Name: Métodos para la electroporación y confirmación de transformación en Limosilactobacillus reuteri DSM20016 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Aprende métodos de electroporación y confirmación de transformación en Limosilactobacillus reuteri DSM20016. Estos protocolos modernos facilitan la investigación en microbiología y biología sintética para aplicaciones terapéuticas.

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Apreciamos enormemente el valioso asesoramiento proporcionado por el Prof. J.P. van Pijkeren (Universidad de Wisconsin-Madison), cuya orientación sobre el trabajo con L. reuteri ATCC PTA 6475 proporcionó una base para los métodos descritos aquí.

1. Preparación de células electrocompetentes de L. reuteri DSM20016
NOTA: Esto se basa en un protocolo de Berthier et al.17, con velocidades de centrifugación informadas por Rattanachaikunsopon et al.18.
<ol><li>En un tubo de centrífuga de 50 ml, inocular L. reuteri de la cal de glicerol en 6 ml de caldo deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubar aeróbicamente durante la noche a 37 °C en una incubadora estática.</li>
	<li>A la mañana siguiente, inocular 4 ml del cultivo nocturno en 200 ml de caldo MRS (dilución 1:50).</li>
	<li>Permitir que crezca aeróbicamente en una incubadora estática de 37 °C hasta que el valor de densidad óptica de 600 nm (OD600) alcance 0.5-0.85; Esto debería tomar aproximadamente 2-3 h.</li>
	<li>Tan pronto como se alcance un valor adecuado de OD600, decantar el medio en tubos de centrífuga de 50 ml y colóquelos en hielo mientras equilibra los tubos.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 5.000 x g en una centrífuga preenfriada a 4 °C.</li>
	<li>Desechar el sobrenadante, resuspender cada pellet en 50 ml deddH2Opreenfriado (0 °C a 4 °C) y centrifugar de nuevo con los mismos ajustes que el paso anterior. Mantenga las células en hielo tanto como sea posible.</li>
	<li>Repita el paso 1.6.</li>
	<li>Resuspender cada pellet en 25 mL deddH2O: 0,5 M sacarosa, 10% glicerol. Centrifugar a 5.000 g a 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a poner las células en hielo.</li>
	<li>Resuspender todos los pellets en los mismos 2 mL deddH2O:0,5 M de sacarosa, 10% glicerol.</li>
	<li>Alícuota en porciones de 50 μL a 100 μL en tubos de microcentrífuga prerefrigerados; conservar a -80 °C para su uso posterior.</li>
</ol>2. Electroporación de L. reuteri 
NOTA: Evite el pipeteo tanto como sea posible en los siguientes pasos. Se recomienda la inclusión de una electroporación de control, sin plásmido añadido, para garantizar que la selección de antibióticos sea adecuada.
<ol><li>Tome una alícuota electrocompetente entera de L. reuteri y descongele en hielo.</li>
	<li>Mezclar suavemente de 5 μL a 10 μL de plásmido (concentración final de plásmidos >6 nM) en la alícuota descongelada, evitando el pipeteo tanto como sea posible.</li>
	<li>Transfiera a una cubeta de electroporación de 1 mm de espacio frío por hielo.</li>
	<li>Electroporato a 1,25 kV, 400 Ω y 25 μF.</li>
	<li>Agregue 1 ml de caldo MRS a temperatura ambiente (RT) y mezcle invirtiendo la cubeta una o dos veces.</li>
	<li>Coloque las cubetas en una incubadora estática a 37 °C durante 2,5-3 h para permitir la recuperación.</li>
	<li>Coloque la cantidad total en múltiples placas de agar MRS con la selección adecuada.</li>
	<li>Coloque los platos dentro de un recipiente completamente hermético con una pequeña vela encendida ("luz de té") y un sobre anaeróbico generador de atmósfera.</li>
	<li>Cultivar a 37 °C durante 2-3 días o hasta que haya colonias visibles.</li>
</ol>3. Medición de la proteína reportera fluorescente resistente a los ácidos mCherry2
<ol><li>Elija las colonias necesarias para la medición e inocular en una microplaca de almacenamiento de 96 pocillos con 1,5 ml de caldo MRS esterilizado por filtro (no esterilizado en autoclave) por pocillo y un antibiótico de selección apropiado.</li>
	<li>Incubar aeróbicamente durante 24 h durante la noche a 37 °C sin agitar. NOTA: Esta microplaca de almacenamiento debe conservarse para su uso en la sección 4 (PCR de colonias).</li>
	<li>L. reuteri se precipitará fuera de los medios cuando esté en la fase estacionaria; Resuspender el cultivo nocturno mediante pipeteo.</li>
	<li>Transfiera 200 μL a una placa plana, de fondo transparente y de 96 pocillos, transfiera la placa a un lector de placas y mida el OD y la fluorescencia de mCherry2 (excitación [Ej]: 589 nm; emisión [Em]: 610 nm) u otros reporteros relevantes.</li>
</ol>4. Confirmación de la captación de plásmidos mediante PCR de colonias
<ol><li>Desde la microplaca de almacenamiento de 96 pocillos de la sección 3, transfiera 5 μL a un tubo de PCR. NOTA: Si han pasado >5 minutos, puede ser necesario volver a suspender el L. reuteri por segunda vez.</li>
	<li>En una microcentrífuga portátil de sobremesa, gire hacia abajo hasta que se pueda ver el pellet (aproximadamente 2 min a 2,000 x g), deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 20 μL de NaOH de 20 mM.</li>
	<li>Hervir a 95 °C durante 5 min, vórtice, y repetir el hervor una segunda vez.</li>
	<li>Enfriar inmediatamente las muestras; trate de mantener las muestras en hielo tanto como sea posible en los siguientes pasos para reducir la probabilidad de degradación de la plantilla y la inhibición de la PCR.</li>
	<li>Girar en una microcentrífuga portátil de sobremesa a 2.000 x g durante 2 minutos hasta que los restos celulares estén granulados, luego tomar 1 μL del sobrenadante y diluir en 99 μL de ddH2O sin DNasa y RNasa heladas (dilución 100x).</li>
	<li>Utilice la dilución 100x como ADN plantilla en una reacción de PCR estándar utilizando cebadores específicos de plásmidos. Incluir un control positivo con un plásmido derivado de la mini-preparación de E. coli.</li>
	<li>Devuelva las muestras en hielo y agregue un tinte de carga apropiado a una concentración de 1x.</li>
	<li>Ejecutar en gel de agarosa al 1% en tampón TAE (ácido tris-acetato-etilendiaminotetraacético [EDTA]) a 110 V durante 30 min. Imagen si es necesario.</li>
</ol>5. Protocolo de mini-preparación para L. reuteri , seguido de PCR para confirmar la presencia de plásmidos
NOTA: Protocolo diseñado para su uso con el kit de mini-preparación que figura en la Tabla de materiales.
<ol><li>Inocular L. reuteri en 10 ml de caldo MRS que contenga un antibiótico apropiado e incubar aeróbicamente durante la noche a 37 °C en una incubadora estática.</li>
	<li>Centrifugadora a 5.000 g durante 10 min en una centrífuga preenfriada a 4 °C.</li>
	<li>Lave el pellet en 2 ml de tampón P1 estándar (incluido con el kit) para anular la acidez que pueda interferir con los pasos posteriores, centrifugar con la misma configuración descrita anteriormente y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el pellet en 250 μL de tampón P1 modificado que contenga 10 mg/ml de lisozima y 100 U/ml de mutanolisina para lisar las células bacterianas. Incubar durante 1-2 h a 37 °C.</li>
	<li>Añadir 250 μL de tampón P2, mezclar invirtiendo de cuatro a seis veces e incubar a RT durante no más de 5 min.</li>
	<li>Agregue 350 μL de tampón N3 (incluido con el kit) e invierta inmediatamente de cuatro a seis veces suavemente para mezclar.</li>
	<li>Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min.</li>
	<li>Transfiera la mayor cantidad posible de sobrenadante a una columna de centrifugado y centrífuga a 10.000 x g durante 60 s. Deseche el flujo a través.</li>
	<li>Lavar la columna de centrifugado con 500 μL de PB tampón (incluido con el kit) y centrifugar a 10.000 x g durante 60 s. Deseche el flujo a través.</li>
	<li>Lave la columna de centrifugado con 750 μL de PE tampón (incluido con el kit) y centrifugar a 10.000 x g durante 60 s. Deseche el flujo y centrifugar durante 60 s para eliminar cualquier tampón residual.</li>
	<li>Coloque la columna de centrifugado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Aplicar 20-30 μL deddH2Olibre de ADN y RNAsa al filtro de la columna de centrifugado y dejar actuar durante 1-2 min, antes de centrifugar a 10.000 x g durante 60 s.</li>
	<li>Realice una reacción de PCR estándar utilizando cebadores específicos de plásmidos (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), con eluido que proporciona el ADN modelo. Incluir un control positivo con un plásmido derivado de la mini-preparación de E. coli. NOTA: Los ajustes de PCR utilizados en este estudio son: 98 °C durante 5 min, (98 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s, 72 °C durante 45 s) 30 ciclos, 72 °C durante 2 min, 4 °C de retención. Los parámetros dependen en gran medida de la polimerasa utilizada, la longitud del fragmento y los cebadores exactos utilizados por cualquier persona que utilice este protocolo.</li>
</ol>

Medición de proteínas reporteras en Limosilactobacillus reuteri DSM20016

<ol><li>Makarova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the lactic acid bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taxonomic+note+on+the+genus+Lactobacillus%3A+Description+of+23+novel+genera%2C+emended+description+of+the+genus+Lactobacillus+beijerinck+1901%2C+and+union+of+Lactobacillaceae+and+Leuconostocaceae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).</li>
<li>Adams, M. R., Marteau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+safety+of+lactic+acid+bacteria+from+food%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">On the safety of lactic acid bacteria from food.</a> International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).</li>
<li>Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+with+meta-analysis%3A+Lactobacillus+reuteri+DSM+17938+for+diarrhoeal+diseases+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Alimentary+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children.</a> Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).</li>
<li>Jansson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+treatment+using+a+mix+of+three+Lactobacillus+strains+for+lumbar+spine+bone+loss+in+postmenopausal+women%3A+a+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+multicentre+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial.</a> The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+non-viable+Lactobacillus+reuteri+combining+with+14-day+standard+triple+therapy+on+Helicobacterpylori+eradication%3A+A+randomized+double-blind+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Helicobacter%22%5BJournal%5D)">Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial.</a> Helicobacter. 26 (6), 12856(2021).</li>
<li>Nikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+reuteri+in+bovine+milk+fermented+decreases+the+oral+carriage+of+mutans+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci.</a> International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).</li>
<li>Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+microflora+of+the+human+intestine%3A+Composition+and+succession%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Intestinal+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession.</a> Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).</li>
<li>Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Lactobacillus+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Lactobacillus by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).</li>
<li>Lubkowicz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+probiotic+Lactobacillus+reuteri+as+a+biosensor+for+Staphylococcus+aureus+derived+AIP-I+detection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).</li>
<li>Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbial+symbiosis+in+the+vertebrate+gastrointestinal+tract+and+the+Lactobacillus+reuteri+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).</li>
<li>Ahmad, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+bimodal+molecular+weight+levan+by+a+Lactobacillus+reuteri+isolate+from+fish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut.</a> Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).</li>
<li>MacKenzie, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+diversity+of+mucus-binding+proteins+in+the+adhesion+and+aggregation+properties+of+Lactobacillus+reuteri%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri.</a> Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).</li>
<li>Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-assisted+recombineering+in+Lactobacillus+reuteri%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri.</a> Nucleic Acids Research. 42 (17), 131(2014).</li>
<li>Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9D10A+nickase-assisted+genome+editing+in+Lactobacillus+casei%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259(2017).</li>
<li>Goh, Y. J., Barrangoua, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+CRISPR-Cas9N+system+for+flexible+genome+engineering+in+Lactobacillus+acidophilus%2C+Lactobacillus+gasseri%2C+and+Lactobacillus+paracasei%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669(2021).</li>
<li>Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+Lactobacillus+sake+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation.</a> Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).</li>
<li>Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glass+bead+transformation+method+for+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Glass bead transformation method for gram-positive bacteria.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923(2009).</li>
<li>Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+Lactobacillus+diolivorans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans.</a> FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).</li>
<li>Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cloning+in+Lactobacillus+plantarum%3A+Electroporation+with+non-methylated+plasmid+DNA+enhances+transformation+efficiency+and+makes+shuttle+vectors+obsolete%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete.</a> Microbial Cell Factories. 11, 141(2012).</li>
<li>Ortiz-Velez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+alterations+associated+with+improved+transformation+efficiency+in+Lactobacillus+reuteri%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri.</a> Microbial Cell Factories. 17 (1), 138(2018).</li>
<li>O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mini-prep+isolation+of+high-quality+plasmid+DNA+from+Lactococcus+and+Lactobacillus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp.</a> Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).</li>
<li>Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+expression+vectors+in+Lactobacillus+reuteri+strains%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains.</a> FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).</li>
<li>Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REBASE-a+database+for+DNA+restriction+and+modification%3A+Enzymes%2C+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).</li>
<li>Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Lactobacillus+reuteri+with+electroporation%3A+Studies+on+the+erythromycin+resistance+plasmid+pLUL631%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631.</a> Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).</li>
</ol>

No existen conflictos de intereses.

El paso más crítico para la transformación de L. reuteri DSM20016 es la generación de condiciones de crecimiento anaeróbico después de que las transformaciones son plateadas; Las colonias obtenidas en condiciones aeróbicas son muy ocasionales y generalmente no crecen cuando se inoculan en caldo MRS. También se debe practicar el recubrimiento de todo el volumen de recuperación para maximizar la probabilidad de crecimiento de la colonia. Incluso con estos dos pasos críticos, la eficiencia de la transformación sigu...

El género Lactobacillus se clasificó históricamente como grampositivo, en forma de bastoncillos, no formadores de esporas, anaerobios facultativos o microaerófilos que descomponen los azúcares para producir principalmente ácido láctico1. Estos criterios sueltos llevaron a Lactobacillus a ser, fenotípica y genotípicamente, un género extremadamente diverso. Esta amplia categorización dio lugar a la reclasificación del género, introduciendo 23 nuevos géneros en 20202.
El género antiguo, más amplio, incluía las principales especies comensales y probióticas generalmente consideradas seguras (GRAS) para el consumo3. La familia Lactobacillaceae mantiene una percepción pública de ser "bacterias buenas" debido a muchos beneficios para la salud reportados otorgados a través del consumo de varias cepas 4,5,6,7. La facilidad con la que pueden navegar por el tracto gastrointestinal8 y su aceptación pública se combinan para posicionar a las cepas de Lactobacillaceae como candidatos fuertes como organismos de chasis para aplicaciones medicinales, terapéuticas o de diagnóstico ingeribles.
La amplia gama de características presentes dentro de la familia Lactobacillaceae ha llevado a una situación en la que no existe una cepa de organismo modelo de facto; Los grupos de investigación han tendido a seleccionar las especies con las propiedades más relevantes para sus objetivos particulares. (Por ejemplo, los laboratorios de fermentación láctea podrían elegir L. lactis; los estudios de fermentación vegetal podrían seleccionar L. plantarum; la investigación sobre probióticos podría centrarse en L. acidophilus; y así sucesivamente).
Esta misma amplia gama de características entre especies ha llevado a una acumulación de protocolos y procedimientos que pueden funcionar bien para un subconjunto de la familia Lactobacillaceae , pero requieren optimización para funcionar eficientemente (o tal vez para funcionar en absoluto) en otros9. Esta necesidad de optimización entre los miembros de la familia e incluso dentro de los miembros de la misma especie puede frustrar los esfuerzos de investigadores desconocidos. Los protocolos publicados en las secciones de métodos de los documentos también pueden incluir sus propias modificaciones10, lo que lleva a colecciones de protocolos fragmentadas y descentralizadas.
L. reuteri se considera un comensal ampliamente vertebrado, que se encuentra consistentemente en los tractos gastrointestinales (GI) de mamíferos, aves11 y peces12. Las subcepas de L. reuteri a menudo están genéticamente especializadas, a través de la adaptación de proteínas de adhesión al moco, para colonizar de forma más permanente huéspedes nativos específicos 8,11,13. Las especies de Limosilactobacillus del tracto gastrointestinal pueden aislarse en huéspedes fuera de su huésped nativo, pero tienden más hacia una naturaleza transitoria8.
Debido a la especialización humano-huésped, L. reuteri se DSM20016 posiciona muy bien como un chasis para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas en cualquier punto del tracto gastrointestinal humano, y la DSM20016 de la cepa podría proporcionar una ventana de efecto más duradera para las intervenciones en comparación con cepas más transitorias.
En este documento, describimos una serie de protocolos con efectividad demostrada en Limosilactobacillus reuteri (designación de cepa: F275; otros números de colección: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), junto con información centralizada sobre la cepa de otras fuentes para ayudar en aplicaciones de biología molecular y de sistemas. Los procedimientos establecidos en este documento deben permitir a un investigador sin experiencia previa para cultivar L. reuteri, crear existencias electrocompetentes, seleccionar colonias transformadas, confirmar la transformación a través de la reacción en cadena de la polimerasa de colonias (PCR) y medir la respuesta del sistema diseñado a través de proteínas reporteras fluorescentes.
Observamos que los protocolos relacionados han cubierto la recombinación del genoma de ssDNA asistida por CRISPR-Cas9 en L. reuteri (cepa: ATCC-PTA-6475)14, y la edición del genoma asistida por nickasa CRSIPR-Cas9 en múltiples tinciones de la familia Lactobacillaceae no L. 15,16; sin embargo, estos no abordan la cepa de L. reuteri DSM20016 que es nuestro enfoque aquí.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3200L</td><td></td></tr><tr><td>1mL Cubetas de espectrofotómetro</td><td>Thomas Scientific</td><td>1145J12</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-15R (centrífuga refrigerada)</td><td>Beckman Allegra&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Ya no está en producción</td></tr><tr><td>AnaeroGen 2.5 L Sachet</td><td>Thermo Scientific</td><td>OXAN0025A</td><td></td></tr><tr><td>BTX, ECM 399 sistema de electroporación</td><td>VWR</td><td>58017-984</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (50 mL)</td><td>FroggaBio</td><td>TB50-500</td><td></td></tr><tr><td>DNA gel x6 colorante de carga</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación</td><td>Fisherbrand</td><td>FB101</td><td></td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Millipore Sigma</td><td>E5389-5G</td><td></td></tr><tr><td>Gel electroporación baño/muelle</td><td>VWR</td><td>76314-748</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Limosilactobacillus reuteri</td><td>Instituto Leibniz DSMZ</td><td>DSM20016</td><td>Designación de la cepa F275</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>BioShop</td><td>LYS702.5</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (1,7 mL)</td><td>FroggaBio</td><td>LMCT1.7B</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep kit (Qiagen)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>slpGFP reemplazado por un indicador mCherry2 constitutivo, optimizado para codones proteína&nbsp;</td></tr><tr><td>MRS Caldo (Deshidratado)</td><td>Thermo Scientific</td><td>CM0359B</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Millipore Sigma</td><td>M9901-5KU</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>1064691000</td><td></td></tr><tr><td>P100 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Pipeta Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>P2.5 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>FroggaBio</td><td>STF-A120S</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga personal de sobremesa</td><td>Genlantis</td><td>E200100</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>PTC-150 Termociclador</td><td>MJ Research</td><td>N/A</td><td>Ya no está en producción</td></tr><tr><td>pTRKH3_slpGFP (modificado)</td><td>Addgene</td><td>27168</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRONIC 200 Espectrofotómetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-281700</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de almacenamiento</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-225</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>BioShop</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>TAE Buffer 50x</td><td>Thermo Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td>Ya no está en producción</td></tr><tr><td>Incubadora VWR 1500E</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>Ya no está en producción</td></tr></tbody></table>

métodos para la electroporación y confirmación de transformación en limosilactobacillus reuteri dsm20016

Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Lactobacillus era un género increíblemente grande y diverso de bacterias que comprendía 261 especies, varias de las cuales eran cepas comensales con el potencial de su uso como chasis para esfuerzos biológicos sintéticos dentro del tracto gastrointestinal. La amplia variación fenotípica y genotípica observada dentro del género condujo a una reciente reclasificación y la introducción de 23 nuevos géneros.
Debido a la amplitud de las variaciones dentro de los géneros antiguos, los protocolos demostrados en un miembro pueden no funcionar como se anuncia con otros miembros. La falta de información centralizada sobre cómo manipular exactamente cepas específicas ha llevado a una serie de enfoques ad hoc , a menudo adaptados de otras familias bacterianas. Esto puede complicar las cosas para los investigadores que comienzan en el campo, que pueden no saber qué información se aplica o no a la cepa elegida.
En este documento, nuestro objetivo es centralizar un conjunto de protocolos con éxito demostrado, específicamente en la designación de cepa Limosilactobacillus reuteri F275 (otros números de colección: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), junto con consejos de solución de problemas y problemas comunes que uno puede encontrar. Estos protocolos deberían permitir a un investigador con poca o ninguna experiencia trabajando con L. reuteri DSM20016 transformar un plásmido, confirmar la transformación y medir la retroalimentación del sistema en un lector de placas a través de una proteína reportera.

Eficiencias de transformación L. reuteri no requiere un plásmido no metilado dcm-/dam, como se observa para otras Lactobacillaceae19,20 (ver Figura 1). La electroporación de L. reuteri DSM20016 con 10 μL del plásmido de 8,5 kb pTRKH3_mCherry2 (origen de replicación theta pAMβ1) debe dar eficiencias de transformación de aproximadamente 80 unidades formadoras de colon...

Aquí, presentamos protocolos para trabajar con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detallando el crecimiento, la transformación de plásmidos, la PCR de colonias, la medición de proteínas reporteras fluorescentes y la mini-preparación limitada de plásmidos, así como problemas comunes y solución de problemas. Estos protocolos permiten la medición de proteínas reporteras en DSM20016, o la confirmación a través de PCR de colonias si no hay ningún informador involucrado.

Métodos para la electroporación y confirmación de transformación en Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Lactobacillus were an incredibly large, diverse genus of bacteria comprising 261 species, several of which were commensal strains with the potential for ...

L.Reuteri, y específicamente la cepa, DSM20016 es un comensal intestinal humano robusto y natural, con una gran promesa para la administración terapéutica y la detección de enfermedades en todo el tracto gastrointestinal. Este trabajo ayudará a posicionar DSM20016 como un chasis de biología sintética para ese tipo de aplicaciones. Los lactobacilales no tienen un organismo modelo específico.Las especies preferidas existen, pero generalmente se eligen con un sesgo hacia objetivos de investigación particulares. La variación dentro de la familia bacteriana ha llevado a protocolos fragmentados, algunos con iteraciones de modificaciones que se remontan a través de publicaciones. Es muy difícil para las personas que comienzan filtrar exactamente lo que es y no es útil.Existe un documento para la transformación de DSM20016, pero no es moderno. Existen protocolos modernos para otros miembros de la familia Lactobacillales, pero no son DSM20016. Aquí nos esforzamos por proporcionar un conjunto de protocolos fácil de usar, centralizado, modernizado y completo para DSM20016 electroporación.Este conjunto de protocolos ofrece una modernización sustancial con respecto al protocolo de exploración D

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Estrategias de micobacterias patógenas siguen siendo poco conocidos. El lento crecimiento de la mayoría de las especies, la naturaleza impenetrable de la pared celular, y los riesgos de trabajar con agentes patógenos que las micobacterias difíciles de estudiar y son en gran parte responsable de nuestro pobre entendimiento de estos organismos. En este video vamos a demostrar la técnica de la electroporación, que consiste en someter las células a un breve impulso eléctrico de alta para permitir...

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Aquí se demuestra un protocolo sencillo para crear una biblioteca de mutantes al azar de una secuencia objetivo determinado. Se muestra cómo este método, que se realiza en vivo en Escherichia coli, se pueden acoplar con la selección funcional para desarrollar nuevas actividades enzimáticas.

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Fuente: Stefan, A., et al., Los beneficios multifacéticos de la coexpresión de proteínas en Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el procedimiento para transformar Escherichia coli con un plásmido portador de un gen de resistencia a los antibióticos, incluida la preparación celular, la electroporación, la recuperación y la selección de transformadores.

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Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

Aquí, describimos la construcción de mutantes nulos de Aeromonas en glicosiltransferasas específicas o regiones que contienen glicosiltransferasas, los ensayos de motilidad y la purificación de flagelos realizados para establecer la participación y función de sus enzimas codificadas en la biosíntesis de un glicano, así como el papel de este glicano en la patogénesis bacteriana.

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El presente protocolo describe nuevas herramientas para ensayos de unión a SPR para examinar la unión CV-N a HA, glicoproteína S, glicanos de tipo híbrido relacionados y oligosacáridos con alto contenido de manosa. SPR se utiliza para determinar el KD para la unión de CV-N dimérico o monomérico a estos glicanos.

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Aprende métodos de electroporación y confirmación de transformación en Limosilactobacillus reuteri DSM20016. Estos protocolos modernos facilitan la investigación en microbiología y biología sintética para aplicaciones terapéuticas.

Métodos para la electroporación y confirmación de transformación en Limosilactobacillus reuteri DSM20016

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