Name: Trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en un modelo de ratón con degeneración retiniana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprende el trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en ratones con degeneración retiniana. Este método permite una entrega precisa de células con baja tasa de complicaciones quirúrgicas.

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Este trabajo fue financiado por los siguientes fondos: NEI R01EY033103 (MSS), Fundación para la Lucha contra la Ceguera (MSS), Fundación Shulsky (MSS), Fondo Joseph Albert Hekimian (MSS), Fundación Juliette RP Visión (YVL), Investigación para Prevenir la Ceguera (subvención sin restricciones al Instituto Oftalmológico Wilmer de la Universidad Johns Hopkins y al Instituto Oftalmológico Cullen de la Facultad de Medicina Baylor). Agradecemos a la Dra. Malia Edwards (Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins) por brindar amablemente capacitación sobre el microscopio.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicaciones de los NIH No. 8023, revisada en 1978) y la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins (aprobación M021M459).
1. Animales
<ol><li>Utilizar ratones Rho::EGFP (de P3 a P6) como donantes de suspensiones de células de la retina. NOTA: Esta cepa fue un amable regalo del Dr. T. Wensel, Baylor College of Medicine.</li>
	<li>Utilizar ratones OPN1LW-EGFP/NRL-/- 14 (P3 de edad) como donantes de láminas de retina.</li>
	<li>Utilice ratones adultos Rd1/NS con degeneración de la retina con inmunodeficiencia (de ambos sexos) como receptores.</li>
	<li>Aloje a todos los ratones en jaulas bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h con acceso a agua y comida según sea necesario.</li>
</ol>2. Recoger la retina neural (Figura 1)
NOTA: Todos los pasos siguientes se realizaron en condiciones estériles. La información de los proveedores de las herramientas y productos de investigación se proporciona en la Tabla de Materiales.
<ol><li>Preparación de ratones donantes: Eutanasiar ratones donantes con una sobredosis de dióxido de carbono y confirmar la eutanasia con luxación cervical.</li>
	<li>Aísla los globos oculares de los ratones. Para ello, siga los pasos que se indican a continuación.<ol><li>Abra con cuidado los párpados de los cachorros con unas microtijeras para exponer el globo ocular.</li>
		<li>Use pinzas suaves para agarrar el nervio óptico y saque el globo ocular con un par de fórceps.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislar la retina neural NOTA: Este paso se realiza bajo un microscopio de disección.<ol><li>Haga una incisión en un orificio en el centro de la córnea con una aguja estéril de 25 G.</li>
		<li>Corte la córnea, a través del orificio, por la mitad y agrande la incisión hasta la esclerótica y el EPR, luego retire la esclerótica y el EPR.</li>
		<li>Use pinzas microdentadas para extraer suavemente el cristalino y el vítreo para aislar la retina neural.</li>
		<li>Continúe con la sección 3 para preparar la suspensión de retina del donante o la sección 4 para preparar la lámina de retina del donante, según sea necesario.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparar la suspensión retiniana del donante (Figura 1)
<ol><li>Incubar la retina neural en solución de papaína a 37 °C durante 20-30 min hasta que no se detecten grumos celulares. NOTA: Pipetee suavemente la mezcla de células 15 veces cada 10 minutos.</li>
	<li>Siga las instrucciones del fabricante del kit de disociación de papaína para recolectar células individuales.</li>
</ol>4. Preparar las láminas de retina del donante (Figura 1)
NOTA: Este paso sigue a la sección 2 y se realiza bajo un microscopio de disección.
<ol><li>Coloque la copa de retina neural aislada en una placa de Petri de 35 mm con PBS estéril preenfriado.</li>
	<li>Use microtijeras para cortar la copa neural de la retina en varias láminas de retina (alrededor de 1 mm x 2 mm).</li>
</ol>5. Preparar a los ratones receptores
<ol><li>Anestesiar a los ratones receptores con inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y clorhidrato de xilacina (20 mg/kg de peso corporal).</li>
	<li>Confirme el plano quirúrgico de la anestesia asegurando la pérdida del parpadeo y los reflejos de dolor, la respiración regular y la respiración.</li>
	<li>Evaluar la profundidad anestésica por la falta de respuesta al pellizco de la cola o a la retirada de los reflejos pedales.</li>
	<li>Siempre vuelva a verificar la profundidad anestésica durante el procedimiento quirúrgico y ajuste la profundidad anestésica si el animal responde al dolor. Mantenga a los ratones en la mesa de cirugía precalentada para evitar la hipotermia.</li>
	<li>Dilatar las pupilas receptoras con colirios de tropicamida al 1% (peso/vol) 5 minutos antes de la cirugía. Una pupila bien dilatada puede facilitar la visualización transpupilar bajo el microscopio quirúrgico.</li>
	<li>Desinfecte el ojo del ratón en operación y los tejidos oculares circundantes con povidona yodada, lávese con PBS esterilizado.</li>
	<li>Aplique clorhidrato de proparacaína al 0,5% en el ojo del ratón para la analgesia.</li>
</ol>6. Trasplante subretiniano de injertos retinianos (Figura 2)
NOTA: Todos los pasos siguientes se realizaron en condiciones asépticas. Las herramientas quirúrgicas se esterilizaron en autoclave (use bandejas de instrumentos para proteger las puntas de las herramientas y saque el émbolo de las microjeringas para evitar que se atasquen en el lumen). La información de los proveedores de las herramientas y productos de investigación se proporciona en la Tabla de Materiales.
<ol><li>Paracentesis de la cámara anterior: penetrar la córnea periférica en la cámara anterior con una aguja de insulina para permitir que el humor acuoso salga pasivamente, para evitar los picos de presión intraocular (PIO) durante el trasplante. NOTA: Una paracentesis exitosa está indicada por el flujo de humor acuoso a través del orificio de la córnea.</li>
	<li>Coloque una gota de hialuronato de sodio y un cubreobjetos de vidrio (5 mm de diámetro) sobre la córnea para permitir la visualización transpupilar del fondo de ojo bajo el endoscopio quirúrgico.</li>
	<li>Utilice pinzas dentadas para exponer el lugar de inyección (1 mm del limbo postcorneal) presionando la pared superior o inferior del ojo, según lo requiera el experimento, hacia el centro de la visión transpupilar.</li>
	<li>Utilice una aguja de microinyección para penetrar perpendicularmente en la esclerótica.</li>
	<li>Gire con cuidado la dirección de la aguja tangencialmente para permitir la penetración completa del complejo esclerótica-coroides-EPR en el espacio subretiniano.</li>
	<li>Inserte la aguja tangencialmente para acceder al lugar terminal de inyección. NOTA: Verifique la posición completa del bisel de la aguja guiando la visión transpupilar. Utilice los vasos retinianos superficiales como referencia anatómica para un posicionamiento preciso de la aguja dentro del espacio subretiniano.</li>
	<li>Inyectar injertos de retina NOTA: La presencia de pequeñas burbujas precargadas en la jeringa puede facilitar la validación del posicionamiento subretiniano preciso de las células del donante. La PIO elevada resultante de la inyección subretiniana aumenta el riesgo de reflujo de células del donante.<ol><li>Si la córnea se vuelve turbia24,25, un indicador de PIO alta, mantenga la aguja en el espacio subretiniano durante al menos 3 minutos hasta que la córnea se aclare, un indicador de que la PIO se ha reducido lo suficiente. NOTA: En casos raros, la PIO puede tardar más en normalizarse, y se recomienda mantener la aguja en su lugar hasta que se restablezca la claridad de la córnea, incluso si esto tomaría de 8 a 10 minutos. Observe bajo un microscopio quirúrgico para evitar daños en las estructuras de la retina.</li>
	</ol></li>
	<li>Sujete el borde del orificio de inyección con pinzas microdentadas y retire rápidamente la aguja. NOTA: Los criterios para el parto subretiniano exitoso de una suspensión y lámina de células retinianas son una ampolla constante y una lámina blanca visible en el espacio subretiniano, respectivamente.</li>
	<li>Limpie el área quirúrgica del ojo con lágrimas artificiales y aplique ungüento si es necesario.</li>
	<li>Administración postoperatoria<ol><li>Coloque a los ratones trasplantados en una jaula de recuperación limpia precalentada (37 °C) y vigile cuidadosamente si están angustiados.</li>
		<li>Aplique una gota de clorhidrato de proparacaína tópico al 0,5% en el ojo quirúrgico 2-3 veces si se produce malestar.</li>
		<li>Regrese a los ratones a la jaula de la casa después de que estén completamente alerta y móviles. Coloque una pequeña cantidad de gránulos de comida y una taza de gel en la jaula si los ratones tienen problemas para alcanzar la tolva de comida. NOTA: Mantenga la superficie del ojo húmeda hasta que desaparezca el efecto de la anestesia para evitar la formación de cataratas.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Imágenes de oftalmoscopia láser de barrido confocal multimodal (cSLO)
<ol><li>Dos meses después del trasplante, anestesiar a los ratones receptores Rd1/NS (n = 5) mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y clorhidrato de xilacina (20 mg/kg de peso corporal) para la obtención de imágenes.</li>
	<li>Dilatar las pupilas con gotas oftálmicas de tropicamida al 1% (peso/vol).</li>
	<li>Realice imágenes multimodales estándar de 55° utilizando el oftalmoscopio láser de barrido confocal cSLO system22.</li>
	<li>Obtenga imágenes de RM y SD-OCT utilizando 30 fotogramas de promedio ART.</li>
</ol>8. Tinción histológica
<ol><li>Prepare portaobjetos congelados de ojos de ratones Rd1/NS trasplantados como se informó anteriormente 14.</li>
	<li>Bloquee y penetre los portaobjetos congelados de retina trasplantada utilizando una mezcla de suero de cabra al 5% y Triton X100 al 1% en PBS.</li>
	<li>Incubar las muestras con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C y enjuagar en PBS (5 min, 3x). Los anticuerpos primarios incluyen anti-GFP-FITC de cabra (1:200), anti-recuperina de conejo (1:1000) y anti-S-opsina de conejo (1:500).</li>
	<li>Incubar las muestras con anticuerpo secundario (Cy3 anticonejo de cabra, 1:500) y contrateñirlas con DAPI. NOTA: Los proveedores de anticuerpos primarios y secundarios se enumeran en la Tabla de materiales.</li>
</ol>

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</ol>

MSS es/fue asesor remunerado de Revision Therapeutics, Johnson & Johnson, Third Rock Ventures, Bayer Healthcare, Novartis Pharmaceuticals, W. L. Gore & Associates, Deerfield, Trinity Partners, Kala Pharmaceuticals y Acucela. MSS recibe apoyo de investigación patrocinado por Bayer. Estos acuerdos han sido revisados y aprobados por la Universidad Johns Hopkins de acuerdo con sus políticas de conflicto de intereses. KVL es nombrado como inventor en las solicitudes de patentes de la Universidad de Colorado. MSS e YVL son nombrados como inventores en las solicitudes de patentes de la Universidad Johns Hopkins.

El trasplante subretiniano en ratones es técnicamente desafiante debido al pequeño tamaño de los ojos de los ratones. En este estudio, desarrollamos una plataforma simple y reproducible para el trasplante subretiniano en receptores de ratón. La plataforma permite la consistencia en la protección de la viabilidad del donante, el parto subretiniano exitoso y garantiza una baja tasa de complicaciones.
La técnica de trasplante subretiniano que se muestra aquí se desarrolló en base a la vía transescleral, donde la aguja de inyección penetra en las capas externas (complejo esclerótica-coroides-EPR) de la pared ocular. En comparación con el abordaje transcorneal19,20 y transvítreo21,26,27, el abordaje transescleral entra directamente en el espacio subretiniano sin penetrar en las estructuras del segmento anterior ni en la retina neural, lo que permite un trasplante inocuo y reduce el riesgo de reflujo de células del donante a través del orificio penetrante. Un desafío del enfoque transescleral es garantizar que la punta de la aguja se propague a lo largo del espacio subretiniano antes de llegar al sitio de entrega terminal, evitando al mismo tiempo la posible perturbación de las capas adyacentes de EPR y coroides. Es difícil alcanzar estos objetivos a través de un abordaje transescleral tradicional28,29 sin guía visual directa. En este estudio, desarrollamos una plataforma transpupilar guiada por la visión utilizando un microscopio quirúrgico e iluminación externa de la retina para facilitar el trasplante subretiniano en modelos de ratón. La plataforma permite al operador realizar un seguimiento del proceso quirúrgico y del estado de la retina de los receptores al proporcionar una visualización en tiempo real del fondo de ojo del receptor bajo el microscopio quirúrgico. Por ejemplo, la penetración exitosa del complejo esclerótica-coroides-EPR puede validarse simplemente mediante una reflectancia relativamente brillante de la punta de la aguja a través de la visualización transpupilar. Es importante destacar que, cuando se guía por la visualización transpupilar, el operador puede modular con precisión el ángulo y la profundidad de la inyección de acuerdo con la posición relativa entre la aguja y las estructuras anatómicas en la retina receptora (por ejemplo, los vasos retinianos y la cabeza del nervio óptico). Además, la administración precisa de materiales mediante esta técnica puede minimizar el EPR, el traumatismo coroideo y otras complicaciones quirúrgicas. De hecho, descubrimos que las hemorragias se pueden minimizar evitando las maniobras en las proximidades de los vasos sanguíneos de la retina con la ayuda de la visualización transpupilar.
El reflujo de células del donante es una de las principales causas de fracaso quirúrgico post-inyección29,30. Hay múltiples factores involucrados en la promoción del reflujo de células del donante. La presión intraocular alta (PIO) de los ojos receptores causada por las mezclas de células del donante inyectadas es un factor importante que promueve el reflujo de células fuera del ojo. Nuestro protocolo reduce la PIO de los receptores por penetración en la cámara anterior al inicio de la cirugía y permite que la PIO disminuya espontáneamente mediante la salida de líquido acuoso antes de extraer la aguja vítrea de la cavidad vítrea. Un segundo factor es el túnel de inyección no sellado en los ojos de los receptores. Para evitar el reflujo del injerto a través del túnel de inyección, utilizamos una aguja de microinyección de pequeño tamaño (34G) para crear un túnel autosellante al penetrar en la pared del ojo y micropinzas dentadas para sujetar los bordes de la abertura del túnel externo al sacar la aguja. En el trasplante convencional, los injertos con reflujo apenas se detectan porque pueden ocurrir rápidamente o disiparse rápidamente. El hialuronato de sodio, tras la aplicación del cubreobjetos, casi invariablemente se desliza fuera de la córnea para cubrir la mayor parte del limbo y la esclerótica, incluido el sitio de la esclerotomía. Después de la inyección celular, el hialuronato de sodio en el sitio de la esclerotomía puede ayudar a disminuir el flujo masivo de contenido de reflujo, si lo hay, y ayudar a que sean visualmente detectables bajo el microscopio quirúrgico. Además, la ausencia de reflujo también se puede comprobar trazando la constancia de la ampolla subretiniana para las suspensiones celulares y la localización intraocular de la lámina retiniana utilizando nuestro protocolo, lo que podría ser útil para laboratorios donde la tomografía de coherencia óptica (OCT) no está disponible.
Si bien un número sustancial de células fotorreceptoras sobrevivieron en las láminas de retina trasplantadas, no se pudo detectar una orientación celular discernible ni una orientación de la lámina. A pesar de que se ha establecido la administración de láminas retinianas 3D a animales grandes 26,31,32, el espacio subretiniano en ratones, junto con la falta de capacidad de imagen retiniana intraoperatoria, hace que sea muy difícil garantizar el mantenimiento de la orientación de la lámina intraoperatoriamente, así como en el período postoperatorio inmediato durante el cual las células o láminas trasplantadas pueden volverse inestables a medida que el ratón recupera la deambulación.
Describimos una plataforma quirúrgica transescleral con guía visual transpupilar directa para el trasplante subretiniano en receptores de ratón. Esta plataforma permite una alta precisión de inyección y una baja tasa de complicaciones quirúrgicas. Esta plataforma permite la administración precisa de dosis conocidas de células, es relativamente fácil de aprender y facilita la administración subretiniana, además de las inyecciones intrarretinianas o intravítreas para diferentes tipos de agentes terapéuticos, incluida la terapia génica.

El trasplante de células fotorreceptoras y epiteliales pigmentadas de la retina (EPR) proporciona una terapia potencial para las enfermedades degenerativas de la retina, como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la enfermedad de Stargardt y la retinosis pigmentaria (RP)1,2,3,4,5,6,7 . Para reponer o reemplazar los fotorreceptores enfermos y las células del EPR en la retina degenerada, el espacio subretiniano es particularmente adecuado como objetivo de trasplante dada la anatomía laminar de los fotorreceptores del huésped y las células del EPR. Si bien los procedimientos quirúrgicos de trasplante subretiniano de células EPR están bien establecidos en animales grandes 8,9,10 y ensayos clínicos11,12,13, los desafíos que enfrenta la investigación del trasplante de fotorreceptores incluyen la escasez de modelos animales grandes transgénicos y la comprensión limitada de los mecanismos de sinaptogénesis en profundidad involucrados en el trasplante neuronal, entre otras preocupaciones. Los modelos murinos modificados genéticamente, con diversos tipos de mutantes de degeneración retiniana, proporcionan herramientas útiles para estudiar los mecanismos moleculares en el contexto del trasplante y orientar el desarrollo de terapias de reemplazo celular efectivas en la etapa preclínica 14,15,16,17,18.
A diferencia del ojo relativamente grande y el cristalino pequeño en animales grandes (por ejemplo, cerdo, mono), el tamaño pequeño y el cristalino grande de los ojos de ratón los convierten en objetivos quirúrgicos difíciles, especialmente para el trasplante subretiniano en el que las limitaciones de espacio físico y la visualización directa limitada son los principales desafíos.
Los enfoques actuales se pueden clasificar en tres tipos principales en función de la ruta de inyección. En primer lugar, en el caso del abordaje transcorneal, la aguja se pasa a través de la córnea hacia la cavidad vítrea y luego hacia el espacio subretiniano19,20. Con este método se puede lograr un parto subretiniano exitoso, pero el daño a las estructuras del segmento anterior (es decir, córnea, iris, cristalino) es un riesgo importante que puede obstaculizar gravemente el análisis in vivo posterior. En segundo lugar, en el caso del abordaje transvítreo, la aguja entra en la cavidad vítrea a través de la pars plana y luego en el espacio subretiniano21. Este enfoque es ampliamente utilizado en humanos y animales grandes. Sin embargo, existe un riesgo potencial de daño en el cristalino en roedores, ya que el cristalino ocupa un volumen relativo mayor de la cavidad vítrea. En particular, tanto los protocolos transcorneales como los transvítreos requieren la penetración de la retina neural para llegar al espacio subretiniano, lo que causa daño a la retina del huésped y aumenta el riesgo de reflujo de células del donante a través del orificio de penetración. En tercer lugar, en el caso del abordaje transescleral22,23, la aguja penetra a través del complejo escleral-coroides-EPR y entra directamente en el espacio subretiniano. Este enfoque reduce el trauma potencial de las estructuras del segmento anterior y la cavidad vítrea. Sin embargo, sin una visualización directa del fondo de ojo del huésped, se detectan con frecuencia fracasos quirúrgicos causados por punciones transretinianas, desprendimiento de EPR y hemorragia coroidea.
Aquí, desarrollamos una plataforma quirúrgica transescleral con guía visual transpupilar directa para el trasplante subretiniano en receptores de ratón. Validación de la viabilidad de láminas de retina y suspensiones celulares de donantes antes de realizar el trasplante. Se confirmó la entrega exitosa de las células del donante en el espacio subretiniano de un modelo de ratón con degeneración de la retina. Solo se detectaron complicaciones quirúrgicas raras. Además, los fotorreceptores trasplantados en los injertos de retina sobrevivieron y mostraron evidencia de maduración avanzada en bastones y conos "adultos" dos meses después del trasplante.

<table><tbody><tr><td>Lágrimas artificiales</td><td>CareAll</td><td>P31447-04</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos (5mm de diámetro)</td><td>Deckglaser</td><td>N/A Cabra</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP (FITC)</td><td>Abcam</td><td>Ab6662</td><td></td></tr><tr><td>Cabra-anti-conejo Cy3&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A10520</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina (30G)</td><td>Easy Touch</td><td>08496-3015-11</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>VETone Zetamina</td><td>AH2017J</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidad de Muertos Vivos Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijera</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8503</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinzas lisas</td><td>ASICO</td><td>AE-4360</td><td></td></tr><tr><td>Pinza microdentada</td><td>World Precision Instruments</td><td>555041FT</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de microinyección (26G)</td><td>Hamilton</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de microinyección (34G)</td><td>Hamilton</td><td>207434</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de microinyección</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disociación de papaína</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (35 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB012920</td><td></td></tr><tr><td>Povidona yodada (10%)</td><td>Solución de Betadine</td><td>N/A Clorhidrato</td> de Proparacaína <td></td></tr><tr><td>(0,5%)</td><td>Keeler</td><td>AX0500</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-recoverina</td><td>Millipore</td><td>Ab5585</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-S-opsina</td><td>Millipore</td><td>Ab5407</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronato de sodio</td><td>Johnson & Visión de Johnson&nbsp;</td><td>10-2400-11</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncillos de algodón estériles</td><td>Puritan</td><td>25-806 2PC</td><td></td></tr><tr><td>Aguja estéril (25G)</td><td>BD PrecisionGlide Needle</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Paños de toalla estériles</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>Materiales/reactivos</td><td></td><td></td><td></td>quirúrgicos</tr><tr><td>Tropicamida solución oftálmica</td><td>Henry Schein</td><td>112-7192</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>AnaSed Inyección</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en un modelo de ratón con degeneración retiniana

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

El trasplante de células fotorreceptoras y células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) proporciona una terapia potencial para las enfermedades de degeneración de la retina. El trasplante subretiniano de células terapéuticas de donantes en receptores de ratón es un reto debido al limitado espacio quirúrgico que permite el pequeño volumen del ojo del ratón. Desarrollamos una plataforma de trasplante quirúrgico transescleral con guía visual transpupilar directa para facilitar la administración subretiniana de células exógenas en receptores de ratón. La plataforma se probó utilizando suspensiones de células retinianas y láminas retinianas tridimensionales recolectadas de ratones Rho:: EGFP ricos en bastones y OPN1LW-EGFP ricos en conos; NRL-/- ratones, respectivamente. El ensayo vivo/muerto mostró una baja mortalidad celular para ambas formas de células donantes. Los injertos de retina se administraron con éxito en el espacio subretiniano de un modelo de ratón de degeneración retiniana, Rd1/NS, con complicaciones quirúrgicas mínimas detectadas por imágenes de oftalmoscopio láser de barrido confocal multimodal (cSLO). Dos meses después del trasplante, la tinción histológica demostró evidencia de maduración avanzada de los injertos de retina en bastones y conos "adultos" (por expresión robusta de Rho::EGFP, S-opsina y OPN1LW:EGFP, respectivamente) en el espacio subretiniano. Aquí, proporcionamos una plataforma quirúrgica que puede permitir la administración subretiniana de alta precisión con una baja tasa de complicaciones en receptores de ratones. Esta técnica ofrece precisión y relativa facilidad para adquirir habilidades. Además, la técnica podría utilizarse no solo para estudios de trasplante de células subretinianas, sino también para otros estudios terapéuticos intraoculares, incluidas las terapias génicas.

Los injertos de retina se administran con éxito en el espacio subretiniano y sobreviven in vivo. El rendimiento de nuestra plataforma de trasplante subretiniano se evaluó en ratones receptores de Rd1/NS de 6 a 8 semanas de edad cuando su retina residual estaba severamente adelgazada debido a la degeneración casi completa de la capa nuclear externa (ONL). Dada la fragilidad de la retina, la escasez de fotorreceptores de conos y la viabilidad relativamente pobre de las células en suspensión en comparación con los donantes de hojas, los ratones ricos en conos (OPN1LW-EGFP; NRL-/-)14 se utilizaron como fuentes de láminas de retina donantes y ratones ricos en bastones (Rho::EGFP) como donantes de suspensiones celulares. La lámina de retina rica en conos y las suspensiones celulares ricas en bastones se administraron con éxito en el espacio subretiniano de todos los ratones receptores utilizando nuestra plataforma quirúrgica, como lo confirman la ampolla subretiniana y la lámina blanca observadas mediante la visualización transpupilar inmediatamente después de la inyección. Dos meses después del trasplante, se realizaron imágenes multimodales de cSLO para rastrear los estados de los injertos de retina in vivo. La OCT transversal mostró que los injertos de retina sobrevivieron en el espacio subretiniano y reconstituyeron la ONL en todos los ratones receptores (Figura 3A). Las imágenes infrarrojas no detectaron cataratas evidentes en todos los ojos trasplantados (Figura 3B). Otras complicaciones quirúrgicas, incluida la hemorragia, rara vez se detectaron en la retina trasplantada (n = 1/10 ojos) mediante imágenes de reflectancia multicolor a los dos meses después del trasplante (Figura 3C). Se realizó una tinción histológica para evaluar más a fondo la supervivencia y el grado de maduración de los fotorreceptores en los injertos de retina. Se observaron abundantes fotorreceptores de cono que expresan OPN1LW:EGFP y S-opsina en láminas retinianas trasplantadas. Del mismo modo, las suspensiones celulares de la retina trasplantadas mostraron una gran proporción de fotorreceptores Rec+ in vivo, incluidos numerosos bastones Rho::EGFP+ (Figura 3D). Los ratones control no trasplantados mostraron una degeneración severa de ONL con escasos fotorreceptores de cono residuales (Rec+). No se detectó ninguna señal de EGFP en la retina Rd1/NS no trasplantada (Figura 3D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de recolección de la lámina de retina del donante y suspensiones celulares. Esquemas que muestran los pasos clave de la recolección de suspensiones y láminas de células de la retina de ratones donantes Rho::EGFP . Las imágenes de campo claro y fluorescentes mostraron imágenes representativas de células disociadas y una lámina disecada aislada de ratones Rho::EGFP . Línea punteada amarilla: margen incisional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig02v3.jpg"> Figura 2: Procedimientos de trasplante subretiniano de láminas retinianas y suspensión celular en ratones Rd1/NS . (A) Imágenes esquemáticas de la preparación de ratones receptores. (B) Procedimientos quirúrgicos clave y diagramas correspondientes que muestren el trasplante subretiniano de suspensiones y láminas de células retinianas. Los pasos quirúrgicos incluyen: 1. penetrar en la cámara anterior; 2. Deje caer el hialuronato de sodio sobre la córnea, luego monte el cubreobjetos encima del hialuronato de sodio para facilitar la visualización transpupilar; 3. Penetrar en las capas externas de la pared del ojo (complejo esclerótica-coroides-EPR). Los ángulos de penetración de la aguja se encuentran en el panel superior derecho de la ilustración; 4. Inserte la aguja de inyección; 5. Inyectar injertos. Las imágenes representativas muestran la entrega exitosa de suspensiones de células de la retina y láminas en dos receptores individuales, respectivamente. Asterisco: cabeza del nervio óptico; Puntas de flecha rojas: vaso sanguíneo retiniano; Punta de flecha blanca: punta de aguja penetrada; Flechas blancas: suspensiones o láminas retinianas injertadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig03.jpg"> Figura 3: Entrega exitosa de injertos retinianos en el espacio subretiniano y supervivencia in vivo. (A) Las imágenes representativas de SD-OCT mostraron la distribución subretiniana de las láminas de retina trasplantadas y las suspensiones celulares en dos ratones individuales Rd1/NS , respectivamente. Se recolectaron ratones Rd1/NS no trasplantados como control. La región de interés (ROI) se indica mediante cuadros de puntos amarillos en las imágenes de fondo de ojo infrarrojas (IR). La retina interna se designa como láminas de la capa de células ganglionares de la retina (RGC), la capa plexiforme interna (IPL) y la capa nuclear interna (INL). (B) La imagen infrarroja (IR) representativa de un ratón Rd1/NS trasplantado no mostró cataratas a través de la pupila dilatada. (C) Imágenes representativas de reflectancia multicolor (RM) de ojos Rd1/NS trasplantados y no trasplantados. Los ojos trasplantados no presentaron complicaciones quirúrgicas evidentes, incluida la hemorragia. (D) Tinción inmunohistoquímica (IHQ) de ratones Rd1/NS trasplantados (hoja y suspensión) y no trasplantados (control). Los datos mostraron numerosos fotorreceptores injertados que expresaban marcadores específicos de fotorreceptores (Rec), bastones (Rho::EGFP), conos L/M (OPN1LW:EGFP) y conos S (S-opsina) a los dos meses del trasplante. Las láminas retinianas receptoras se identificaron mediante tinción DAPI (azul). Los injertos de retina se identificaron mediante el reportero EGFP (verde). La retina de los ratones no trasplantados mostró una degeneración severa de ONL con escasos fotorreceptores de cono residuales (Rec+). No se detectó ninguna señal de EGFP en la retina Rd1/NS no trasplantada. Las imágenes ampliadas se presentaron en los dos paneles de la derecha. Abreviaturas: RGC: capa de células ganglionares de la retina; INL: capa nuclear interna. ONL: capa nuclear externa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo presenta un abordaje transescleral transpupilar guiado por visión para administrar de forma segura y precisa injertos celulares subretinianos, con una baja tasa de complicaciones quirúrgicas, en receptores de ratón con o sin degeneración retiniana.

Trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en un modelo de ratón con degeneración retiniana

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

El objetivo general de este estudio es desarrollar una plataforma de trasplante transescleral con guía transpupilar directa para facilitar la administración subretiniana de células en receptores de ratón. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud. Nuestra declaración sobre el uso de animales y aprobada por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins.Se utilizaron ratones adoptivos de EGFP de edad en el día postnatal 3-6 como donantes de suspensiones de células de la retina. Los ratones OPN1LW-EGFP/NRL, con edad al día 3 postnatal, fueron adoptados como donantes de láminas de retina. Se utilizaron como receptores ratones adultos Rd1/NS con degeneración retiniana e inmunodeficiencia.Sacrificar ratones donantes con dióxido de carbono por sobredosis. Para aislar los globos oculares de los ratones, abra con cuidado los párpados de los cachorros con una microtijera y exponga el globo ocular. Envuelva el nervio óptico y saque el globo ocular con unas pinzas suaves.Una vez que los globos oculares estén aislados, haga una incisión en un orificio en el centro de la córnea con una aguja de calibre 25. Corta la córnea por la mitad a través del agujero. Y agrandar la incisión hasta la esclerótica y el EPR.A continuación, retire la esclerótica y el EPR. A continuación, utilice unas pinzas microdentadas para retirar suavemente el cristalino y el vítreo para aislar la retina neural. Para recolectar la suspensión de retina del donante, incube la retina neural en una solución de papaína a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos hasta que no se detecten grupos celulares.Recoja las células individuales siguiendo las instrucciones del fabricante del kit Papain. Para preparar la lámina de retina, coloque la retina aislada en una placa de Petri con PBS. A continuación, corte suavemente la retina neural en varias láminas de retina con una microtijera.Anestesiar ratones receptores con una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina. Procurar que el plano de anestesia logrado es el plano quirúrgico donde el animal pierde el parpadeo y los reflejos de dolor, pero la respiración y la respiración se mantienen regulares. Evalúe la profundidad anestésica mediante el pellizco de la cola o los reflejos de retirada del pedal.Vuelva a verificar la profundidad anestésica durante el procedimiento quirúrgico. Mantenga a los ratones en la mesa de cirugía precalentada para evitar la hipotermia. Dilatar las pupilas receptoras con gotas oftálmicas de tropicamida cinco minutos antes de la cirugía.Una pupila bien dilatada puede facilitar la visualización transpupilar bajo el microscopio quirúrgico. Coloque una gota de clorhidrato de proparacaína en el ojo del ratón para la analgesia. Desinfecte el ojo del ratón en operación y los tejidos oculares circundantes con yodo.A continuación, limpie el ojo con PBS estéril. Penetrar el túnel periférico en la cámara interna para reducir la presión intraocular. A continuación, coloque una gota de hialuronato de sodio y un cubreobjetos de vidrio sobre la córnea.La visualización transpupilar del fondo de ojo del ratón ya está disponible en el ámbito quirúrgico. Exponga el lugar de la inyección empujando la pared del ojo hacia el centro de la visual transpupilar con pinzas dentadas. A continuación, penetre parcialmente en la esclerótica con una aguja de microinyección, mirando 90 grados hacia la pared del ojo.Los vasos retinianos superficiales pueden servir como referencia anatómica para ubicar la aguja dentro del espacio subretiniano. A continuación, inyecte los injertos de retina. Las pequeñas burbujas precargadas en la jeringa pueden facilitar la validación de la ubicación subretiniana de las células del donante.Si la córnea se vuelve opaca, mantenga la aguja en el espacio subretiniano, hasta que la córnea se vuelva transparente para normalizar la presión intraocular. Sujete el borde del orificio de inyección y saque rápidamente la aguja. El criterio para el éxito de la suspensión celular es una ampolla constante en el espacio subretiniano.Una entrega exitosa de la lámina de retina, está convencida por una lámina blanca visible. Mantenga a los ratones trasplantados en una jaula de recuperación limpia y precalentada y vigílelos cuidadosamente para detectar cualquier signo de angustia. Si esto ocurre, coloque una gota de clorhidrato de proparacaína tópica en el ojo quirúrgico dos o tres veces.Retira a los ratones de vuelta a la jaula de la casa después de que estén completamente alerta y móviles. Coloque una pequeña cantidad de gránulos de comida en el vaso de gel en el piso de la jaula. Si los ratones tienen problemas para alcanzar la tolva de comida.Dos meses después del trasplante, se realizó oftalmoscopia láser de barrido confocal multimodal para comprobar el estado de los injertos de retina observados vivo. La tomografía de coherencia óptica de dominio espectral mostró que los injertos de retina sobrevivieron en el espacio subretiniano y reconstituyen la capa nuclear externa de todos los ratones receptores. Las imágenes infrarrojas no detectaron cataratas obvias en todos los ratones trasplantados.Otras complicaciones quirúrgicas, incluida la hemorragia, se detectaron mal en ratones trasplantados mediante imágenes de reflectancia multicolor. La tinción histológica mostró abundantes fotorreceptores de cono que expresan OPN1LW:EGFP y S-opsina en láminas retinianas trasplantadas. Del mismo modo, el trasplante de suspensiones celulares de la retina mostró una gran proporción de recuperación de fotorreceptores positivos in vivo, incluidos numerosos bastones positivos de EGFP maduros.Los ratones no trasplantados mostraron una degeneración severa de la capa nuclear externa con escasos fotorreceptores de cono residuales que expresan recuperación. Sin embargo, no se detectó ninguna señal de EGP en ratones no trasplantados. Este estudio proporciona una plataforma quirúrgica transescleral con orientación visual transpupilar directa para el trasplante subretiniano en receptores de ratón.Esta plataforma permite la administración precisa de dosis conocidas de células. Es relativamente fácil aprender y facilitar la administración subretiniana, además de las inyecciones intrarretinianas o intravítreas para diferentes tipos de agentes terapéuticos, incluida la terapia génica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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Neurociencia

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Las inyecciones subretinianas son una técnica indispensable para el desarrollo preclínico de terapias para enfermedades de fotorreceptores y EPR. Describimos una técnica de inyección subretiniana transescleral optimizada en ratones que mejora las tasas de éxito intraoperatorio y minimiza el daño retiniano.

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Aprende el trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en ratones con degeneración retiniana. Este método permite una entrega precisa de células con baja tasa de complicaciones quirúrgicas.

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