Métodos para la electroporación y confirmación de transformación en Limosilactobacillus reuteri DSM20016
June 23rd, 2023
Aquí, presentamos protocolos para trabajar con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detallando el crecimiento, la transformación de plásmidos, la PCR de colonias, la medición de proteínas reporteras fluorescentes y la mini-preparación limitada de plásmidos, así como problemas comunes y solución de problemas. Estos protocolos permiten la medición de proteínas reporteras en DSM20016, o la confirmación a través de PCR de colonias si no hay ningún informador involucrado.
L.Reuteri, y específicamente la cepa, DSM20016 es un comensal intestinal humano robusto y natural, con una gran promesa para la administración terapéutica y la detección de enfermedades en todo el tracto gastrointestinal. Este trabajo ayudará a posicionar DSM20016 como un chasis de biología sintética para ese tipo de aplicaciones. Los lactobacilales no tienen un organismo modelo específico.
Las especies preferidas existen, pero generalmente se eligen con un sesgo hacia objetivos de investigación particulares. La variación dentro de la familia bacteriana ha llevado a protocolos fragmentados, algunos con iteraciones de modificaciones que se remontan a través de publicaciones. Es muy difícil para las personas que comienzan filtrar exactamente lo que es y no es útil.
Existe un documento para la transformación de DSM20016, pero no es moderno. Existen protocolos modernos para otros miembros de la familia Lactobacillales, pero no son DSM20016. Aquí nos esforzamos por proporcionar un conjunto de protocolos fácil de usar, centralizado, modernizado y completo para DSM20016 electroporación.
Este conjunto de protocolos ofrece una modernización sustancial con respecto al protocolo de exploración DSM20016 anterior, y aclara algunos hilos colgantes, además de enfatizar partes que antes eran menos claras. El conjunto de protocolos también es completo, y específicamente para DSM20016, una cepa para la cual otros protocolos no DSM20016 no son totalmente compatibles. Uno de nuestros principales objetivos es utilizar microbios como sensores y sistemas de entrega de bajo costo.
Estamos trabajando con expertos en enfermedades intestinales para usar DSM20016 para detectar las condiciones en el tracto gastrointestinal y administrar terapias según sea necesario.
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Visión general
Este artículo presenta protocolos para trabajar con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, un comensal robusto del intestino humano. Los protocolos incluyen crecimiento, transformación de plásmidos, PCR de colonias y medición de proteínas reporteras fluorescentes.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Biología sintética
- Salud gastrointestinal
Antecedentes
- Limosilactobacillus reuteri DSM20016 es un comensal natural del intestino humano.
- Esta cepa muestra promesa para la entrega terapéutica y detección de enfermedades.
- Los protocolos en esta área a menudo están fragmentados y son difíciles de navegar.
- Los objetivos de investigación pueden sesgar la elección de especies bacterianas.
Propósito del estudio
- Proporcionar protocolos claros para trabajar con DSM20016.
- Facilitar la medición de proteínas reporteras y confirmación por PCR de colonias.
- Abordar problemas comunes y solución de problemas en los protocolos.
Métodos utilizados
- Crecimiento de Limosilactobacillus reuteri DSM20016.
- Técnicas de transformación de plásmidos.
- PCR de colonias para confirmación de modificaciones genéticas.
- Medición de proteínas reporteras fluorescentes.
Principales resultados
- Se establecieron protocolos exitosos de crecimiento y transformación.
- La PCR de colonias confirmó la presencia de los constructos genéticos deseados.
- Las proteínas reporteras fluorescentes se midieron eficazmente.
- Se proporcionaron pautas de solución de problemas para problemas comunes.
Conclusiones
- Los protocolos mejoran la usabilidad de DSM20016 en la investigación.
- Proporcionan una base para futuras aplicaciones de biología sintética.
- La orientación clara ayuda a los investigadores a navegar por la literatura fragmentada.
Preguntas frecuentes
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:04
Preparing Limosilactobacillus reuteri DSM20016 Electrocompetent Cells for Electroporation
5:27
Measurement of the Acid‐Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2
7:03
Confirmation of Plasmid Uptake via Colony PCR
8:45
Mini‐Prep Protocol for Limosilactobacillus reuteri and Confirmation of Plasmid Presence by PCR
