de integración por electroporación está adaptado del trabajo publicado de Bang et al.32 y Okita et al.33. El protocolo para diferenciar los podocitos de las hiPSCs está adaptado del protocolo publicado de Musah et al.28,34,35. Ya existen publicaciones disponibles que describen la generación de podocitos a partir de hiPSCs 27,34,35. Sin embargo, el protocolo proporcionado aquí está optimizado y es menos costoso con respecto a la diferenciación de hiPSC en podocitos. En comparación con el protocolo publicado de Musah et al., probamos este protocolo en diferentes reactivos de recubrimiento, como vitronectina, laminina seda-511 y matriz de membrana basal solubilizada. Las concentraciones de vitronectina y laminina seda-511 podrían reducirse a 2,5 μg/ml en lugar de 5 μg/ml 28,34,35. Además, fue posible disminuir las concentraciones de BMP7 y activina A, dos factores de crecimiento muy caros, en un 50%, de 100 ng / ml a 50 ng / ml.
Esto permite una diferenciación menos costosa. Las células progenitoras de nefronas desde el día 7 seguían proliferando, y la posibilidad de congelación se demostró antes. Expandimos estas células después de la descongelación y antes de la diferenciación final en medio básico que contiene el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y B27 durante varios días, disminuyendo aún más los costos. Además de los pasos de diferenciación, este protocolo describe el crecimiento de fibroblastos de biopsias de piel con la posterior generación de hiPSC específicas del paciente a través de la reprogramación episomal. La combinación de estos dos métodos permite la generación de podocitos específicos del paciente. Por lo tanto, aquí se proporciona un protocolo completo paso a paso para generar podocitos derivados de hiPSC específicos del paciente que no se describió antes con tanto detalle.
Como el protocolo general incluye varios tipos de células diferentes, es crucial caracterizar los tipos de células generadas en diferentes pasos. Las células están en cultivo durante un período prolongado de tiempo, por lo que el control de calidad debe realizarse en diferentes pasajes. Cuando se trabaja con hiPSCs, es necesaria la alimentación diaria, así como el comportamiento celular y el monitoreo de la morfología. La esterilidad de los medios de diferenciación debe garantizarse mediante la esterilización del filtro a través de un filtro de 0,2 μm. Todo el protocolo, desde la biopsia de piel hasta los podocitos derivados de hiPSC, lleva varios meses, pero es posible congelar las células en distintas etapas del proceso. Los fibroblastos, los clones de hiPSC seleccionados y las células progenitoras proliferativas de nefronas después de 7 días en el medio de diferenciación progenitora de nefronas se pueden congelar y se puede generar un banco de células funcional.
A pesar de que los podocitos sanos derivados de hiPSC desarrollan una red distinta de procesos primarios y secundarios del pie (Figura 5A, B) y expresan un marcador típico específico de podocitos (Figura 6A-C), los diafragmas característicos de hendidura, como se ve in vivo, son difíciles de imitar en los modelos clásicos de cultivo celular bidimensional. Además, la comunicación intercelular con otros tipos de células glomerulares no es posible en este entorno de monocultivo.
Debido a su estado terminal diferenciado y la falta de capacidad de proliferación, es difícil estudiar los podocitos ex vivo. Con la ayuda de la inmortalización condicional de podocitos primarios, es posible superar esta limitación mediante la inserción de un interruptor termosensible, lo que resulta en un modelo de cultivo celular donde las células proliferan a 33 °C y se diferencian a 37 °C13,14. A pesar de que estos cipodocitos tienen un alto potencial para la investigación de podocitos, existen limitaciones, como la falta de expresión del marcador, la morfología desdiferenciada y la falta de formación de procesos del pie15,16.
La diferenciación de podocitos de células somáticas derivadas de pacientes permite la generación y comparación de podocitos enfermos con células de control sanas ex vivo. Esto nos permite estudiar el daño de los podocitos debido a mutaciones en genes específicos de podocitos. Además, trabajar con hiPSCs tiene el potencial de crear modelos tridimensionales de enfermedades de cultivo celular, o más bien organoides43,44. El cocultivo de podocitos derivados de hiPSC con otras células glomerulares, como las células endoteliales glomerulares o las células mesangiales, podría conducir a nuevos conocimientos sobre la comunicación intercelular en la salud y la enfermedad glomerular.
Además, la caracterización y el tratamiento de los podocitos específicos del paciente se pueden realizar ex vivo en análisis de alto rendimiento. El enfoque individualizado abre la oportunidad de investigar nuevos objetivos terapéuticos para mutaciones específicas y realizar medicina individualizada en el futuro.

Los podocitos son células epiteliales renales postmitóticas especializadas que forman la barrera de filtración glomerular del riñón junto con la membrana basal glomerular (GBM), las células endoteliales glomerulares y el glicocálix. Fenotípicamente, los podocitos consisten en un cuerpo celular y extensiones primarias de membrana impulsadas por microtúbulos, así como extensiones secundarias llamadas procesos del pie 1,2. La barrera de filtración glomerular que filtra la orina de la sangre está construida de endotelio fenestrado, GBM, y un tipo especializado de unión intercelular que conecta los procesos vecinos del pie de podocitos, llamado diafragma de hendidura de podoctyes3. En condiciones saludables, las proteínas más grandes que la albúmina son retenidas de la barrera de filtración debido a su tamaño y carga4.
Se sabe que las mutaciones en genes citoesqueléticos o específicos de podocitos, así como los factores circulantes que afectan las vías de señalización de los podocitos, inducen borramiento, desprendimiento o apoptosis de podocitos, lo que resulta en proteinuria y esclerosis glomerular. En particular, el reordenamiento citoesquelético, los cambios en la polaridad de los podocitos o el daño de los procesos del pie con una pérdida asociada de las uniones de hendidura son fundamentales5. Debido a su estado terminalmente diferenciado, los podocitos difícilmente pueden ser reemplazados después del desprendimiento del GBM. Sin embargo, si los podocitos están unidos al GBM, aún pueden recuperarse de la borración y reformar los procesos interdigitados del pie 6,7,8. Una mayor comprensión de los eventos que conducen al daño de los podocitos en diversos trastornos glomerulares puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos que ayudarán a desarrollar tratamientos para estas enfermedades. El daño de los podocitos es un sello distintivo de diferentes enfermedades glomerulares, incluyendo la glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GFS), la nefropatía diabética, la enfermedad de cambios mínimos y la glomerulonefropatía membranosa, que requieren modelos fiables de podocitos ex vivo para estudiar los mecanismos patológicos y los posibles enfoques de tratamiento para estas enfermedades 9,10. Los podocitos pueden ser estudiados ex vivo por cultivo celular primario clásico basado en el aislamiento de glomérulos por tamizado diferencial11. Sin embargo, debido al estado terminalmente diferenciado con capacidad de proliferación limitada, la mayoría de los investigadores utilizan líneas celulares de cipodocitos de ratón o humanos que expresan variantes sensibles a la temperatura del antígeno T grande SV40. Alternativamente, los cipodocitos se aíslan de ratones transgénicos que albergan el gen inmortalizador SV40 Tag 1,12.
Los cipodocitos proliferan a 33 °C, pero entran en detención del crecimiento y comienzan a diferenciarse a 37 °C13,14. Hay que tener en cuenta que los datos experimentales obtenidos con estas células deben interpretarse con cierta cautela, ya que las células se generan utilizando una inserción génica antinatural15. Como estas células albergan un gen inmortalizante, la fisiología celular se altera debido a la proliferación en curso12. Las líneas celulares de podocitos generadas por este enfoque han sido cuestionadas recientemente, ya que los cipodocitos de ratón, humanos y ratas expresan menos del 5% de sinaptopodina y nefrina a nivel de proteína, así como NPHS1 y NPHS2 a nivel de ARNm en comparación con la expresión glomerular16. Además, la mayoría de las líneas celulares de podocitos no expresan nefrina17,18. Chittiprol et al. también describieron una diferencia significativa en la motilidad celular y las respuestas a la puromicina y doxorrubicina en cipodocitos16. Los podocitos se pueden encontrar en la orina después del desprendimiento del GBM en diferentes enfermedades glomerulares 19,20,21,22. Los podocitos urinarios viables pueden cultivarse ex vivo hasta por 2-3 semanas, pero la mayoría de las células sufren apoptosis23,24. Curiosamente, los podocitos no sólo se encuentran en la orina de pacientes con enfermedad glomerular, sino también en la orina de sujetos sanos, muy probablemente cuando son senescentes de nuevo con un potencial limitado de replicación en cultivo24. Además, el número de podocitos derivados de la orina es limitado, y las células se desdiferencian en cultivo, muestran menos procesos del pie, cambian la morfología y, lo que es más importante, tienen una capacidad de proliferación limitada. La expresión de genes específicos de podocitos está ausente, desaparece en unas pocas semanas o varía entre estos clones celulares. Algunas células positivas para el marcador específico de podocitos co-expresaron el marcador de células epiteliales tubulares o miofibroblastos y células mesangiales, lo que sugiere desdiferenciación y/o transdiferenciación de los podocitos urinarios cultivados24,25.
Recientemente, se ha descrito la generación de líneas celulares de cipodocitos derivadas de la orina de pacientes y voluntarios sanos por transducción con un antígeno T grande SV40 termosensible y hTERT26. Se detectó la expresión de ARNm para sinaptopodina, nestina y proteína asociada a CD2, pero el ARNm de podocina estuvo ausente en todos los clones. Además de los problemas con los podocitos urinarios, estas células también contienen el gen inmortalizador insertado, lo que resulta en las desventajas discutidas anteriormente.
Por el contrario, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) tienen una enorme capacidad para autorrenovarse y diferenciarse en múltiples tipos de células en condiciones adecuadas. Se ha demostrado antes que las hiPSCs pueden servir como una fuente casi ilimitada de podocitos27,28.
Aquí, se describe un protocolo de dos pasos para generar podocitos específicos del paciente a partir de fibroblastos dérmicos de biopsias de punción cutánea con posterior reprogramación episomal en hiPSC y una diferenciación final en podocitos derivados de hiPSC (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg"> Figura 1: Protocolo para generar podocitos derivados de hiPSC específicos del paciente. Resumen gráfico del protocolo para generar podocitos específicos del paciente a partir de fibroblastos dérmicos de una biopsia de piel mediante la reprogramación en hiPSCs y la diferenciación en podocitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Como primer paso, los fibroblastos dérmicos somáticos se superaron a partir de una biopsia por punción cutánea y se reprogramaron en hiPSCs utilizando un método libre de integración por electroporación con plásmidos que expresan los factores de transcripción OCT3/4, KLF4, SOX2 y c-MYC 29,30,31. Las colonias hiPSC emergentes fueron posteriormente seleccionadas y expandidas. La diferenciación comenzó con la inducción del linaje mesodérmico mediante la activación de la vía de señalización WNT, seguida de la generación de células progenitoras de nefronas que aún podían proliferar. Finalmente, las células se diferenciaron en podocitos. En este procedimiento, modificamos y combinamos protocolos previamente publicados para la reprogramación episomal para la generación de hiPSCs por Bang et al.32 y Okita et al.33, así como un protocolo para la diferenciación de hiPSCs en podocitos por Musah et al.28,34,35.
De hecho, los podocitos generados por nuestro protocolo tenían un fenotipo más cercano a los podocitos in vivo, con respecto al desarrollo de una red distinta de procesos primarios y secundarios del pie y la expresión de marcadores específicos de podocitos, como sinaptopodina, podocina y nefrina. Con el uso de podocitos derivados de hiPSC, los antecedentes genéticos del paciente se mantienen durante la reprogramación y diferenciación. Esto permite el modelado de la enfermedad de los podocitos específicos del paciente y el descubrimiento de posibles sustancias terapéuticas ex vivo en un número de células casi ilimitado. Además, este protocolo es mínimamente invasivo, rentable, éticamente aceptable y puede facilitar nuevas vías para el desarrollo de fármacos.

<table><tbody><tr><td>0,2 y micro; m filtro estéril</td><td>Rotilab</td><td>P668.1</td><td>para la esterilización del medio de diferenciación</td></tr><tr><td>Ácido transretinoico All-Trans</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72262</td><td>Suplemento para la diferenciación</td></tr><tr><td>Suplemento B27 (50 x), sin suero</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>suplemento para medio de diferenciación sin suero</td></tr><tr><td>BG iMatrix-511</td><td>Biogemas de</td> seda <td>RL511S</td><td>opción adicional de reactivo de matriz extracelular utilizado en la solución de recubrimiento para recubrir plásticos de cultivo celular adecuados para el cultivo de hiPSC</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Tapón de filtro Matraces de cultivo celular, T75, 250 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-856</td><td>plásticos de cultivo celular adecuados para el cultivo de fibroblastos</td></tr><tr><td>CHIR99021 (5 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252917-06-9&nbsp;</td><td>Suplemento para la diferenciación</td></tr><tr><td>Matriz calificada por hESC de Corning Matrigel &nbsp;</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>opción adicional de reactivo de matriz extracelular utilizado en solución de recubrimiento para recubrir plásticos de cultivo celular adecuados para el cultivo de hiPSC (matriz de membrana basal solubilizada)</td></tr><tr><td>countess Cámara de recuento de células portaobjetos</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>para contar células</td></tr><tr><td>countess II FL&nbsp; Contador de células automatizado</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>para contar células</td></tr><tr><td>tubos cryoPure, 2 ml, tapón de rosca QuickSeal, blanco</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>crioviales para la congelación de células</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>A994.1</td><td>para fibroblastos medio de congelación</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>medio básico para la diferenciación</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>medio básico para medio de fibroblastos</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Sistema de imagen Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Microscopio de contraste de AMF5000 fase</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino premium, inactivado (FCS)</td><td>PAN Biotech P301902</td><td></td><td>suero para medio de fibroblastos, medio de congelación de fibroblastos y medio de mantenimiento de podocitos</td></tr><tr><td>Electroporation Cubetas Plus de la marca Fisher. Capacidad L, estéril</td><td>Cubeta</td><td>FB104</td> de Fisherbrand <td>utilizada para la electroporación/reprogramación episomal de fibroblastos (espacio de 4 mm)</td></tr><tr><td>Medio de montaje fluoromount-G, con</td> medio de montaje DAPI <td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td>que contiene</td></tr><tr><td>aguja de calibre DAPI (0,6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance3</td><td>300700</td><td>para la separación de colonias de hiPSC en trozos</td></tr><tr><td>pequeños Proteína</td> <td>Activina A recombinante humana78001.1</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>suplemento para la diferenciación proteína</td></tr><tr><td>morfogenética ósea recombinante humana 7 (BMP7)</td><td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td>suplemento para la diferenciación</td></tr><tr><td>humana VEGF-165 Proteína recombinante</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394</td><td>suplemento para la diferenciación</td></tr><tr><td>insulina-transferrina-selenio (ITS -G) (100 x)</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>suplemento para medio de mantenimiento para podocitos</td></tr><tr><td>LB medium Roth</td><td></td><td>X964.1</td><td>para la prueba de esterilidad del cultivo hiPSC</td></tr><tr><td>lookOut Kit de detección de PCR de micoplasma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MP0035-1KT</td><td>Profesional kit de detección de micoplasma</td></tr><tr><td>portaobjetos para microscopio</td><td>Diagonal GmbH & Co.KG</td><td>21.102</td><td></td></tr><tr><td>microtubo 1,5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Kit completo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td>medio básico para medio de cultivo hiPSC sin suero</td></tr><tr><td>contenedor de congelación nalgene Mr.Frosty</td><td>Roth</td><td>AC96.1&nbsp;</td><td>para garantizar unas condiciones óptimas de congelación</td></tr><tr><td>suero de cabra normal</td><td>ABCAM</td><td>AB 7481</td><td>para solución de preincubación y diluyente de anticuerpos</td></tr><tr><td>nunc placas de 24 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>142485</td><td>plásticos de cultivo celular adecuados para el cultivo de hiPSC</td></tr><tr><td>nunc placas de 48 pocillos&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>152640</td><td>plásticos de cultivo celular adecuados para placas de cultivo de 6</td></tr><tr><td>pocillos nunc de cultivo hiPSC&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>140685</td><td>plásticos de cultivo celular adecuados para el cultivo de alta</td></tr> densidad <tr><td>nunc Placas EasYDish de 100 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150466</td><td>plásticos de cultivo adecuado para el cultivo de hiPSC</td></tr><tr><td>nunc MicroWell de 96 pocillos, Nunclon con tratamiento Delta, microplaca de fondo plano</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>plásticos de cultivo celular adecuados para el cultivo de hiPSC</td></tr><tr><td>nutriFreez D10 Medio de criopreservación</td><td>Sartorius</td><td>05-713-1E&nbsp;</td><td>medio de criopreservación sin suero para la criopreservación de células progenitoras de hiPSC y nefronas</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>medio de electroporación&nbsp;</td></tr><tr><td>pCXLE-hMLN</td><td>Addgene</td><td>#27079</td><td>plásmido para reprogramación episomal</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4 plásmido</td><td>Addgene</td><td>#27077</td><td>plásmido para reprogramación episomal</td></tr><tr><td>PCXLE-hSK plásmido</td><td>Addgene</td><td>#27078</td><td>plásmido para la reprogramación episomal</td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>para evitar la contaminación bacteriana</td></tr><tr><td>plástico cubreobjetos</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 83.1840.002</td><td>para tinciones inmunofluorescentes de hiPSCs y podocitos derivados de hiPSC</td></tr><tr><td>ROTI Histofix</td><td>Roth</td><td>P087.3</td><td>paraformaldehído comercial (4 %) para la fijación de células</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td>medio básico para el medio de mantenimiento de podocitos</td></tr><tr><td>cámara de tinción StainTray Tapa negra</td><td>Roth</td><td>HA51.1</td><td></td></tr><tr><td>reactivo de disociación celular stemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>solución de desprendimiento de células enzimáticas utilizada para la disociación de hiPSCs</td></tr> solución <tr><td>salina estéril tamponada con fosfato (PBS) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>utiliza para lavar y recubrir</td></tr><tr><td>agua estéril</td><td>Jeringa Roth</td><td>T1432</td><td></td></tr><tr><td>sin aguja 20 mL</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td>para filtrar esterilizar medio de diferenciación</td></tr><tr><td>placa TC 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td>plásticos de cultivo celular estériles utilizados para cortar la biopsia de piel y cultivo de fibroblastos</td></tr> placa <tr><td>TC 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,900</td><td>plásticos de cultivo celular estériles utilizados para superar fibroblastos de biopsia de piel</td></tr><tr><td>tritón X 100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td>para solución de preincubación&nbsp;</td></tr><tr><td>Tinción azul de tripano (0,4 %) para usar con el contador de células automatizado Countess</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>para contar células</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (10 x)&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>X0930-100</td><td>reactivo de disociación utilizado para fibroblastos y células progenitoras de nefrona</td></tr><tr><td>tubo 15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>tubo 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>vitronectina ACF</td><td>Sartorius</td><td>05-754-0002</td><td>reactivo de matriz extracelular utilizado en solución de recubrimiento para recubrir plásticos de cultivo celular adecuados para el cultivo</td></tr> <tr><td>de hiPSCY-27632 diclorhidrato (10 mg)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>para evitar la apoptosis de las hiPSCs durante la división</td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos primarios</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60093.1</td><td>marcador de pluripotencia, dilución 1:200</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60062FI.1</td><td>marcador de pluripotencia, dilución 1:100</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>marcador de proliferación, dilución 1:300</td></tr><tr><td>sinaptopodina</td><td>Proteintech</td><td>21064-1-AP</td><td>marcador específico de podocito, dilución 1:200</td></tr><tr><td>nefrina</td><td>Progen</td>Marcador específico de podocitos <td>GP-N2</td><td>, dilución 1:25</td></tr><tr><td>Proteintech</td><td></td><td>20384-1-AP</td> marcador <td>específico de podocitos, dilución 1:100</td></tr><tr><td><Anticuerpos > secundarios</Anticuerpos</td> anti-cobaya fuerte > <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cabra IgG (H+L) altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21435</td><td>secundario anditbody, dilución 1:1000</td></tr><tr><td>alexa Fluor 647 Kit SFX Anti-Conejo de Cabra, altamente adsorbido</td><td>Invitrogen</td><td>A31634</td><td>secundario anditbody, dilución 1:1000</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario anti-Conejo IgG (H+L) anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>secundario anditbody, dilución 1:1000</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario de IgG (H+L) anti-Mouse de cabra, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>secundario yitbody, dilución 1:1000</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario de absorción cruzada anti-IgG (H+L) anticuerpo secundario anti-ratón IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>, <td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>secundario, dilución 1:1000</td></tr></tbody></table>

generación de podocitos derivados de pacientes a partir de biopsias de piel

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Los podocitos son células epiteliales que se encuentran en el sitio urinario de la barrera de filtración glomerular que contribuyen a la función de filtro selectivo del glomérulo. Las mutaciones en genes específicos de podocitos pueden causar glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GFS), y los podocitos también se ven afectados en muchas otras nefropatías primarias y secundarias. Debido a su naturaleza diferenciada, los modelos de cultivo celular primario son limitados para los podocitos. Por lo tanto, comúnmente se utilizan células inmortalizadas condicionalmente. Sin embargo, estos podocitos inmortalizados condicionalmente (cipodocitos) tienen varias limitaciones: las células pueden desdiferenciarse en cultivo, especialmente cuando alcanzan la confluencia, y varios marcadores específicos de podocitos son solo ligeramente o no se expresan en absoluto. Esto pone en tela de juicio el uso de cipodocitos y su aplicabilidad para el alcance fisiológico, fisiopatológico y clínico. Aquí, describimos un protocolo para la generación de podocitos humanos, incluidos los podocitos específicos del paciente, a partir de una biopsia por punción cutánea mediante la reprogramación episomal de fibroblastos dérmicos en hiPSC y la posterior diferenciación en podocitos. Estos podocitos se parecen mucho mejor a los podocitos in vivo en términos de características morfológicas, como el desarrollo de procesos del pie y la expresión del marcador específico de podocitos. Finalmente, pero importante, estas células mantienen las mutaciones de los pacientes, lo que resulta en un modelo ex vivo mejorado para estudiar enfermedades de podocitos y posibles sustancias terapéuticas en un enfoque individualizado.

Con este protocolo paso a paso que combina la reprogramación episomal y la diferenciación, es posible generar podocitos portadores de la mutación de un paciente en un gen relevante para los podocitos. Esto permite el análisis ex vivo de alteraciones de podocitos específicas de la enfermedad. Los antecedentes genéticos del paciente se conservan durante el protocolo durante todas las diferentes etapas celulares. Además, la limitación del número insuficiente de células de podocitos no proliferantes terminalmente diferenciados puede superarse mediante el uso de podocitos derivados de hiPSC. Aunque se necesitan varios meses hasta que los podocitos hiPSC se generan a partir de fibroblastos dérmicos superados a través de la reprogramación en hiPSC y la posterior diferenciación en podocitos, es posible congelar células en tres pasos diferentes del protocolo (Figura 2). La congelación es posible para fibroblastos, hiPSCs y células progenitoras de nefronas después de la diferenciación en medio de diferenciación progenitora de nefronas durante 7 días. Por lo tanto, es posible la generación de bancos de células funcionales y experimentos a gran escala.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg"> Figura 2: Pasos individuales del protocolo a través de un microscopio de contraste de fase. (A) Fibroblastos dérmicos superados. (B) formación de colonias hiPSC después de la reprogramación. (C) Cultura hiPSC seleccionada. (D) Células del mesodermo después de 2 días de diferenciación. (E) Células progenitoras de nefronas después de 14 días de diferenciación en medio de diferenciación progenitora de nefronas. (F) Podocitos terminales diferenciados derivados de hiPSC. Las barras de escala representan 300 μm (A, B, D-F) y 150 μm (C). El copo de nieve resalta los posibles pasos de congelación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Como los podocitos derivados de hiPSC generados atraviesan un protocolo largo con cambios drásticos con respecto al tipo de célula y la morfología, la caracterización celular es obligatoria. La morfología celular, como el tamaño y la forma de la célula, así como el comportamiento de crecimiento, se pueden monitorear usando un microscopio de contraste de fase. Los fibroblastos presentan un fenotipo largo en forma de huso con un tamaño de 150 μm a 300 μm (Figura 2A). Después de la reprogramación, se producen colonias con hiPSCs pequeñas de 50 μm. Estas colonias muestran fronteras distintas e hiPSCs distinguidas con una alta relación núcleo-cuerpo y una mayor tasa de proliferación (Figura 2C). Dado que los podocitos son células terminalmente diferenciadas, la tasa de proliferación disminuye con la diferenciación progresiva, y la morfología celular cambia a podocitos grandes en forma de estrella de 300 μm con procesos prominentes del pie (Figura 2F).
La confluencia es un punto crítico del cultivo hiPSC, y la diferenciación espontánea puede aparecer cuando las colonias crecen demasiado densas (Figura 3). Estas colonias deben eliminarse antes de pasar raspando las partes afectadas de la placa de cultivo.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg"> Figura 3: Ejemplos de hiPSCs de diferente calidad. Imágenes de contraste de fase de (A) colonias de hiPSC reprogramadas con éxito y (B) hiPSC seleccionadas, así como (C) diferenciación espontánea, (D,E) colonias no hiPSC y (F) un cultivo hiPSC demasiado denso. Las barras de escala representan 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los diferentes tipos celulares de este protocolo deben ser validados en cuanto a la expresión de un marcador específico. Después de la reprogramación, las hiPSCs recuperan la capacidad de pluripotencia y expresan marcadores de proliferación y pluripotencia como SSEA4, OCT3/4 y Ki67 (Figura 4)38,39,40. Se sabe que la reprogramación, así como el largo cultivo de hiPSCs y diferenciación, pueden conducir a un cariotipo anormal, o más bien inducir mutaciones41. Por lo tanto, los antecedentes genéticos de las células cultivadas deben ser monitoreados a lo largo del tiempo y en diferentes pasajes mediante banda g y secuenciación del exoma completo.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg"> Figura 4: Caracterización de las hiPSCs generadas por tinción por inmunofluorescencia. Caracterización de hiPSCs generadas mediante tinción para (A) el marcador proliferativo Ki67, así como los marcadores de pluripotencia (B) OCT3/4 y (C) SSEA4. Las barras de escala representan 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Morfológicamente, los podocitos derivados de hiPSC aparecen en forma de estrella y expresan una red distinta de largos procesos primarios y secundarios del pie en comparación con los cipodocitos (Figura 5). Los podocitos derivados de HiPSC expresan proteínas marcadoras específicas de podocitos como sinaptopodina, nefrina y podocina (Figura 6A-C)42.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg"> Figura 5: Morfología de los podocitos derivados de hiPSC en comparación con los cipodocitos. Comparación de podocitos derivados de (A,B) hiPSC de un donante sano con (C,D) ciPodocitos con respecto a la morfología celular y filopodios mediante el uso de un microscopio de contraste de fase (A,C) y un microscopio electrónico de barrido (B,D). Las barras de escala representan 150 μm (A,C) y 20 μm (B,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Por lo tanto, la comparación de podocitos derivados de hiPSC no solo de donantes sanos, sino también de pacientes con mutaciones en genes específicos de podocitos, permite la caracterización individualizada de la mutación del paciente ex vivo.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg"> Figura 6: Caracterización de un marcador específico de podocitos en podocitos y cipodocitos derivados de hiPSC. Comparación de podocitos derivados de hiPSC (A-C) de un donante sano con (D-F) ciPodocitos con respecto a las proteínas marcadoras específicas de podocitos sinaptopodina (A, D), nefrina (B, E) y podocina (C, F). Las barras de escala representan 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1. Composición de todos los medios de cultivo celular y soluciones utilizadas en el estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Este manuscrito describe un protocolo de dos pasos para generar podocitos específicos del paciente a partir de fibroblastos dérmicos a través de la reprogramación episomal en células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y la posterior diferenciación en podocitos.

Generación de podocitos derivados de pacientes a partir de biopsias de piel

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...

Describimos un protocolo para generar podocitos humanos mediante la reprogramación episomal de fibroblastos dérmicos en células madre pluripotentes inducidas por humanos. Estas células se parecen mucho mejor a los podocitos in vivo que a los podocitos inmortalizados en términos de procesos alimenticios de podocitos y expresión del marcador específico de podocitos. Los podocitos son células terminalmente diferenciadas.Por lo tanto, estas células ya no proliferan y el análisis primario de podocitos en cultivo celular es limitado. A pesar de que el problema del número limitado de células se superó mediante el uso de podocitos inmortalizados condicionalmente, estos podocitos presentan un fenotipo y un comportamiento desdiferenciados, lo que cuestiona su uso en la investigación básica. Con la ayuda de células madre pluripotentes inducidas, los podocitos se pueden generar in vitro en un número de células casi ilimitado con una morfología típica de podocitos que incluye distintos procesos alimentarios y expresión de marcadores específicos de podocitos.Cuando se utilizan las células madre específicas del paciente para diferenciarse en podocitos, es posible estudiar las alteraciones específicas de la enfermedad de la célula ex vivo. En caso de que la biopsia de piel inicial se tomara de un paciente con una enfermedad genética podocitos. Los podocitos generados con nuestro protocolo son células enfermas personalizadas portadoras de la mutación del paciente.Por lo tanto, estas células representan un modelo ex vivo mejorado para estudiar enfermedades podocíticas y posibles sustancias terapéuticas en un enfoque individualizado.

generation-of-patient-derived-podocytes-from-skin-biopsies

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

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Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

Aquí se presenta un protocolo definido químicamente para la derivación de podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas con alta eficiencia (&gt;90%) e independiente de manipulaciones genéticas o selección de subpoblaciones. Este protocolo produce el tipo de célula deseado dentro de los 26 días y podría ser útil para las pruebas de nefrotoxicidad y el modelado de enfermedades.

Diferenciación guiada de podocitos renales maduros de células madre pluripotentes inducidas por humanos en condiciones químicamente definidas

Aquí se presenta un protocolo para diseñar un sistema personalizado de órgano en un chip que recapitula la estructura y función de la barrera de filtración glomerular renal mediante la integración de células endoteliales epiteliales y vasculares genéticamente emparejadas diferenciadas de las células madre pluripotentes inducidas por humanos. Este sistema de bioingeniería puede avanzar en la medicina de precisión renal y aplicaciones relacionadas.

Chip de glomérulo renal isogénico diseñado a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Disociar las células de tipos específicos de tejido requiere de parámetros específicos para aggitation tejido para obtener un alto volumen de células viables, cultivables. El Miltenyi gentleMACS disociador optimiza esta tarea con un protocolo simple y práctico. En esta publicación, el uso de este aparato en el tejido nerual se explica.

Generación de un solo suspensiones de células de tejido de ratón Neural

Una forma rápida y robusta de aislar células viables de adultos epiteliales madre de la piel humana se describe. El método utiliza la digestión enzimática de la matriz de colágeno la piel, seguido por el punteo de los folículos pilosos y el aislamiento de las suspensiones de células individuales o fragmentos de tejido para el cultivo celular.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas epiteliales de la piel humana

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Las proteínas pueden adoptar una estructura nativa o plegarse erróneamente en amiloide insoluble. Las condiciones que favorecen la vía de plegamiento incorrecto conducen a la formación de diferentes tipos de fibrillas amiloides. Los métodos aquí descritos permiten la rápida conversión de proteínas nativas en amiloide in vitro.

Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

Aquí, se describe un protocolo basado en la reprogramación epigenética de células madre embrionarias humanas (hESCs) hacia la generación de una población homogénea de células progenitoras del músculo esquelético que bajo condiciones de cultivo permisivas formar grupos tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres), que recapitulan las características biológicas de la humana los músculos esqueléticos.

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

Aprende a generar podocitos derivados de pacientes mediante reprogramación episomal de fibroblastos dérmicos en células madre pluripotentes inducidas. Este método permite modelar enfermedades renales con células personalizadas.

Generación de podocitos derivados de pacientes a partir de biopsias de piel

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