Name: Detección de anticuerpos IgG e IgM contra la rabia mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos contra la rabia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende a detectar anticuerpos IgG e IgM contra la rabia mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos. Este método evalúa respuestas inmunes postvacunación y postexposición de forma rápida.

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Agradecemos al Centro Wadsworth del Departamento de Salud del Estado de Nueva York por apoyar este proyecto.

El siguiente protocolo ha sido aprobado para el uso ético de muestras humanas por el Centro Wadsworth del Departamento de Salud del Estado de Nueva York para el desarrollo de ensayos, número de aprobación del protocolo #03-019.
1. Seguridad
<ol><li>Use equipo de protección personal (EPP), protección ocular mínima (anteojos o protector facial), una mascarilla quirúrgica y guantes que no sean de látex.</li>
	<li>Asegúrese de que el personal esté vacunado contra la rabia y que se haya demostrado un título de ≥0.5 UI/ml en los últimos 6 meses.</li>
</ol>2. Preparación del portaobjetos de antígeno
NOTA: Realice todas las manipulaciones de virus, LCR y suero en una cabina de bioseguridad (BSC) utilizando las precauciones universales.
<ol><li>Prepare 20 ml de neuroblastoma de ratón o células BHK-21 a una concentración de 3,0 x 105 células/ml en los medios esenciales mínimos de Eagle suplementados con suero fetal bovino (EGM) al 10 % y manténgalos fríos hasta su uso.</li>
	<li>Prepare el virus CVS-11 diluyéndolo en EGM hasta una dilución de trabajo de 1,0 x 106,5 50 % de dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID50) por mililitro y manténgalo frío hasta que esté listo para su uso. NOTA: El TCID50 se determina mediante el método de Reed y Muench publicado anteriormente5.</li>
	<li>Limpie una cámara de portaobjetos de humedad y portaobjetos de pocillo recubiertos de politetrafluoroetileno (PTFE) con etanol al 70% y deje secar al aire en el BSC.</li>
	<li>Agregue agua destilada (dH2O) a las tiras de papel absorbente en la cámara del portaobjetos para asegurarse de que la humedad permanezca constante durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Con un lápiz, etiquete cada portaobjetos que se va a utilizar con el número de lote, la fecha, el tipo de celda y cualquier otra información de identificación necesaria para el almacenamiento, y colóquelos en la cámara de portaobjetos. NOTA: La mayoría de los marcadores, bolígrafos o etiquetas no resistirán el futuro paso de fijación de acetona (paso 2.9).</li>
	<li>Aplique 50 μL de dilución de virus a cada pocillo de los portaobjetos del microscopio con una pipeta de repetición. A continuación, aplique 50 μL de dilución celular en cada pocillo, teniendo cuidado de no contaminar la punta de la pipeta con el virus que ya está en el pocillo.</li>
	<li>Cierre la cámara del portaobjetos de humedad y colóquela en la incubadora húmeda a 34-36 °C. Evaluar la infectividad celular después de 24 h. NOTA: Realice los pasos 2.8-2.12 en una sola diapositiva.</li>
	<li>Retire el portaobjetos de la cámara de humedad y aspire con cuidado el sobrenadante. Lave el portaobjetos en un frasco Coplin lleno de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 2 minutos, luego deje que el portaobjetos se seque al aire.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos en el frasco Coplin y fije el portaobjetos en acetona fría durante un mínimo de 1 h en un congelador de -20 °C aprobado para materiales inflamables. Realice todos los procedimientos de vertido de acetona y secado al aire en una campana extractora.</li>
	<li>Deja que la acetona se desprenda y se seque. Aplicar anticuerpo fluorescente directo (DFA) antirrábico preparado según las instrucciones del fabricante en los pocillos del portaobjetos e incubar durante 30 min en una incubadora húmeda a 34-36 °C.</li>
	<li>Lave el portaobjetos en frascos Coplin de PBS dos veces durante 2 minutos cada uno. Seque el portaobjetos al aire.</li>
	<li>Monte un cubreobjetos con 0,05 M de Tris, 0,15 M de NaCl (pH 9,0) y un 20% de glicerol, y lea el portaobjetos con un microscopio fluorescente con un aumento de 200x para evaluar la infectividad. Si las células no están infectadas aproximadamente en un 50%, repita los pasos 2.7-2.12 al día siguiente hasta alcanzar la infectividad deseada. NOTA: La infectividad celular se aproxima en función de la evaluación visual de la proporción de células negativas a células positivas para la rabia en el pocillo portaobjetos. Las células negativas aparecen de color rojo, mientras que las células positivas muestran una tinción fluorescente verde.</li>
	<li>Retire los portaobjetos restantes de la incubadora y de la cámara de humedad. Aspire con cuidado el sobrenadante de cada pocillo, luego coloque los portaobjetos en un frasco Coplin con PBS durante 1-2 minutos. Seque los portaobjetos al aire durante aproximadamente 30 minutos. Guarde los portaobjetos a -80 °C hasta que estén listos para su uso.</li>
</ol>3. Preparación de la muestra
<ol><li>Prepare las diluciones de muestras de suero o LCR del paciente para su análisis. Preparar el conjugado necesario para una concentración de trabajo adecuada diluido en PBS con azul de Evans al 0,05%. NOTA: Mantenga el conjugado en la oscuridad para mantener la integridad del fluoróforo antes de la aplicación</li>
</ol>4. Procedimiento IFA
<ol><li>Retire el número necesario de portaobjetos de antígeno preparados necesarios para cada ensayo y deje que los portaobjetos se descongelen y se sequen por completo.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en un frasco Coplin y fije los portaobjetos en acetona fría durante 2 h a toda la noche en un congelador de -20 °C aprobado para materiales inflamables. Retire los portaobjetos de la acetona y déjelos secar al aire.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en una caja de cámara de humedad dentro del BSC con tiras absorbentes empapadas en OdH 2para mantener la humedad. Aplique 50 μL de cada dilución de muestra, muestra de control o PBS al pocillo predeterminado. NOTA: Cada portaobjetos debe contener un número adecuado de pocillos de muestra de pacientes, pocillos de control positivo, control negativo y pocillo de control de células PBS.</li>
	<li>Coloque la cámara de portaobjetos de humedad cerrada en una incubadora húmeda a 37 °C y 5% de CO2 . Incube los portaobjetos durante 30 minutos, luego retire la cámara de humedad de los portaobjetos de la incubadora y colóquela en un BSC.</li>
	<li>Utilice una punta de aspiración para aspirar cuidadosamente el sobrenadante de cada pocillo, asegurándose de no perturbar la monocapa celular. Utilice una pipeta cuentagotas estéril para aplicar una gota de PBS en cada pocillo.</li>
	<li>Repita la aspiración cuidadosa, luego coloque cada portaobjetos en un frasco Coplin lleno de PBS y lave dos veces durante un total de 15 minutos.</li>
	<li>Vuelva a colocar los portaobjetos en la caja de la cámara de humedad y aplique 50 μL de conjugado de anticuerpos antihumanos apropiado a cada pocillo. Repita los pasos 4.4 a 4.6.</li>
	<li>Deje que los portaobjetos se sequen al aire, monte un cubreobjetos con medios de montaje y lea los portaobjetos bajo un microscopio fluorescente.</li>
</ol>5. Análisis de diapositivas
<ol><li>Clasificar las muestras en función del patrón de tinción y la intensidad de fluorescencia en comparación con las muestras de control positivas con un título de anticuerpos antirrábicos alto confirmado.</li>
	<li>Califique las muestras en una escala de negativo, 1+, 2+, 3+ y 4+, con un resultado negativo que muestre que no hay tinción fluorescente y 4+ que representa una fluorescencia de color manzana verde brillante con un patrón de tinción similar al de las muestras de control positivas1. NOTA: El color verde manzana se aplica solo a los anticuerpos marcados con FITC; El color varía dependiendo de la selección de fluoróforos.</li>
	<li>Asigne a las muestras un valor de punto final representado por el factor de dilución en el que la muestra muestra un grado 1-2+. Pruebe las muestras con un factor de dilución más alto si no se alcanza el punto final en el ensayo inicial.</li>
</ol>

Detección rápida y precoz de anticuerpos antirrábicos para evaluar la respuesta inmunitaria en un paciente

<ol><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Techniques+in+Rabies.+Volume+1%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1.</a> World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).</li>
<li>Moore, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+rabies+serology%3A+defining+context+of+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Challenges of rabies serology: defining context of interpretation.</a> Viruses. 13 (8), 1516(2021).</li>
<li>Zajac, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+rabies+enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29+targeting+IgM+and+IgG+in+human+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera.</a> Viruses. , 40-49 (2019).</li>
<li>Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+antibodies+and+boostability+after+rabies+intradermal+pre-exposure+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Travel+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis.</a> Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li>
<li>Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+cross-reactions+with+other+viral+encephalitides+in+the+indirect+fluorescent-antibody+test+for+diagnosis+of+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).</li>
<li>Fooks, A. R., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFooks%2C+AR+%22Rabies%3A+scientific+basis+of+the+disease+and+its+management%22">Rabies: scientific basis of the disease and its management</a>. , Academic Press. (2020).</li>
<li>Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Chlamydia+pneumoniae-specific+immunoglobulin+A+%28IgA%29+antibodies+by+the+microimmunofluorescence+%28MIF%29+method%3A+comparison+of+seven+fluorescein-labeled+anti-human+IgA+conjugates+in+an+in-house+MIF+test+using+one+commercial+MIF+and+one+enzyme+immunoassay+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).</li>
<li>Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+anti-rabies+glycoprotein+antibodies%3A+current+state+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).</li>
<li>Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+aspects+of+rabies%3A+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Immunological aspects of rabies: a literature review.</a> Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).</li>
<li>Moore, S. M., Hanlon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies-specific+antibodies%3A+measuring+surrogates+of+protection+against+a+fatal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La prueba IFA aprovecha un complejo antígeno-anticuerpo, lo que permite un sitio de marcaje para visualizar los anticuerpos específicos de la rabia. El neuroblastoma o las células BHK se siembran en portaobjetos de microscopio recubiertos de PTFE de varios pocillos y se inoculan con la cepa de laboratorio CVS-11 del virus de la rabia. Una vez que la monocapa es confluente y las células alcanzan la infectividad deseada de aproximadamente el 50%, los portaobjetos se almacenan hasta que estén listos para su uso6.
El suero o LCR del paciente se aplica a la monocapa de la célula infectada y se incuba para permitir que los anticuerpos específicos de la rabia se adhieran al antígeno del virus7. Después de un procedimiento de lavado, se aplica un anticuerpo IgG o IgM humano marcado con fluorescencia y se une a cualquier anticuerpo unido al virus de la aplicación de la muestra. Los anticuerpos marcados se pueden visualizar bajo un microscopio fluorescente.
Al prepararse para realizar este ensayo, es importante determinar la mejor preparación de las muestras de pacientes, los controles y los conjugados. Las muestras iniciales de los pacientes se analizaron con un factor de dilución bajo o sin diluir para detectar la presencia de anticuerpos. Las muestras pareadas o las muestras previamente examinadas que demostraron un alto nivel de anticuerpos se diluyeron aún más hasta el punto final. Las diluciones iniciales de las muestras de los pacientes para las pruebas de IgG se prepararon en diluyente de IFA disponible comercialmente. Las muestras de prueba de IgM se prepararon inicialmente en un reactivo de bloqueo de IgG disponible comercialmente. A continuación, se prepararon diluciones seriadas posteriores para ambas pruebas en PBS.
Los controles utilizados para las pruebas se obtuvieron de receptores conocidos de PrEP antirrábica o de personas sin antecedentes de vacunación antirrábica. Todas las muestras de control se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos antes de su uso. El control de IgG se obtuvo de un receptor de la vacuna antirrábica con un título establecido de anticuerpos neutralizantes de la rabia confirmado por la FAVN. La muestra de control positiva para IgM se obtuvo de un receptor de la vacuna antirrábica aproximadamente 2 semanas después de completar la vacunación.
El uso de un conjugado apropiado es otro aspecto vital de la realización de la prueba IFA. El conjugado utilizado para cada prueba depende del objetivo del isotipo de anticuerpo para ese ensayo. En este caso, se utilizaron anticuerpos anti-IgG humanos y anti-IgM humanos marcados con el FITC disponibles comercialmente. Las diluciones de conjugado de anticuerpos de trabajo se determinaron antes de la prueba según la recomendación del fabricante.
Hay varios pasos clave en el procedimiento que garantizarán la ejecución exitosa de la prueba IFA, quizás el más importante sea la preparación del portaobjetos de antígeno. Alcanzar aproximadamente el 50% de infectividad proporciona abundantes sitios de unión para los anticuerpos disponibles, al tiempo que crea claridad al leer y clasificar las muestras. Las células antirrábicas negativas crean un fondo contrastante para visualizar mejor los anticuerpos marcados. La tinción inespecífica también puede presentar un problema cuando se realiza la tinción fluorescente utilizando matrices de muestra complejas, como el suero. El uso de reactivos de inactivación de IgG (p. ej., Gullsorb) ayuda a reducir la tinción inespecífica debido a la interferencia de anticuerpos IgG al evaluar la presencia de IgM8. La preparación adecuada de los materiales y la incorporación de reactivos especiales en el procedimiento ayudan a disminuir las tinciones problemáticas al tiempo que preservan resultados de alta calidad.
Se han desarrollado una multitud de métodos de prueba que se centran en la detección, cuantificación e identificación de anticuerpos contra la rabia. Cada una de estas pruebas ofrece resultados que pueden ser utilizados de diversas maneras dependiendo de la información buscada. La prueba de IFA antirrábica es una herramienta poderosa para identificar isotipos de anticuerpos específicos del virus, y los resultados pueden estar listos en un período de tiempo relativamente corto en comparación con otros métodos de prueba, como las pruebas RFFIT y FAVN.
Aunque la prueba IFA puede detectar anticuerpos antirrábicos en una muestra, no proporciona una cuantificación estandarizada de los anticuerpos. La prueba IFA proporciona un factor de dilución sérica en el que finaliza la detección de anticuerpos. En comparación, las pruebas RFFIT y FAVN cuantifican la capacidad neutralizante de los anticuerpos en una muestra, lo que da como resultado un título de unidades internacionales (UI), lo que proporciona un resultado más detallado y estandarizado. Los resultados de una prueba FAVN o RFFIT demuestran la presencia de anticuerpos neutralizantes, que se han determinado como anticuerpos IgG9. Se entiende que el papel de la IgM en la actividad neutralizante es limitado debido a su estructura10. Por lo tanto, estas pruebas no detectan específicamente la presencia de IgM.
El tipo de prueba y su resultado pueden ser algo problemáticos a la hora de aplicarlos a un problema concreto. El concepto de un nivel protector de protección de anticuerpos contra la infección por el virus de la rabia ya no se utiliza para evaluar la respuesta inmunitaria a la vacunación antirrábica. Anteriormente, una respuesta protectora se definía como ≥0,5 UI. Sin embargo, las publicaciones actuales suelen referirse a la respuesta de anticuerpos después de la inmunización como aceptable (≥0,5 UI) o inaceptable (<0,5 UI). Como se ha dicho, la prueba IFA no proporciona un título de anticuerpos en IU y no debe utilizarse para obtener un nivel de protección contra la rabia. El uso de la prueba IFA mientras se evalúa a un paciente que ha desarrollado rabia no siempre da como resultado una presencia positiva de anticuerpos debido a las variaciones en la respuesta inmunitaria a lo largo de la enfermedad. Debido a la letalidad cercana al 100% de una infección por rabia, es importante tener en cuenta la prueba y cuánta información se puede derivar de forma segura de estos resultados11. Por estas razones, siempre es mejor evaluar todos los métodos de prueba de anticuerpos contra la rabia y determinar cuál funciona mejor en un escenario determinado.

La prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFA) contra la rabia se utiliza para detectar varios isotipos de anticuerpos específicos contra la rabia en sueros o líquido cefalorraquídeo. Forma parte de un arsenal de pruebas disponibles para el seguimiento de un paciente con rabia antemortem. Es especialmente útil para la detección temprana de anticuerpos para evaluar la respuesta inmunitaria de un paciente a la infección por rabia. Cuando se utiliza junto con otras pruebas, la historia clínica y el estado de vacunación del paciente, la prueba IFA puede ayudar a determinar la exposición al virus de la rabia o a una vacuna1. Como la prueba IFA mide IgM y/o IgG, los valores del anticuerpo específico pueden indicar un período de tiempo aproximado desde la exposición al antígeno1. Esta prueba puede ser útil en las aplicaciones enumeradas u otras aún no exploradas.
Existen varios ensayos serológicos contra la rabia. La prueba rápida de inhibición del foco fluorescente (RFFIT), la prueba de neutralización del virus de anticuerpos fluorescentes (FAVN) o las modificaciones de estas son los principales métodos para medir los anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia (RVNA)1. Sin embargo, estas pruebas no diferencian los anticuerpos IgM e IgG. Cuando la diferenciación del isotipo de los anticuerpos es importante para monitorizar la respuesta inmunitaria de la rabia, se utilizan las pruebas de IFA antirrábica y de ensayo de inmunoabsorción enzimática de la rabia (ELISA), pero no miden los AVR. Aunque las pruebas IFA y ELISA se pueden utilizar para determinar la presencia de anticuerpos específicos contra la rabia en una muestra, existen algunas diferencias en la forma en que se ejecutan. La prueba IFA utiliza un virus vivo cultivado en células como sustrato de antígeno, mientras que un ELISA típico para la detección de la rabia utiliza una o más de las proteínas virales. En un entorno de laboratorio donde se puede cultivar el virus de la rabia, la prueba de IFA se puede realizar más fácilmente en lugar de comprar o cultivar proteínas virales individuales para el ELISA. El propósito de la prueba y la información obtenida de los resultados de cualquier ensayo serológico de rabia deben tenerse en cuenta al determinar cuál elegir2.
La IgM es la primera en responder, aumentando hasta que se observa el cambio de clase alrededor del día 28, momento en el que la IgG se convierte en el anticuerpo circulante predominante3. Por lo tanto, la IgM solo se esperaría durante un período de tiempo limitado después de la exposición al virus de la rabia o la vacunación. Las pruebas tanto en suero como en líquido cefalorraquídeo (LCR) pueden indicar si la exposición fue a través de la vacunación, en la que los anticuerpos se verían solo en los sueros, o de una infección viral, que potencialmente mostraría anticuerpos en el LCR1.
Se ha establecido que los anticuerpos antirrábicos persisten durante varios años después de la profilaxis previa a la exposición (PrEP)4. La prueba IFA puede ser una herramienta útil para demostrar esto en diferentes momentos después de la vacunación o la exposición.

<table><tbody><tr><td>La cubierta de vidrio de 25x55mm se desliza</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetona</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgG antihumana Etiquetada como conjugada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9512</td><td></td></tr><tr><td>IgM antihumana marcada con conjugada</td><td>SeraCare</td><td>5230-0286</td><td></td></tr><tr><td>Punta de pipeta aspirante</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>célula BHK-21 ATCC</td><td></td><td>CCL-10</td><td></td></tr><tr><td>BION IFA Diluyente</td><td>MBL BION</td><td>DIL-9993</td><td></td></tr><tr><td>Agua de cultivo celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Frascos Coplin</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente con filtro FITC</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td>Mountant</td></tr><tr><td>Gullsorb Reactivo de inactivación de IgM</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-043-158</td><td>Reactivo de inactivación de IgG</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7513</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Mínimo Esencial Medios de Comunicación Águila &ndash; con Earle' sales s, L-glutamina y aminoácidos no esenciales, sin bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Células de neuroblastoma</td><td>de ratón ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio con recubrimiento de PTFE de pocillos múltiples</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cualquier</td><td></td><td>pH 7.6&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Sigma</td><td>P-3032</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Rabia Conjugado de Anticuerpo Fluorescente Directo</td><td>Millipore Sigma</td><td>5100, 5500, 6500, RU5100 o RU5500</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5761</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Cristales de cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>Montante Gotero</td></tr><tr><td>estéril</td><td>Cualquiera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sal de sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Cristales preestablecidos de Trizma pH 9.0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9693</td><td>Mountant</td></tr><tr><td>Caldo de fosfato de triptosa</td><td>BD</td><td>260300</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Mezcla de vitaminas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td>EGM</td></tr></tbody></table>

detección de anticuerpos igg e igm contra la rabia mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos contra la rabia

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

La prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFA) contra la rabia se desarrolló para detectar varios isotipos de anticuerpos específicos contra la rabia en sueros o líquido cefalorraquídeo. Esta prueba proporciona resultados rápidos y se puede utilizar para detectar anticuerpos contra la rabia en varios escenarios diferentes. La prueba de rabia IFA es especialmente útil para la detección rápida y temprana de anticuerpos para evaluar la respuesta inmune en un paciente que ha desarrollado rabia. Aunque otros métodos para el diagnóstico de la rabia antemortem tienen prioridad, esta prueba se puede utilizar para demostrar la exposición reciente al virus de la rabia a través de la detección de anticuerpos. La prueba IFA no proporciona un título de anticuerpos neutralizantes del virus (VNA), pero la respuesta de profilaxis previa a la exposición (PrEP) puede evaluarse a través de la presencia positiva o negativa de anticuerpos. Esta prueba se puede utilizar en diversas situaciones y puede proporcionar resultados para varios objetivos diferentes. En este estudio, utilizamos varias muestras de suero pareadas de individuos que recibieron PrEP y demostramos su presencia de anticuerpos contra la rabia a lo largo del tiempo utilizando la prueba IFA.

Todas las muestras de suero se recolectaron de los pacientes aproximadamente en los mismos períodos de tiempo después de la PrEP. Las muestras se analizaron de cinco pacientes diferentes en los siguientes momentos: 2 semanas después de la inoculación final de la vacuna antirrábica, 6 meses después de la serie de vacunas antirrábicas y 18 meses después de la serie de vacunas antirrábicas. Cada muestra de suero se diluyó en series y se clasificó según la presencia de IgM e IgG, como se describe en los pasos 5.2 y 5.3 del protocolo. El valor de anticuerpo asignado representa el factor de dilución en el que la muestra alcanzó un grado final de 1-2+.
Los resultados de las pruebas de cada punto de tiempo después de la PrEP demuestran la capacidad del ensayo para detectar diferentes niveles de presencia de anticuerpos. Poco después de la vacunación inicial, se observaron altos niveles de IgM e IgG en las muestras de pacientes, como se observa en la Figura 1. Las áreas de tinción de células fluorescentes de color verde brillante indican la presencia de anticuerpos positivos; Los glóbulos rojos son células antirrábicas negativas a las que ningún anticuerpo puede unirse. Aproximadamente 6 meses después de la vacunación, los niveles significativamente más bajos de IgM e IgG estaban presentes en las muestras de pacientes, pero la IgM había desaparecido casi por completo. En el momento final, 18 meses después de la vacunación, no se detectaron anticuerpos IgM en ninguna muestra de pacientes, como se demuestra en la Figura 2, donde no se observa tinción de células fluorescentes verdes. Sin embargo, los niveles de IgG persistieron y se mantuvieron similares a los niveles detectados a los 6 meses después de la disminución inicial a partir de las 2 semanas. Los resultados de la detección de IgG e IgM en muestras de 2 semanas después de la vacunación, 6 meses después de la vacunación y 18 meses después de la vacunación se enumeran en la Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3, respectivamente. La figura 3 muestra el diagrama de flujo de las etapas de ejecución.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig01.jpg"> Figura 1: Tinción de IgM IFA positiva para rabia. El suero del paciente en una dilución de 1:8 demostró un patrón de tinción positivo poco después de completar la serie de vacunas de la PrEP. La barra de escala de la imagen representa 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig02.jpg"> Figura 2: Tinción de IgM IFA negativa para rabia. El suero del paciente en una dilución 1:2 no mostró tinción positiva aproximadamente 18 meses después de completar la serie de vacunas PrEP. La barra de escala de la imagen representa 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig03.jpg"> Figura 3: Diagrama de flujo de la IFA antirrábica. Diagrama de flujo que muestra las etapas de ejecución de los pasos principales en el procedimiento IFA para ayudar en la visualización del proceso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Muestra de paciente</td>
			<td>Igm</td>
			<td>IgG</td>
		</tr><tr><td>PS1-1</td>
			<td>1:32</td>
			<td>1:512</td>
		</tr><tr><td>PS2-1</td>
			<td>1:8</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-1</td>
			<td>1:16</td>
			<td>1:256</td>
		</tr><tr><td>PS4-1</td>
			<td>1:64</td>
			<td>1:512</td>
		</tr><tr><td>PS5-1</td>
			<td>1:16</td>
			<td>1:128</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Resultados 2 semanas después de la vacunación. Resultados de muestras de pacientes de muestras de suero recolectadas aproximadamente 2 semanas después de completar la serie de vacunas PrEP.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Muestra de paciente</td>
			<td>Igm</td>
			<td>IgG</td>
		</tr><tr><td>PS1-2</td>
			<td>1:2</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS2-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS4-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:256</td>
		</tr><tr><td>PS5-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:32</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Resultados 6 meses después de la vacunación. Resultados de muestras de pacientes de muestras de suero recolectadas aproximadamente 6 meses después de completar la serie de vacunas PrEP.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Muestra de paciente</td>
			<td>Igm</td>
			<td>IgG</td>
		</tr><tr><td>PS1-3</td>
			<td>No detectado</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS2-3</td>
			<td>No detectado</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-3</td>
			<td>No detectado</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS4-3</td>
			<td>No detectado</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS5-3</td>
			<td>No detectado</td>
			<td>1:32</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Resultados 18 meses después de la vacunación. Resultados de muestras de pacientes de muestras de suero recolectadas aproximadamente 18 meses después de completar la serie de vacunas PrEP.

El objetivo de este manuscrito es examinar el uso de la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos contra la rabia para la detección de anticuerpos IgG e IgM específicos contra la rabia.

Detección de anticuerpos IgG e IgM contra la rabia mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos contra la rabia

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...

La prueba IFA evalúa la respuesta de anticuerpos durante la infección por rabia o evalúa la respuesta inmunitaria de las vacunas. Se puede utilizar para establecer la presencia de anticuerpos en una muestra y distinguir qué isotipos de anticuerpos están presentes. Los ensayos de anticuerpos neutralizantes son el estándar de oro para la detección de anticuerpos antirrábicos para evaluar el título de anticuerpos en una persona que ha recibido profilaxis previa o posterior a la exposición.Aunque una prueba de IFA puede arrojar resultados diferentes a los de un ensayo de anticuerpos neutralizantes, aún puede proporcionar información valiosa cuando se usa como alternativa. Por lo general, los ensayos que miden los anticuerpos neutralizantes de la rabia evalúan la respuesta inmunitaria. Sin embargo, estas pruebas tardan varios días y requieren el cultivo de virus y células vivas.La prueba IFA permite la preparación avanzada de portaobjetos de antígenos para la prueba con resultados en unas pocas horas en lugar de días. El uso de las pruebas IFA en casos de rabia humana puede conducir a más respuestas sobre cómo responde el sistema inmunitario de un individuo a la infección por rabia. Existe una gran variación entre los casos, y esta prueba puede proporcionar resultados en tiempo real durante la enfermedad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra la tinción inmunohistoquímica para la detección del antígeno del virus de la rabia en tejido cerebral de ratón infectado. El proceso incluye la desparafinación y el tratamiento con alcohol, seguidos de un tratamiento proteolítico para mejorar la accesibilidad al antígeno. La tinción inmunohistoquímica revela precipitados rojos, lo que confirma la presencia de antígenos de rabia en la sección de tejido.

Tinción inmunohistoquímica para la detección de antígenos del virus de la rabia

La prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT) ofrece una alternativa reconocida de la Organización Mundial de Sanidad Animal y la Organización Mundial de la Salud (OIE/OMS) a la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) para el diagnóstico de la rabia. Esta prueba permite aplicaciones basadas en el campo que se pueden realizar en aproximadamente 1 h sobre impresiones cerebrales utilizando microscopía de luz.

Vigilancia mejorada de la rabia mediante una prueba inmunohistoquímica rápida directa

Aquí describimos una inmunocaptura indirecta de sándwich ELISA para determinar el contenido de glicoproteína inmunogénica en las vacunas contra la rabia. Esta prueba utiliza un anticuerpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) que reconoce los recortadores de glicoproteína. Es una alternativa a la prueba in vivo de NIH para seguir la consistencia de la potencia de la vacuna durante la producción.

Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

Presentamos un protocolo completo para el diagnóstico postmortem de la rabia animal en condiciones de campo utilizando una prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido (RIDT), desde el muestreo de biopsia cerebral hasta la interpretación final. También describimos otras aplicaciones que utilizan el dispositivo para el análisis molecular y el genotipado viral.

Prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido postmortem de campo para la configuración de recursos limitados con otras aplicaciones moleculares

Aquí, presentamos un protocolo de prueba de inmunohistoquímica para la detección del antígeno del virus de la rabia como una prueba diagnóstica alternativa para los tejidos fijos con formalina.

Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

Este protocolo presenta un enfoque basado en qRT-PCR para determinar el número de copia genética de nucleoproteína (N) del virus de la rabia dentro de varias estructuras anatómicas cerebrales bovinas utilizando transcripción in vitro.

Cuantificación del virus de la rabia en varias estructuras cerebrales bovinas

La síntesis de anticuerpos monoclonales humanos es el primer paso en estudios destinados a desentrañar los mecanismos fisiopatológicos de las respuestas inmunitarias mediadas por autoanticuerpos. Hemos desarrollado un protocolo para generar anticuerpos monoclonales de inmunoglobulina G (IgG) humana recombinante a partir de células B clasificadas por sangre, incluido el aislamiento de células B, la clonación de anticuerpos y la síntesis in vitro.

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

Presentamos un protocolo para identificar fracciones de proteínas que contienen antígenos para anticuerpos IgM humanos y de ratón con cadenas ligeras kappa (Vκ) específicas. Este protocolo no se limita a los anticuerpos de la clase IgM, sino que se aplica a todos los isotipos de inmunoglobulinas que se dirigen a su antígeno con una afinidad suficientemente alta durante las inmunoprecipitaciones.

Anticuerpo especificidad de unión de Kappa (VK) Humanos (IgM) de luz que contiene la cadena-: Ácido polisiálico (PSA) unido a NCAM como un estudio de caso

Describimos aquí un método para generar microarrays de antígenos personalizables que se pueden utilizar para la detección simultánea de autoanticuerpos séricos IgG e IgM de humanos y ratones. Estas matrices permiten la detección cuantitativa y de alto rendimiento de anticuerpos contra cualquier antígeno o epítopo de interés.

Generación de dos colores con antígeno microarrays para la detección simultánea de autoanticuerpos IgG e IgM

El método en el talón para el marcaje de anticuerpos con moléculas pequeñas permite el etiquetado de una pequeña cantidad de anticuerpos directamente desde el soporte celular. Este método es compatible con la amina y la química de tiol, y puede manejar múltiples muestras en paralelo, de forma manual o utilizando plataformas automatizadas.

Antibody Labeling con tintes fluorescentes utilizando proteína magnética A y Proteína G cuentas

Aprende a detectar anticuerpos IgG e IgM contra la rabia mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos. Este método evalúa respuestas inmunes postvacunación y postexposición de forma rápida.

Detección de anticuerpos IgG e IgM contra la rabia mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos contra la rabia

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