Name: Reacción en cadena de la polimerasa e hibridación dot-blot para la detección de leptospira en muestras de agua (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Aprende a detectar ADN de Leptospira en muestras de agua mediante PCR e hibridación dot-blot con sondas marcadas con digoxigenina. Este método permite el monitoreo ambiental y la vigilancia de enfermedades zoonóticas.

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Estamos en deuda con la colección Leptospira del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México. Agradecemos la generosa donación de las cepas de referencia de Leptuspira ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge cepa BUT6 y Leptospira biflexa serovar Patoc cepa Patoc I al Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Agradecemos al Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, Coordinador del CIBAC, y al personal por su apoyo logístico. EDT se enmarcó en el programa Proyecto Terminal para estudiantes de pregrado de la Universidad Autónoma Metropolitana-Campus Cuajimalpa. Reconocemos el software Biorender.com para la creación de las figuras 1 y 3 a 9.

1. Preparación de la muestra
<ol><li>Concentrar cada muestra de agua en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL por centrifugación a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C. Repita este paso, tantas veces como sea necesario, para concentrar la muestra en un volumen de 250 μL.</li>
	<li>Utilice el kit de extracción de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).</li>
	<li>Realizar la PCR específica según la sonda dot-blot que se vaya a utilizar (Tabla 1).<ol><li>Realizar las amplificaciones en tubos de PCR con un volumen final de 25 μL que contenga 1 X tampón, 2,5 unidades de Taq polimerasa, 1 μM de cada cebador, 0,2 mM de cada dNTP, 1,5 mM de MgCl2 y 100 ng de ADN objetivo de cada muestra de agua o ADN genómico de referencia.</li>
		<li>Programe la reacción de PCR en un termociclador de acuerdo con las condiciones de termociclado (Tabla 2).</li>
		<li>Conservar las reacciones a 4 °C hasta su uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque 10 μL de cada producto de PCR que se va a secar en un pocillo separado de una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Añadir 40 μL de TE a cada pocillo y mezclar mediante pipeteo. NOTA: La placa de 96 pocillos se puede sellar y almacenar a 4 °C durante la noche. Siga las instrucciones proporcionadas en el Archivo Suplementario 6 para preparar búferes y soluciones para el protocolo. La figura 3 muestra los pasos de la preparación de la muestra.</li>
</ol>Tabla 2: Condiciones de termociclado de la PCR para los genes 16S, lipL41 y lipL32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_2_8th_PR_EMCC.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig03.jpg"> Figura 3: PCR y preparación de la muestra. Aplicando el protocolo específico de PCR, el producto de PCR se transfirió a una placa de microtitulación y se añadieron 40 μL de TE a cada pocillo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Montaje del aparato de mancha de puntos
NOTA: El montaje del aparato de punto y mancha se muestra en la Figura 4. Durante el procedimiento, use guantes para manipular las soluciones alcalinas y proteger la membrana de nailon de la contaminación.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig04.jpg"> Figura 4: Montaje del aparato de mancha de puntos. El papel de filtro y la membrana de nylon (previamente humedecida en 10 X SSPE) deben estar dispuestos en el orden correcto. El conjunto debe asegurarse firmemente con los tornillos antes de aplicar la aspiradora. Cada pocillo debe lavarse con TE, y los productos de PCR se cargan en sus respectivos pocillos. Después de transferir el producto de PCR a través de la membrana, cada pocillo se lava nuevamente con TE y se deja secar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>Corta la membrana de nylon (ver Tabla de Materiales) y el papel de filtro en hojas de 12 x 8,5 cm.</li>
	<li>Marque la membrana con un marcador permanente.</li>
	<li>Haz una muesca con unas tijeras en un borde para indicar la orientación correcta. Utilice la marca para recordar el pedido de la muestra.</li>
	<li>Humedecer la membrana y el papel de filtro con tampón 10 X Solución salina-fosfato sódico-EDTA (SSPE; 3 M de NaCl, 0,2 M de NaH2PO4 y 0,02 M de EDTA, pH 7,4) (Archivo suplementario 6). Manipule la membrana con una pinza limpia y de punta roma.</li>
	<li>Ensamble la cámara de manchas de puntos; Primero, el papel de filtro, seguido de la membrana sobre el sello de plástico. Asegure la cubierta con los tornillos en forma transversal.</li>
	<li>Conecte la cámara a la aspiradora, coloque 100 μL de TE en cada pocillo, mantenga la aspiradora durante 1 minuto y luego deténgala.</li>
	<li>Encienda el vacío a baja velocidad y cargue 50 μL de cada muestra en el pocillo correspondiente de la membrana del aparato dot-blot (siguiendo la distribución de membrana preestablecida). NOTA: Homogeneice cada muestra en la placa de hemaglutinación de 96 pocillos antes de colocarla en la cámara de transferencia de puntos.</li>
	<li>Deje que la aspiradora seque la membrana. Si es necesario, golpee suavemente la cámara para liberar las burbujas de la muestra.</li>
	<li>Lave cada pocillo colocando 100 μL de TE en él con un vacío continuo y dejando que se seque. NOTA: Después de completar la transferencia, es crucial apagar primero la bomba y desconectarla. De lo contrario, puede producirse la entrada de reflujo en el aparato. El ADN no necesita una etapa de desnaturalización si se utiliza una membrana de nailon cargada positivamente, pero si se utiliza otro soporte inerte, puede ser necesaria una etapa de predesnaturalización y una desnaturalización basada en álcalis41.</li>
</ol>3. Desnaturalización y fijación del ADN
NOTA: La figura 5 ilustra el procedimiento de fijación de la membrana del ADN.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig05v2.jpg"> Figura 5: Procedimiento de fijación ADN-membrana. El ADN se desnaturaliza en una solución alcalina. A continuación, se neutraliza con 10 X SSPE y se seca la membrana. A continuación, se transilumina la membrana. La membrana se rehidrata con 2 X SSPE y se prehibrida durante la noche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig05largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>Incubar la membrana con NaOH 0,4 M durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Equilibre la membrana con 10 X SSPE durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Secar la membrana a 80 °C durante 2 h.</li>
	<li>Transilumina con luz UV de 120 mJ durante 3 min. Asegúrese de que las muestras estén orientadas boca abajo hacia la fuente de luz UV. Si utiliza un reticulante UV, confirme que las muestras estén orientadas hacia arriba y repita este paso dos veces. NOTA: La membrana debe estar completamente seca antes de la reticulación UV. El ADN será inmovilizado por un enlace covalente a la membrana de nylon. Cada reticulación tarda aproximadamente 18'' a 1' con una dosis óptima de irradiación UV, para la mayoría de los experimentos de hibridación, de aproximadamente 0,6-0,8 kJ/m2. La exposición a la radiación UV es perjudicial para los ojos y la piel. Use el equipo de protección adecuado y evite la exposición a la piel desnuda.</li>
	<li>Lave la membrana con 2 X SSPE durante 10 min.</li>
	<li>Doble con cuidado la membrana e insértela en el tubo de hibridación (utilice un tubo de microcentrífuga de 15 ml).</li>
	<li>Añadir 10 mL de la solución de prehibridación (Ficha Suplementaria 6) al tubo e incubar a 42 °C durante la noche. Asegúrese de que el tubo esté correctamente sellado para evitar fugas.</li>
</ol>4. Hibridación
<ol><li>Retire 5 mL de la solución de prehibridación del tubo de hibridación. Para utilizar los 5 ml por segunda vez, guárdelo en otro tubo y guárdelo a -4 °C.</li>
	<li>Añadir 15 μL de la sonda marcada (Tabla 1) al tubo de hibridación. Enjuague la punta en la solución para asegurarse de que la sonda etiquetada se haya instilado completamente en la dilución. NOTA: La unión de la sonda de ADN no es tan fuerte como la unión antígeno-anticuerpo. Por lo tanto, los cambios en la concentración de la sonda o el ADN en la muestra pueden influir en la intensidad de la fluorescencia emitida. Las sondas de ADN son estequiométricas, lo que significa que el número de moléculas de sonda unidas al ADN es equivalente al número de moléculas de ADN presentes en la solución. La figura 6 muestra la hibridación de la sonda.</li>
	<li>Incubar a 42 °C durante la noche.</li>
	<li>Realice el etiquetado DIG de la sonda de ADN. Siga las instrucciones especificadas en la Tabla 3 para mezclar los reactivos, luego incube la mezcla a 37 °C durante 1 h. A continuación, añada 80 μL de agua destilada y guarde la sonda de cola a 4 °C.</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig06.jpg"> Figura 6: Hibridación de la sonda. Se ajusta el volumen del tampón de hibridación y se incorpora la sonda marcada con digoxigenina para permitir la hibridación de la sonda durante la noche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 3: Reactivos para el marcaje de sondas con digoxigenina (DIG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_3_EMCC_V4.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
5. Quimioluminiscencia (etiquetado anti-DIG)
<ol><li>Lave la membrana dos veces con 2 X SSPE/0.1% SDS a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
	<li>Incubar la membrana con 5 X SSPE/0,1% SDS a la temperatura de recocido de la sonda durante 15 min. NOTA: En este paso, use un recipiente con tapa para mantener la temperatura el mayor tiempo posible. Asegure una temperatura uniforme y constante en toda la membrana. El volumen aproximado en cada lavado es de 100 mL de la solución indicada.</li>
	<li>Lave la membrana una vez con el tampón 1 (Archivo suplementario 6) a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Lave la membrana una vez con el tampón 2 (Archivo suplementario 6) a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Lavar la membrana con tampón 2 y añadir el anticuerpo anti-digoxigenina (15 μL) (ver Tabla de Materiales), luego incubar durante 45 min (el tiempo de incubación puede variar de 30-60 min). Este anticuerpo secundario marca la sonda para su detección. NOTA: La membrana puede almacenarse en el tampón 2 con el anticuerpo anti-digoxigenina durante la noche a 4-8 °C. El marcaje anti-DIG del proceso de quimioluminiscencia se muestra en la Figura 7.</li>
</ol><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig07.jpg"> Figura 7: Marcaje anti-DIG del proceso de quimioluminiscencia. Los ácidos nucleicos no unidos se eliminan con soluciones tampón. La sonda se alinea con el ADN objetivo y se elimina el exceso. La membrana se bloquea con el tampón de bloqueo 1 X y se añade el anticuerpo anti-DIG (1:10000). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
6. Quimioluminiscencia (aplicación de sustrato)
<ol><li>Lave la membrana dos veces en el tampón 1 a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
	<li>Lave una vez en el tampón 3 (consulte la ficha complementaria 6) a temperatura ambiente durante 5 min, permitiendo que la membrana drene la mayor parte del tampón, dejándolo casi seco.</li>
	<li>Añadir CSPD listo para usar (3-(4-metoxispiro {1,2-dioxetano-3,2′-(5′-cloro) triciclo, [3.3.1.13,7] decan}-4-il) fenilo fosfato, ver Tabla de Materiales), y dejar reposar durante 5 min, (con los dedos humedecidos homogeneizar la CSPD de un lado a otro).</li>
	<li>Coloque la membrana en una bolsa de plástico transparente (12,5 x 9 cm) que se ajuste a la dimensión de la membrana. Retire con cuidado las burbujas de aire, distribuya uniformemente el CSPD y selle la bolsa con calor.</li>
	<li>Incubar la membrana en un baño de agua a 37 °C durante 15 min (puede ser hasta 30 min), y asegurarse de que la membrana con muestras esté colocada hacia abajo para que quede bien sumergida. Asegúrese de que la temperatura permanezca constante y bien distribuida sobre la membrana.</li>
	<li>Seque la bolsa de plástico y fíjela con cinta adhesiva sobre una película radiográfica ya usada. Esto permitirá un fácil manejo durante el procedimiento de exposición. NOTA: La Figura 8 muestra la aplicación del sustrato del proceso de quimioluminiscencia.</li>
</ol><img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig08v2.jpg"> Figura 8: Aplicación de sustrato del proceso de quimioluminiscencia. Se elimina el anticuerpo libre y se añade el sustrato CSPD (1:250) a la membrana. La reacción se activa por incubación a 37 °C y la membrana está dispuesta para registrar la quimioluminiscencia en una película de rayos X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig08largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
7. Quimioluminiscencia (detección)
<ol><li>Realice el procedimiento de exposición. En el cuarto oscuro, prepare las soluciones de revelador y fijador (consulte la Tabla de materiales) en las bandejas respectivas.</li>
	<li>En la oscuridad, coloque cuidadosamente la membrana fija frente a una nueva película radiográfica e insértela en un casete radiográfico (consulte la Tabla de Materiales).</li>
	<li>Registre el tiempo de exposición. El tiempo de exposición puede variar de 1 min a 30 min o más. Comience con 5 minutos y ajuste el tiempo en consecuencia.</li>
	<li>Humedecer la película de rayos X en solución reveladora durante 1-3 min y enjuagar suavemente con agua del grifo (15-45 s).</li>
	<li>Humedecer la película de rayos X en solución fijadora durante 1-3 min y enjuagar suavemente con agua del grifo (45 s).</li>
	<li>Deje que la película de rayos X se seque al aire y documente el ensayo en una caja de luz blanca visible. NOTA: Evite agitar la membrana durante el tiempo de exposición a los rayos X. El proceso de detección se muestra en la Figura 9.</li>
	<li>Proceda a la interpretación del resultado. En la película de rayos X expuesta, los puntos con emisión se pueden localizar visualmente y corresponden a los fragmentos de ADN con la hibridación de la sonda. La intensidad de la señal emitida depende de la luminiscencia y de la duración de la exposición. NOTA: Las membranas se pueden almacenar secas entre papel de filtro durante varios meses a temperatura ambiente.</li>
</ol><img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig09.jpg"> Figura 9: Detección del proceso de quimioluminiscencia. En condiciones de oscuridad, la membrana se expone a una película de rayos X dentro de un casete de rayos X. A continuación, se dejó reposar durante el tiempo de exposición, y luego se reveló y fijó la película de rayos X. Finalmente, se secó al aire y se interpretó. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
8. Procedimiento de deshibridación de membranas
<ol><li>Lave la membrana dos veces durante 10 minutos con agua destilada.</li>
	<li>Lavar la membrana durante 20 min con NaOH 0,4 M a 53 °C (dos veces).</li>
	<li>Lave dos veces la membrana durante 10 minutos con 2 X SSPE.</li>
	<li>Deje que la membrana se seque a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mantenga la membrana y vuelva al paso 3.5 del protocolo. NOTA: La membrana puede almacenarse en el tampón de prehibridación durante la noche a 4-8 °C. Al día siguiente, reiniciar con una incubación a 42 °C durante 1 h, permitiendo que el tampón de prehibridación alcance la temperatura. A continuación, continúe con el paso 3.5 del protocolo.</li>
</ol>

Ensayo de transferencia de puntos para la detección de ADN de Leptospira en muestras de agua

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses.

Los pasos críticos de la técnica de dot-blot incluyen (1) la inmovilización del ADN, (2) el bloqueo de los sitios de unión libres en la membrana con ADN no homólogo, (3) la complementariedad entre la sonda y el fragmento objetivo en condiciones de recocido, (4) la eliminación de la sonda no hibridada y (5) la detección de la molécula reportera41.
El PCR-Dot-blot tiene ciertas limitaciones, como que la técnica no proporciona información sobre el tamaño del fragmento37 hibridado, requiere la deshibridación de una sola membrana antes de la rehibridación con una segunda o tercera sonda, y requiere un tiempo y esfuerzo considerables para el resultado final.
Esta técnica ha demostrado consistencia con otras técnicas moleculares42,43 y sus aplicaciones. Se han empleado dot-blot inverso, nanogold dot-blot21 y dot-ELISA42 para la detección de genes específicos en organismos como Treponema44, Borrelia burgdorferi45, E. coli46, Helicobacter pylori47 y Mycobacterium tuberculosis48,49 basados en el ARNr 16S 29,43, y para la detección de ADN o ARN de plantas Virus41. El límite de detección (LOD), definido como la concentración más baja del microorganismo que puede medirse de forma coherente y fiable mediante esta técnica50, osciló entre 100 pg (5 x 104 bacterias) para H. pylori47, a una sola célula de B. burgdorferi en muestras clínicas45, y una fg, que es menor que una célula, de M. tuberculosis48,49.
Un aspecto valioso de esta metodología combinada es su capacidad para ampliar el límite de detección en un orden, superando los resultados falsos negativos debidos a dos condiciones de muestra que pueden conducir a resultados inconsistentes: (1) muestras con ADN insuficiente, o (2) contaminación de la muestra, lo que permite la detección del 100 % de muestras positivas 25,45,47,48,49. El PCR-Dot-blot tiene la capacidad de detectar cantidades de productos amplificados inferiores a las que se pueden detectar en la electroforesis en gel de agarosa, y evita la contaminación como consecuencia de las segundas etapas de amplificación, como en la PCR anidada y semi-anidada. Estas ventajas son particularmente críticas cuando se trabaja con muestras ambientales que contienen una carga bacteriana baja, que pueden contener una gama más amplia de inhibidores y ADN de fuentes no relacionadas que pueden interferir con las técnicas moleculares.
Trabajos previos sugieren que las leptospiras pueden ser identificadas por sondas de ADN marcadas con fotobiotina, alcanzando un LOD de 5 pg (5 x 103 leptospiras)51. Las sondas marcadas con DIG detectan 0,1-1 pg (102 leptospiras), mientras que las sondas marcadas con 32P detectan 1-5 pg (750 a 1000 leptospiras)51, y las sondas marcadas con biotina detectan 5 pg (2500 leptospiras)52. Además, 32sondas marcadas con P para Leptospira saprofito alcanzaron un LOD de 1,95 ng y para Leptospira patógena, 3,9 ng53. En este estudio, se establecieron LODs similares para los tres clados. El LOD para las especies patógenas fue de aproximadamente 0,3 ng de ADN genómico (6-8 x 104 GEq) (Figura 11), y para las especies saprófitas e intermedias, se redujo a 0,1 ng (2 x 104 GEq). En particular, las investigaciones anteriores se llevaron a cabo utilizando cultivos puros de Leptospira 51 y sueros de hámsteres dorados infectados experimentalmente, con el objetivo de detectar Leptospirapatógeno 54,55 y aplicar la hibridación de ADN con 32P etiquetado como herramienta para la identificación y clasificación de Leptospira56. Estas sondas exhiben una alta especificidad y no muestran hibridación cruzada con ADN no homólogo de otros microorganismos 19,51,54,55,56,57, y pueden distinguir incluso entre especies estrechamente relacionadas como Leptonema57. Asimismo, en este trabajo no se observó hibridación con ADN no homólogo. A pesar de que las sondas no isotópicas no son tan sensibles como las sondas isotópicas58 u otras técnicas43, se puede esperar que la combinación PCR-Dot-blot permita aumentar hasta diez veces la sensibilidad en comparación con otras técnicas basadas en PCR, como se observa en la detección de Leishmania y del herpesvirus bovino 4 (BHV4)24,26.
Por otro lado, el ensayo dot-blot para la identificación de Leptospira se ha empleado con mayor frecuencia con anticuerpos, y últimamente con anticuerpos monoclonales como alternativa para el diagnóstico de humanos y animales en muestras de orina 59,60,61,62. En estos estudios, la muestra se procesa directamente en la membrana sin pasos previos, y los anticuerpos se dirigen a proteínas de superficie específicas de Leptospira asociadas con la patogénesis. Mab-Dot-blot ELISA, por ejemplo, muestra una alta sensibilidad y especificidad, detectando tan solo 1 μg de homogeneizado bacteriano62. Los resultados obtenidos del ensayo Mab-Dot-blot pueden ser comparables a los ensayos de PCR, que suelen tener un LOD de alrededor de 103 leptospiras/ml de orina o 9,3 ng de homogeneizado de Leptospira 63. La cantidad de ADN genómico que puede ser amplificado por PCR es de 100 células (500 fg de ADN)61. Estos estudios previos utilizaron cultivos puros o muestras clínicas sin procedimientos de enriquecimiento y se orientaron hacia un mejor diagnóstico. Dado que las ratas infectadas pueden excretar hasta 107 leptospiras/mL de orina64, y los perros pueden excretar entre 102 y 106 leptospiras/mL de orina65, sirviendo como fuentes de contaminación para los cuerpos de agua, las muestras ambientales requieren un enriquecimiento de leptoespirales. La amplificación in vitro por PCR del ADN objetivo antes de la transferencia permite una mejora en la sensibilidad del procedimiento de hasta diez veces52,55. Por lo general, el producto amplificado por una PCR de punto final no se visualizaría en una electroforesis en gel de agarosa; sin embargo, se hace evidente a través de la hibridación específica de la sonda marcada con DIG en el dot-blot.
Si bien gran parte de la investigación sobre Leptospira y leptospirosis se ha centrado en el diagnóstico de enfermedades, se sabe poco sobre su ecología en los cuerpos de agua y su distribución dentro de ellos. La técnica PCR-Dot-blot se suma a la caja de herramientas para el estudio de Leptospira y leptospirosis, ofreciendo la ventaja de examinar un gran número de muestras y acelerar los resultados y la interpretación. PCR-Dot-blot es una técnica relativamente de bajo costo, simple y no radiactiva que puede acomodar múltiples sondas en una sola membrana. Además, elimina la necesidad de equipos sofisticados y flujos de trabajo complejos, lo que puede ser un desafío en entornos con recursos limitados.
El impacto de este estudio radica en su futura aplicación para estudiar grandes masas de agua a diferentes profundidades, así como otros nichos ecológicos y tipos de muestras, incluyendo suelo, agua estancada, heces, sangre y tejidos.
En conclusión, este trabajo demuestra la aplicación de la técnica PCR-Dot-blot, basada en el marcaje con digoxigenina de sondas de ADN para la identificación de los tres clados dentro del género Leptospira. Este método agiliza el proceso de identificación al reducirlo a un solo paso de amplificación y permite tres hibridaciones simultáneas o tres hibridaciones consecutivas utilizando una sola membrana. Los límites de detección alcanzados con esta técnica son similares a los alcanzados con las sondas radiactivas53, lo que la convierte en una herramienta valiosa para identificar Leptospira en muestras de agua de fuentes naturales. En consecuencia, esta técnica ofrece una mayor sensibilidad y proporciona resultados precisos y consistentes al evaluar muestras con cantidades mínimas de ADN bacteriano. Sirve como un enfoque alternativo para estudiar la dinámica de Leptospira en cuerpos de agua y puede ayudar a la evaluación y vigilancia de muestras ambientales más amplias, ayudando en la implementación de medidas preventivas contra la transmisión de este microorganismo.
En caso de dificultades con la técnica, tenga en cuenta los siguientes aspectos destacados de la solución de problemas: (1) Si los puntos tienen formas irregulares, verifique que el sistema de vacío esté bien cerrado transversalmente y luego repita la transferencia. (2) En caso de que el tubo de hibridación se rompa durante el procedimiento nocturno, lo que hace que la membrana pierda el tampón de hibridación, consulte la sección "Procedimiento de deshibridación" y reinicie el proceso. (3) Si no hay puntos visibles, no deseche la membrana; Continúe con la sección "Procedimiento de deshibridación" para repetir los pasos de hibridación. (3) Si se observan áreas blancas desiguales en la película de rayos X revelada, asegúrese de que no queden burbujas de aire atrapadas durante el proceso de sellado de la bolsa. (5) Si se observan áreas negras desiguales en la película de rayos X revelada, confirme que la CSPD se ha distribuido completamente utilizando los dedos humedecidos. (6) Si la película de rayos X muestra sombras de los puntos, asegúrese de que la película no se mueva durante el tiempo de exposición.

La leptospirosis en humanos se origina principalmente en fuentes ambientales 1,2. La presencia de Leptospira en lagos, ríos y arroyos es un indicador de transmisión de leptospirosis entre la fauna silvestre y los animales domésticos y de producción que eventualmente pueden entrar en contacto con estos cuerpos de agua 1,3,4. Además, se ha identificado Leptospira en fuentes no naturales, como aguas residuales, estancadas y del grifo 5,6.
Leptospira es una bacteria distribuida en todo el mundo 7,8, y el papel del medio ambiente en su preservación y transmisión ha sido bien reconocido. Leptospira puede sobrevivir en agua potable bajo pH variable y minerales9, y en cuerpos de agua naturales1. También puede sobrevivir por largos períodos en agua destilada10, y bajo pH constante (7.8), puede sobrevivir hasta 152 días11. Además, Leptospira puede interactuar en consorcios bacterianos para sobrevivir a condiciones adversas12,13. Puede formar parte de biofilms en agua dulce con Azospirillum y Sphingomonas e incluso es capaz de crecer y soportar temperaturas superiores a los 49 °C14,15. También puede multiplicarse en suelos anegados y permanecer viable hasta 379 días16, conservando su capacidad de causar la enfermedad hasta por un año17,18. Sin embargo, se sabe poco sobre la ecología dentro de los cuerpos de agua y cómo se distribuye dentro de ellos.
Desde su descubrimiento, el estudio del género Leptospira se basó en pruebas serológicas. No fue hasta el siglo actual cuando las técnicas moleculares se generalizaron en el estudio de esta espiroqueta. El dot-blot ha sido escasamente utilizado para su identificación utilizando (1) una sonda isotópica basada en el ARNr 16S y en una repetición de secuencia inter-simple (ISSR)19,20, (2) como un inmunoensayo basado en nanooro para la leptospirosis humana aplicada a la orina21, o (3) como un ensayo basado en anticuerpos para muestras de orina bovina22. La técnica cayó en desuso porque originalmente se basaba en sondas isotópicas. Sin embargo, es una técnica bien conocida que, junto con la PCR, produce mejores resultados, y se considera segura debido al uso de sondas no isotópicas. La PCR desempeña un papel crucial en el enriquecimiento del ADN de Leptospira al amplificar un fragmento de ADN específico que se puede encontrar en trazas en una muestra. Durante cada ciclo de PCR, la cantidad del fragmento de ADN objetivo se duplica en la reacción. Al final de la reacción, el amplicón se ha multiplicado por un factor de más de un millón23. El producto amplificado por PCR, a menudo no visible en la electroforesis de agarosa, se hace visible a través de la hibridación específica con una sonda marcada con DIG en el dot-blot 24,25,26.
La técnica de dot-blot es sencilla, robusta y adecuada para numerosas muestras, lo que la hace accesible a laboratorios con recursos limitados. Se ha empleado en una variedad de estudios de bacterias, incluyendo (1) bacterias orales27, (2) otros tipos de muestras como alimentos y heces28, y (3) la identificación de bacterias no cultivables29, a menudo de acuerdo con otras técnicas moleculares. Entre las ventajas que ofrece la técnica de dot-blot se encuentran: (1) La membrana tiene una alta capacidad de unión, capaz de unir más de 200 μg/cm2 de ácidos nucleicos y hasta 400 μg/cm2; (2) Los resultados de la mancha se pueden interpretar visualmente sin necesidad de equipo especial, y (3) se pueden almacenar convenientemente durante años a temperatura ambiente (RT).
El género Leptospira ha sido clasificado en clados patógenos, intermedios y saprófitos30,31. La distinción entre estos clados se puede lograr en función de genes específicos como lipL41, lipL32 y el ARNr 16S. LipL32 está presente en los clados patógenos y exhibe una alta sensibilidad en diversas herramientas serológicas y moleculares, mientras que está ausente en las especies de saprófitos21. El gen de mantenimiento lipL41 es conocido por su expresión estable y se utiliza en técnicas moleculares32, mientras que el gen 16S rRNA se utiliza para su clasificación.
Esta metodología se puede aplicar a grandes volúmenes de agua una vez que se han concentrado por centrifugación. Permite la evaluación de diversos puntos y profundidades dentro de un cuerpo de agua para detectar la presencia de ADN leptoespiral y el clado al que pertenece. Esta herramienta es valiosa tanto para fines ecológicos como para fines generales de detección y también se puede emplear para detectar otras bacterias no cultivables que pueden estar presentes en el agua.
Además, los ensayos de PCR y dot-blot son técnica y económicamente asequibles para una amplia gama de laboratorios, incluso para aquellos que carecen de equipos sofisticados o costosos. Este estudio tiene como objetivo aplicar el dot-blot basado en digoxigenina para la identificación de los tres clados de Leptospira en muestras de agua recolectadas de cuerpos de agua naturales.
Cepas bacterianas Se incluyeron en este estudio doce serovares de Leptospira (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi y Wolffi). Estos serovares forman parte de la colección del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Autónoma de México, y actualmente se utilizan en el ensayo de microaglutinación (MAT).
Todos los serovares de Leptospira se cultivaron en EMJH y su ADN se extrajo utilizando un kit comercial de extracción de ADN (ver Tabla de Materiales). Se utilizó una mezcla de ADN genómico de los doce serovares como control positivo para el clado patógeno de Leptostpira . Como control positivo del clado intermedio de Leptospira , se incluyó ADN genómico de Leptospira fainei serovar cepa BUT6 de Hurstbridge, y como control positivo para el clado de saprófitos de Leptospira , también se incluyó ADN genómico de Leptospira biflexa serovar cepa Patoc Patoc I.
Los controles negativos consistieron en un plásmido vacío, ADN de bacterias no relacionadas (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii y Escherichia coli) y agua de grado PCR, que sirvió como control no molde.
Muestras de agua Se recolectaron doce muestras de prueba utilizando un método de muestreo estratificado-aleatorio del Centro de Investigación Biológica y Acuícola de Cuemanco (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Estas muestras se obtuvieron a tres profundidades: superficial, 10 y 30 cm (Figura 1A, B). Los procedimientos de recolección de agua no afectaron a ninguna especie en peligro de extinción o protegida. Cada muestra se recogió en un tubo de microcentrífuga estéril de 15 mL. Para recolectar la muestra, cada tubo se sumergió suavemente en el agua, se llenó a la profundidad seleccionada y luego se selló. Las muestras se mantuvieron a 22 °C y se transportaron rápidamente al laboratorio para su procesamiento.
Cada muestra se concentró por centrifugación en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL a 8000 x g durante 20 min a temperatura ambiente. Este paso se repitió hasta que todas las muestras se concentraron en un tubo, que luego se utilizó para la extracción de ADN (Figura 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig01v2.jpg"> Figura 1: Concentración de muestras de agua por centrifugación. (A) Estanques de muestreo de agua, y (B) Arroyos naturales. (C) Procesamiento de muestras de agua basado en centrifugación en pasos repetidos tantas veces como sea necesario (n). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Extracción de ADN El ADN total se aisló utilizando un kit comercial de ADN genómico de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Las extracciones de ADN se eluyeron en 20 μL de tampón de elución, y la concentración de ADN se determinó mediante un espectrofotómetro UV a 260-280 nm, y se almacenó a 4 °C hasta su uso.
Amplificación por PCR Los objetivos de PCR fueron los genes 16S rRNA, lipL41 y lipL32, que identifican el ADN del género Leptospira y permiten distinguir entre los tres clados: patógeno, saprófito e intermedio. Tanto los cebadores como los diseños de las sondas se basaron en los trabajos previos de Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. y Branger et al.33,34,35,36,37. La secuencia de cada sonda, cebador y fragmento amplificado se describe en la Tabla 1, y su alineación con las secuencias de referencia se proporciona en el Archivo Suplementario 1, el Archivo Suplementario 2, el Archivo Suplementario 3, el Archivo Suplementario 4 y el Archivo Suplementario 5. Los reactivos de PCR y las condiciones de termociclado se describen en la sección de protocolo.
Los productos de amplificación se visualizaron por separación electroforética en un gel de agarosa al 1% en TAE (40 mM de base Tris, 20 mM de ácido acético y 1 mM de EDTA; pH 8,3), a 60 V durante 45 min con detección de bromuro de etidio, como se muestra en la Figura suplementaria 1. El ADN genómico obtenido de cada serovar se utilizó con concentraciones que oscilaron entre 6 x 106 y 1 x 104 copias genómicas equivalentes (GEq) en cada reacción de PCR, basándose en el tamaño del genoma de L. interrogans (4, 691, 184 pb)38 para Leptospira patógena, el tamaño del genoma de L. biflexa (3, 956, 088 pb)39 para Leptospira saprófita, y el tamaño del genoma de L. fainei serovar Hurstbridge cepa BUT6 (4, 267, 324 pb) con número de acceso AKWZ00000000.2.
La sensibilidad de las sondas se evaluó con ADN de cada serovar patógeno, L. biflexa serovar, cepa Patoc I, y L. fainei serovar, cepa BUT6 de Hurstbridge. Para evaluar la especificidad del ensayo de PCR e hibridación dot-blot, se incluyó ADN de bacterias no relacionadas.
Tabla 1: Cebadores y sondas de PCR para amplificar productos para la identificación de los clados patógenos, saprófitos e intermedios de Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_1_%207th_PR_%20EMCC.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Ensayo de hibridación dot-blot La técnica se denomina dot-blot porque los orificios en los que se coloca la muestra de ADN tienen forma de punto, y cuando se succionan para ser fijados en su lugar por succión al vacío, adquieren esta forma. Esta técnica fue desarrollada por Kafatos et al.40. La técnica permite la semicuantificación de Leptospira en cada muestra PCR positiva. El protocolo consiste en una desnaturalización con NaOH 0,4 M a temperatura ambiente, muestras con ADN de Leptospira de 30 ng a 0,05 ng, correspondientes a 6 x 106 a 1 x 104 leptospiras, se secan en una membrana de nailon con un aparato de puntos de 96 pocillos. Después de la inmovilización, el ADN se une a la membrana mediante la exposición a 120 mJ de luz ultravioleta. Cada sonda de ADN se conjuga con digoxigenina-11 dUTP mediante una etapa de catálisis de transferasa terminal en el extremo 3' (la digoxigenina es un esteroide vegetal obtenido de Digitalis purpurea, utilizado como reportero41). Tras la hibridación rigurosa de la sonda de ADN marcada (50 pmol) a la temperatura específica en el ADN objetivo, los híbridos de ADN se visualizan mediante la reacción de quimioluminiscencia con el anticuerpo anti-digoxigenina fosfatasa alcalina conjugado covalentemente con su sustrato CSPD. La luminiscencia se captura mediante la exposición a una película de rayos X (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig02v2.jpg"> Figura 2: Pasos del procedimiento para el ensayo PCR-dot-blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td><REACTIVOS fuertes</FUERTES></td><td></td><td></td><td></td></tr>Kit extracción de <tr><td>ADN</td><td>Purelink Invitrogen</td><td>K182002</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq Flexi DNA Polimerase (kit de polimerasa PCR Taq de punto final)</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr> Papel >de <tr><td>filtro Whatman, grado 1,</td> <td>Membranas de</td> nailon <td>WHA1001325</td><td></td>Merk</tr><tr><td>, cargado positivamente Rollo 30cm x 3 m</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11417240001</tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-AP, Fragmentos Fab Policlonal de oveja Anticuerpo primario</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Base media EMJH</td><td>Difco S1368JAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enriquecimiento de Leptospira EMJH</td><td>Difco</td><td>BD 279510</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo bloqueante</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>CSPD listo para usar 3-(4-metoxispiro {1,2-dioxetano-3,2&prime;-(5&prime;-cloro) triciclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-il) fosfato de fenilo</td><td>Merk</td><td>11755633001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido desoxirribonucleico de esperma de arenque</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3159</td><td></td></tr><tr><td>Desarrollador Carestream</td><td>Carestream Health Inc</td><td>GBX5158621</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-ddUTP</td><td>Roche</td><td>11363905910</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Sal disódica (dihidratada)</td><td>Promega</td><td>H5032</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Fixer Carestream</td><td>Carestream Health Inc</td><td>GBX 5158605</td><td></td></tr><tr><td>Lauril sulfato Sal de sodio (Dodecil sulfato de sodio; SDS) C12H2504SNa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5750</td><td></td></tr><tr><td>N- Lauroilsarcosina sodio sal CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L-9150</td><td>Es un tensioactivo aniónico</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona (PVP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol Monolaurato de sorbitán (Tween 20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Transferasa terminal, recombinante</td><td>Roche</td><td>3289869103</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de Tris (Tris HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>SSPE 20X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2015-1L</td><td>Se puede hacer en casa siguiendo el Archivo complementario 6</td></tr><tr><td>Imprimaciones</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A pedido</td><td>Seguir la tabla 1</td></tr><tr><td>Sondas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A pedido</td><td>Seguir la tabla 1</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop&trade; Un espectrofotómetro</td><td>Thermo-Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada Sigma 1-14K, apto para la centrifugación de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 14.000 rpm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1-14K</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas ajustables desinfectadas, gama 2-20 y micro; l, 20-200 y micro; l</td><td>Gilson</td><td>SKU:F167360</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga desechables de 1,5 ml (esterilizados en autoclave)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-SP</td><td></td></tr><tr><td>Desechables 600 y micro; l tubos de microcentrífuga (esterilizados en autoclave)</td><td>Axygen</td><td>3208</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta desechables 1-10 y micro; l</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta desechables 1-200 y micro; l</td><td>Axygen</td><td>TR-222-Y</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de transferencia de puntos Bio-Dot</td><td>BIORAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Hergom portátil Succión</td><td>Hergom</td><td>7E-A</td><td></td></tr><tr><td>Caja de luz científica (luz visible PH90-115V)</td><td>Hoefer</td><td>PH90-115V</td><td></td></tr><tr><td>Reticulante UV</td><td>Hoefer UV</td><td>UVC-500</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Hybaid PCR Express Termociclador</td><td>Hybaid</td><td></td><td></td>HBPX110</tr><tr><td>Casete radiográfico con placa IP14 x 17</td><td>Fuji</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

reacción en cadena de la polimerasa e hibridación dot-blot para la detección de leptospira en muestras de agua

Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples

El dot-blot es una técnica sencilla, rápida, sensible y versátil que permite la identificación de cantidades mínimas de ADN específicamente objetivo de la hibridación de sonda en presencia de ADN portador. Se basa en la transferencia de una cantidad conocida de ADN a un soporte sólido inerte, como una membrana de nailon, utilizando el aparato de mancha y sin separación electroforética. Las membranas de nailon tienen la ventaja de una alta capacidad de unión a ácidos nucleicos (400 μg / cm2), alta resistencia y están cargadas positiva o neutramente. La sonda utilizada es un fragmento de ssDNA altamente específico de 18 a 20 bases de largo marcadas con digoxigenina (DIG). La sonda se conjugará con el ADN de Leptospira . Una vez que la sonda se ha hibridado con el ADN objetivo, es detectada por un anticuerpo anti-digoxigenina, lo que permite su fácil detección a través de sus emisiones reveladas en una película de rayos X. Los puntos con una emisión corresponderán a los fragmentos de ADN de interés. Este método emplea el marcaje no isotópico de la sonda, que puede tener una vida media muy larga. El inconveniente de este marcador inmunológico estándar es una menor sensibilidad que las sondas isotópicas. Sin embargo, se mitiga mediante el acoplamiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los ensayos de dot-blot. Este enfoque permite el enriquecimiento de la secuencia objetivo y su detección. Además, se puede utilizar como una aplicación cuantitativa cuando se compara con una dilución en serie de un patrón conocido. Aquí se presenta una aplicación de mancha de puntos para detectar Leptospira de los tres clados principales en muestras de agua. Esta metodología se puede aplicar a grandes cantidades de agua una vez que se han concentrado por centrifugación para proporcionar evidencia de la presencia de ADN de Leptospiral. Se trata de una herramienta valiosa y satisfactoria para fines generales de cribado, y puede utilizarse para otras bacterias no cultivables que puedan estar presentes en el agua, mejorando la comprensión del ecosistema.

Para evaluar la efectividad de la técnica, se utilizó ADN genómico de cultivos puros de cada Leptospira serovar, junto con la sonda específica del clado. Las membranas se prepararon con 100 ng de ADN genómico por reacción de PCR para cada serovar, seguido de ocho ADN genómico de bacterias no relacionadas y concentraciones variables de ADN genómico de los serovares ad hoc de Leptospira. Cada ensayo incluyó control positivo, negativo y no especial. Este ADN genómico no relacionado no mostró afinidad por las sondas dot-blot. La distribución de membranas y las membranas de transferencia de puntos se muestran en la Figura complementaria 2, la Figura complementaria 3, la Figura complementaria 4, la figura complementaria 5, la figura complementaria 6, la figura complementaria 7. Con respecto al clado de saprófitos, utilizando el DB_Saproprobe con el producto de PCR de 1059 pb amplificado con cebadores DB_16SPathoREV y DB_16SPathoFWD, y el producto de PCR de 517 pb amplificado con cebadores DB_16SSapREV y DB_16SSapFWD con ADN genómico de Leptospira biflexa serovar Patoc cepa Patoc I, fue posible detectar entre 0,05 y 0,1 ng de ADN de saprófito (Figura Suplementaria 2 y Figura Suplementaria 3). Asimismo, para la detección del clado intermedio, utilizando el DB_Interprobe con el producto de PCR de 1059 pb amplificado con cebadores DB_16SPathoREV y DB_16SPathoFWD, y el producto de PCR de 299-301 pb amplificado con los cebadores DB_16SInterREV y DB_16SInterFWD con ADN genómico de Leptospira fainei serovar Hurstbridge cepa BUT6 (Figura suplementaria 4 y Figura suplementaria 5), fue posible detectar alrededor de 0,1 ng del ADN intermedio. De manera similar, para el clado patógeno que utiliza la DB_16SPathoprobe con el producto de PCR de 1059 pb amplificado por cebadores DB_16SPathoREV y DB_16SPathoFWD, o la sonda DBlipL41 con el producto de PCR de 479 pb amplificado por cebadores DB_lipL41REV y DB_lipL41FWD con mezcla de ADN genómico de serovares patógenos de Leptospira, fue posible detectar concentraciones de ADN que oscilaron entre 0,3 y 0,6 ng de ADN patógeno (Figura suplementaria 6 y Figura suplementaria 7).
Los ensayos diseñados para identificar los tres clados se pueden utilizar individualmente para cada clado. Sin embargo, en el caso de muestras valiosas y escasas, se puede preparar una sola membrana con cebadores DB_16S PathoREVyDB_16 SPathoFWD, que amplifican un producto de 1058-1069 pb. A continuación, este producto se puede hibridar con el DB_Interprobe, el DB_Saproprobe y el DB_16SPathoprobe individualmente, con la etapa de deshibridación (paso 8) antes de cada uno de ellos. Este enfoque permite la identificación de todos los clados de la misma membrana.
En las muestras de agua de campo se aplicó el protocolo de sonda lipL32. El ADN de cada muestra de agua se utilizó a una concentración de 100 ng por reacción de PCR. Además, se incluyó un protocolo de control de extracción de ADN, que consistió en inyectar 100 ng de ADN genómico de Leptospira en una muestra de agua destilada de 15 mL. También se incluyeron controles negativos y positivos (Figura 10).
Tabla 4: Descripción y profundidad de las muestras de agua. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/TABLE_4_EMCC_R2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig10.jpg"> Figura 10: Ensayo de transferencia de puntos de cada muestra de agua. (A) Distribución de la membrana y (B) transferencia de puntos de la DB_lipL32probe y el producto (262 pb) de los cebadores DB_lipL32REV y DB_lipL32FWD de las muestras de agua de campo. La superficie del estanque 3 muestra un resultado positivo, y tanto el control del protocolo de extracción como los controles positivos tienen una señal intensa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La descripción de la muestra de agua se muestra en la Tabla 4, y la distribución y la imagen de la membrana de punto y transferencia se muestran en la Figura 9. El punto A7 muestra que el ADN de Leptospiral estaba presente en la superficie del estanque 3. Con el fin de determinar la concentración de ADN que estaba presente en el estanque 3, se realizó un ensayo de transferencia de puntos con concentraciones de ADN conocidas de una mezcla de serovares de Leptospira y la sonda lipL32 (Figura 11). La membrana se preparó con ADN genómico distribuido de 100 ng a 1 x 10-13 ng en cada punto. La concentración mínima que se puede detectar sin duda fue de aproximadamente 0,3 ng, correspondiente a 6 x 105 GEq en las muestras de agua.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65435/65435fig11.jpg"> Figura 11: Ensayo de transferencia de puntos con concentraciones de ADN conocidas de una mezcla de serovares de Leptospira y la sonda lipL32. (A) Distribución de la membrana y (B) transferencia de puntos de la DB_lipL32probe y el producto (262 pb) de cebadores DB_lipL32REV y DB_lipL32FWD con diluciones (1:2) de una mezcla de ADN genómico de serovares patógenos de Leptospira . La señal de la sonda se puede detectar fácilmente hasta 3,91 x 10-1 ng de mezcla de ADN de Leptospira . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/65435fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Productos de amplificación por PCR visualizados por separación electroforética. Carril 1. Marcador de peso molecular 100 pb Escalera de ADN. Carril 2. PCR basada en el gen lipL32 con mezcla de ADN patógeno de Leptospira como plantilla; Carril 3. PCR basada en el gen lipL41 con una mezcla de ADN patógeno de Leptospira como plantilla; Carril 4. PCR basada en el gen 16S rRNA con mezcla de ADN patógeno de Leptospira como plantilla; Carril 5. PCR basada en el gen 16S rRNA con cebadores DB_16SSapREV y DB_16SSapFWD, y Leptospira biflexa serovar Patoc cepa Patoc I DNA como plantilla; Carril 6. PCR basada en el gen 16S rRNA con cebadores DB_16SPathoREV y DB_16SPathoFWD, y Leptospira biflexa serovar Patoc cepa Patoc I DNA como plantilla; Carril 7. PCR basada en el gen 16S rRNA con cebadores DB_16SInterREV y DB_16SInterFWD, y Leptospira fainei, serovar Hurstbridge cepa BUT6 DNA como plantilla; Carril 8. PCR basada en el gen 16S rRNA con cebadores DB_16SPathoREV y DB_16SPathoFWD, y Leptospira fainei, serovar Hurstbridge cepa BUT6 DNA como plantilla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/Supp%20FIGURE_1_EMCC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 2: (A) Distribución de la membrana y (B) dot-blot del DB_Saproprobe y el producto (1059 pb) de los cebadores DB_16SPathoREV y DB_16SPathoFWD del ADN genómico de Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/Supp%20FIGURE_2_EMCC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 3: (A) Distribución de la membrana y (B) dot-blot del DB_Saproprobe con el producto (517 pb) de los cebadores DB_16SSapREV y DB_16SSapFWD del ADN genómico de Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/Supp%20FIGURE_3_EMCC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 4: (A) Distribución de la membrana y (B) dot-blot del DB_Interprobe con el producto (1059 pb) de cebadores DB_16SPathoREV y DB_16SPathoFWD y ADN genómico de Leptospira fainei serovar Hurstbridge cepa BUT6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/Supp%20FIGURE_4_5th_PR_EMCC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 5: (A) Distribución de la membrana y B) dot-blot del DB_Interprobe y el producto (299-301 pb) de los cebadores DB_16SInterREV y DB_16SInterFWD con ADN genómico de Leptospira fainei serovar Hurstbridge cepa BUT6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/Supp%20FIGURE_5_EMCC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 6: (A) Distribución de la membrana y (B) dot-blot de laDB_16 S Pathoprobe y el producto (1059 pb) de los cebadores DB_16SPathoREV y DB_16SPathoFWD con mezcla de ADN genómico de serovares patógenos de Leptospira. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/Supp%20FIGURE_6_EMCC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 7: (A) Distribución de la membrana y (B) mancha de puntos de la DB_lipL41probe con el producto (479 pb) de cebadores DB_lipL41REV y DB_lipL41FWD con mezcla de ADN genómico de serovares patógenos de Leptospira . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/Supp%20FIGURE_7_EMCC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 1: Alineación de las especies de Leptospira saprófitas con los cebadores y la sonda basada en la secuencia de ARN ribosómico16 S . Los cebadores se resaltan en negrita y negro para su identificación, y su dirección se indica con flechas negras. La sonda se indica en negrita y resaltada en gris, y su posición está marcada con una línea gris. Las secuencias alineadas se resaltan en gris claro, mientras que las secuencias no correspondientes se resaltan en blanco y negro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/SUPPLEMENTARY_FILE_1_EMCC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: Alineación de especies intermedias de Leptospira con los cebadores y la sonda basada en la secuencia de ARN ribosómico16 S . Los cebadores se resaltan en negrita y negro para su identificación, y su dirección se indica con flechas negras. La sonda se indica en negrita y resaltada en gris, y su posición está marcada con una línea gris. Las secuencias alineadas están en gris claro, mientras que las secuencias no correspondientes se muestran en blanco y negro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/SUPPLEMENTARY_FILE_2_EMCC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: Alineación de especies patógenas de Leptospira con los cebadores y la sonda basada en la secuencia del gen lipL32. Los cebadores se resaltan en negrita y negro para su identificación, y su dirección se indica con flechas negras. La sonda se indica en negrita y resaltada en gris, y su posición está marcada con una línea gris. Las secuencias alineadas están en gris claro, mientras que las secuencias no correspondientes se muestran en blanco y negro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/SUPPLEMENTARY_FILE_3_6th_PR_EMCC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 4: Alineación de especies patógenas de Leptospira con los cebadores y la sonda basada en la secuencia del gen lipL41. Para su identificación, los cebadores están en negrita y resaltados en negro, con su dirección indicada por flechas negras. La sonda se indica en negrita y resaltada en gris oscuro, y su posición está marcada con una línea gris. Las secuencias alineadas están en gris claro, mientras que las secuencias no correspondientes están en blanco y negro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/SUPPLEMENTARY_FILE_4_EMCC_V4.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 5: Alineación de las especies de Leptospira con los cebadores dirigidos a la secuencia de ARN ribosómico16 S y las sondas para especies saprófitas, intermedias y patógenas. Para su identificación, los cebadores se indican en negrita y se resaltan en negro, con su dirección marcada con flechas negras. Las sondas se indican en negrita y resaltadas en gris, con sus posiciones representadas por líneas grises. Las secuencias alineadas están en gris claro y las secuencias no correspondientes están en blanco y negro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/SUPPLEMENTARY_FILE_5_EMCC_V4.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 6: Tampones y soluciones para el ensayo dot-blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65435/SUPPLEMENTARY_FILE_6_8th_PR_EMCC.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

En este estudio, se diseñó una aplicación de mancha de puntos para detectar Leptospira de los tres clados principales en muestras de agua. Este método permite la identificación de cantidades mínimas de ADN específicamente dirigidas por una sonda marcada con digoxigenina, fácilmente detectables por un anticuerpo anti-digoxigenina. Este enfoque es una herramienta valiosa y satisfactoria para fines de detección.

Reacción en cadena de la polimerasa e hibridación dot-blot para la detección de leptospira en muestras de agua

The dot-blot is a simple, fast, sensitive, and versatile technique that enables the identification of minimal quantities of DNA specifically targeted by ...

Este protocolo está diseñado para identificar la presencia de ADN de Leptospira en muestras de agua. Para este propósito se utiliza la técnica de mancha de puntos, que permite una detección y análisis precisos del ADN. El dot-blot es una técnica no isotópica fácil y versátil y puede ayudar a responder preguntas clave sobre la distribución ambiental de Leptospira.Este método tiene el potencial de evaluar grandes masas de agua y ayudar en la vigilancia de enfermedades.

polymerase-chain-reaction-dot-blot-hybridization-for-leptospira

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método de bajo costo, de alto rendimiento para la detección simultánea de hasta 43 blancos moleculares se describe. Las solicitudes de MPCR / RLB son la tipificación de microorganismos y la detección de múltiples patógenos de muestras clínicas.

Multiplex PCR y Blot Línea ensayo de hibridación reversa (MPCR / RLB)

Un método eficaz para evaluar la superficie de exposición de las proteínas de la leptospirosis se describe. El método está diseñado específicamente para evitar la interrupción de la frágil membrana externa de las células de leptospira. Esta técnica requiere el empleo de varios controles negativos para evaluar la integridad de la membrana externa y la especificidad de la reacción de los anticuerpos.

Inmunofluorescencia ensayo de leptospiras superficie expuesta proteínas

Este video muestra un silenciamiento génico basado en interferencias CRISPR en Leptospira patógena. La represión dirigida de la expresión génica mediante un sistema CRISPR/Cas que bloquea la formación de ARNm ayuda a identificar genes candidatos para estudios patológicos y farmacológicos.

Silenciamiento génico basado en interferencias CRISPR: una técnica para la represión dirigida de la función génica en leptospira patógena

PCR anidada es una técnica sensible, específica y directa que se puede aplicar a garrapata que extractos de ADN para sonda de burgdorferi de Borrelia, el agente causativo de la enfermedad de Lyme. El experimento inicial de PCR utiliza cartillas gene-específicas para generar amplicones de largo, que luego se convierten en plantillas para una posterior reacción usando cebadores internos.

Detectar el Spirochete de la enfermedad de Lyme, Burgdorferi de Borrelia, de garrapatas mediante PCR anidado

Corriente de multiplexado de diagnóstico para detectar los Zika, chikungunya y dengue virus requieren preparación compleja y costosa instrumentación y son difíciles de usar en entornos de bajos recursos. Se muestra un diagnóstico que utiliza amplificación isotérmica con sondas desplazable filamento blanco específico para detectar y diferenciar estos virus con alta sensibilidad y especificidad.

La amplificación isotérmica multiplexada basado en plataforma de diagnóstico para detectar Zika, Chikungunya y Dengue 1

Desarrollamos un método para detectar zoosporas phytophthora capsici en fuentes de agua utilizando un método de extracción de ADN de papel de filtro junto con un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que se puede analizar en el campo o en el laboratorio.

Detección de Phytophthora capsici en agua de riego mediante amplificación isotérmica mediada por bucle

Aquí, se describe la aplicación de la interferencia CRISPR (CRISPRi) para el silenciamiento de genes específicos en especies de Leptospira. Las células de leptospira se transforman por conjugación con plásmidos que expresan dCas9 (catalíticamente "muerto" Cas9) y un ARN de guía única (sgRNA), responsable del emparejamiento de bases a la diana genómica deseada. Se presentan métodos para validar el silenciamiento génico.

Aplicación de interferencia CRISPR (CRISPRi) para silenciamiento de genes en especies patógenas de Leptospira

Aunque los procariotas carecen de un sistema orgánular, hay regiones subcelulares con proteínas localizadas. El análisis cuantitativo y cualitativo de las enzimas y proteínas en las regiones subcelulares es importante para desarrollar objetivos farmacológicos y vacunales. Aquí, ilustramos el fraccionamiento subcelular de proteínas Leptospiral utilizando Triton X-114 y su análisis.

Enriquecimiento de proteínas subcelulares en Leptospira mediante un enfoque de fraccionamiento basado en Triton X-114

Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Se describe un protocolo método para el análisis de GC-basada de los derivados aldonitrile acetato de glucosamina y ácido murámico extraída del suelo. Para esclarecer el mecanismo químico, también presentan una estrategia para confirmar la estructura del derivado y los fragmentos de iones formados en la ionización de electrones.

GC-basado en la detección de ácido Aldononitrile acetato derivado de glucosamina y murámico de la determinación de residuos microbiana en el suelo

Aprende a detectar ADN de Leptospira en muestras de agua mediante PCR e hibridación dot-blot con sondas marcadas con digoxigenina. Este método permite el monitoreo ambiental y la vigilancia de enfermedades zoonóticas.

Reacción en cadena de la polimerasa e hibridación dot-blot para la detección de leptospira en muestras de agua

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