Name: Análisis de flujo de doble reportero basado en perlas fluorescentes magnéticas del bloqueo de anticuerpos inducidos por la vacuna del péptido PDL1-Vaxx de la interacción PD-1/PD-L1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprende a analizar el bloqueo de anticuerpos inducidos por la vacuna PDL1-Vaxx mediante un ensayo de perlas fluorescentes magnéticas y citometría de flujo dual. Este método evalúa la interacción PD-1/PD-L1 para desarrollar terapias inmunológicas contra el cáncer.

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Los autores agradecen a Sherry Dunbar PhD, MBA de Luminex Corporation (Austin, TX) por su apoyo a la investigación y a Matthew Silverman PhD de Biomedical Publishing Solutions (Ciudad de Panamá, FL; mattsilver@yahoo.com) por su asistencia científica y de redacción. Este trabajo fue apoyado por premios a Pravin T. P. Kaumaya de los Institutos Nacionales de Salud (R21 CA13508 y R01 CA84356) e Imugene Ltd, Sydney, Australia (OSU 900600, GR110567 y GR124326).

Análisis de flujo del bloqueo de anticuerpos PDL1-VAXX mediante perlas fluorescentes magnéticas

<ol><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines%3A+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li>
<li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1%2C+PD-L1+and+CTLA-4%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335(2022).</li>
<li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB%2Fc+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+%28cynomolgus+monkeys%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566(2022).</li>
<li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab%3A+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li>
<li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paradigm+shift%3A+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types%3A+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li>
<li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+%28PD1-Vaxx%29+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA%3A+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li>
<li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li>
<li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+HER-2%2Fneu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li>
<li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric%2C+human+epidermal+growth+factor+receptor+2%2C+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and%2For+recurrent+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li>
<li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li>
<li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+%28PD1-Vaxx%29+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab%2Fpertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+%28B-Vaxx%29+in+a+syngeneic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437(2020).</li>
<li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+%28PDL1-Vaxx%29+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+%28synergizes%29+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+%28B-Vaxx%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691(2022).</li>
<li>Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. Luminex Corporation. The xMAP® Cookbook, 5th edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022).</li>
<li>MagPlex® Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%22">Estimation of cell number by hemocytometry counting</a>. 2019 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
<li>Gibbs, J., Vessels, M., Rothenberg, M. Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019).</li>
</ol>

Pravin T.P. Kaumaya es consultor de Imugene, Ltd.

El propósito de la inmunoterapia contra el cáncer relacionada con puntos de control es interrumpir la interacción entre las proteínas de puntos de control y sus ligandos importantes en la supervivencia y progresión del tumor2. Este grupo de investigación está desarrollando activamente nuevas vacunas PD-1 y PD-L1 que provocan una respuesta de anticuerpos que se dirige e interrumpe el punto de control PD-1/PD-L1 3,8,13,14. Anteriormente, se realizaron dos variaciones de ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para evaluar los efectos de los anticuerpos anti-péptido PDL1 en la inhibición de la interacción recombinante PD1/PD-L114. (1) En la primera variante, rhPD-L1 se recubrió en una placa de microtitulación y, a continuación, la placa se incubó con anticuerpos diluidos inducidos por el candidato a vacuna anti-PDL1. A continuación, se evaluó la inhibición de la interacción PD-1/PD-L1 recombinante por parte de los anticuerpos mediante la adición de rhPD-1 biotinilado y la cuantificación de la unión al rhPD-L1 inmovilizado utilizando un conjugado estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y un sustrato colorimétrico. Lo definimos como el ensayo de bloqueo directo. (2) En la segunda variante, PD-1 se recubrió en la placa de microtitulación. La rhPD-L1 biotinilada se preincubó con cada uno de los anticuerpos policlonales inducidos por el candidato anti-PLD1 en tubos de reacción separados. A continuación, se añadieron las mezclas rhPDL1/anti-PDL1 a los pocillos de placa que contenían rhPD-1 inmovilizado y se les permitió reaccionar. Cualquier rhPDL1 que reaccionara con el rhPD-1 inmovilizado en presencia de los anticuerpos inducidos por PDL1-Vaxx potencialmente bloqueantes se detectó con la posterior incubación de estreptavidina-HRP y sustrato colorimétrico. Lo definimos como el ensayo de bloqueo inverso.
El bloqueo inverso de la interacción recombinante PD-1/PD-L1 por anticuerpos anti-péptido PDL1 mostró inhibición de la señal (es decir, bloqueo de PD-1/PD-L1) de forma dependiente de la concentración de anticuerpos14, mientras que el enfoque de bloqueo directo no proporcionó resultados consistentes (no mostrado). El ensayo de bloqueo de doble reportero basado en perlas se desarrolló para verificar los resultados de ELISA e investigar el bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 en una fase fluida, lo que elimina los posibles problemas de disponibilidad de epítopos de unión / obstáculo estérico asociados con la inmovilización de proteínas recombinantes en fondos de pozos. El análisis de microesferas se correlacionó directamente con los resultados de bloqueo de ELISA mediante el ensayo de bloqueo inverso (Figura 2). Además, los inmunoensayos basados en fluorescencia pueden proporcionar una sensibilidad mejorada del ensayo y un rango dinámico ampliado en comparación con los ELISA colorimétricos18 y, además, el ensayo basado en perlas multiplexadas permite la realización simultánea de dos inmunoensayos independientes dentro de una sola reacción. El sulfo-NHS y el EDC utilizados para el acoplamiento covalente de las microesferas a rhPD-1 podrían haber dado lugar a las diferencias de rendimiento observadas entre los ensayos de bloqueo directo y bloqueo inverso y las diferencias observadas en la sensibilidad entre los ensayos de interacción PD-1/PD-L1 recombinante basados en perlas de ELISA y Luminex. Se justifica una mayor investigación a nivel químico y molecular para estudiar los posibles mecanismos responsables de estas diferencias.
Tanto el ELISA14 como los ensayos basados en perlas demuestran que los anticuerpos anti-PDL1 inducidos por PDL1-Vaxx pueden inhibir la formación del complejo de puntos de control PD1/PD-L1. El PDL1-Vaxx basado en péptidos induce con éxito anticuerpos anti-PDL1 que pueden bloquear la interacción PD-1/PD-L1. Este enfoque puede servir como una estrategia terapéutica novedosa para el tratamiento del cáncer, como lo respaldan los estudios preclínicos en animales 3,13,14. Los ensayos clínicos planificados determinarán la eficacia de la PDL1-Vaxx para la inmunoterapia de puntos de control y el control de la enfermedad en pacientes con cáncer.

En las células T, las células B y los puntos de control intracelulares del sistema inmunitario, las vías de señalización regulan las actividades inmunitarias. Algunas células cancerosas se protegen del ataque inmunitario estimulando los objetivos de los puntos de control, que inhiben la función inmunitaria y promueven la supervivencia y proliferación neoplásica. La inmunoterapia oncológica por inhibición de puntos de control utiliza anticuerpos para atacar y bloquear los puntos de control de señalización y, por lo tanto, restaurar las funciones antineoplásicas del sistema inmune 1,2,3. En la actualidad, las terapias anticancerígenas altamente efectivas incluyen los anticuerpos monoclonales nivolumab, que se dirige a la proteína de muerte programada 1 (PD-1)4, y el atezolizumab, que se dirige al ligando de muerte programada 1 (PD-L1)5. Este enfoque ha demostrado un gran éxito clínico en el tratamiento de pacientes con cáncer. Sin embargo, la utilidad clínica de las estrategias actuales de inhibición de puntos de control se ve mitigada por los eventos adversos y la resistencia al tratamiento, especialmente en la terapia con un solo agente6. Se necesita urgentemente una combinación de inmunoterapia y estrategias terapéuticas más efectivas con menor toxicidad en el tratamiento del cáncer 1,3,6.
Durante los últimos 30 años, el laboratorio del Dr. Kaumaya ha desarrollado vacunas contra el cáncer de péptidos y agentes relacionados con la imitación de péptidos para la terapia del cáncer, algunos de los cuales se encuentran en ensayos clínicos en curso 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . Por ejemplo, B-Vaxx con inmunoterapia combinada HER-2 ha demostrado beneficios para los pacientes contra tumores sólidos metastásicos y/o recurrentes en ensayos clínicos12. Las últimas vacunas contra el cáncer del laboratorio son PD1-Vaxx 2,13 y PDL1-Vaxx14, que han mostrado grandes ventajas en estudios preclínicos, especialmente en tratamientos combinados. El PD1-Vaxx ha completado ensayos clínicos de aumento de dosis en EE. UU. y Australia. El PD1-Vaxx se combinará con atezolizumab en el ensayo de fase 1b que comenzará en mayo de 2023. Este informe se centra en la evaluación de la capacidad de los anticuerpos inducidos por PDL1-Vaxx para bloquear la interacción PD-1/PD-L1.
La vacuna contra el cáncer PDL1-Vaxx es una nueva vacuna epítopo peptídica de células B con aminoácidos PD-L1 130-147 unidos al péptido promiscuo de fusión del virus del sarampión (MVF) de células T a través de un enlazador de péptidos GPSL. Los estudios preclínicos han demostrado que PDL1-Vaxx es altamente inmunogénico para estimular la producción de anticuerpos anticancerígenos en varios modelos animales, prolongar la supervivencia y reducir la carga tumoral14. Estos anticuerpos generados contra el péptido PD-L1 pueden bloquear con éxito la interacción PD1/PD-L1, lo que resulta en actividad antineoplásica. Este informe presenta un ensayo que analiza el bloqueo de la formación del complejo PD1/PD-L1 por anticuerpos inducidos por PDL1-Vapex utilizando un formato basado en perlas magnéticas con una lectura de doble reportero en un instrumento de citometría de flujo.

<table><tbody><tr><td><tampones > fuerte</</td>tampón > activación: 0,1 m NaH2PO4, pH 6,2 Millipore/Sigma S3139 Tampón de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> ensayo/lavado: PBS-TBN (1x PBS, pH 7,4 + 0,1 % BSA + 0,05 % (v/v) Tween-20; 0,05 % NaN3)Millipore/Sigma P3563 (PBS+Tween20),<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> A7888 (albúmina sérica bovina), S8032 (azida sódica)</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de acoplamiento: 50 mM Ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES), pH 5.0</td><td>MilliporeSigma&nbsp;</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td><Reactivos > acoplamiento fuerte<></td><td></td><td></td><td></td>/</tr><tr><td>1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]clorhidrato de carbodiimida (EDC)</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>77149</td><td></td></tr><tr><td>Kit de acoplamiento de anticuerpos xMAP (si lo desea), incluye:</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (Austin, TX)</td><td>40-50016</td><td></td></tr><tr><td>EDC, 10 mg&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solución sNHS, 250 y micro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de activación/acoplamiento: 0,1 m Ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES), pH 6,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lavado: 1x PBS, pH 7,4 + 0,1% BSA + 0,05 % (v/v) Tween-20; 0,05% NaN3 (PBS-TBN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentación y suministros auxiliares de laboratorio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>xMAP INTELLIFLEX (instrumento de doble reportero)</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (Austin, TX)</td><td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos de fondo redondo de baja unión a proteínas</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>07-200-761</td><td></td></tr><tr><td>Separador de placa magnética Luminex (o comparable)&nbsp;</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (Austin, TX)</td><td>CN-0269-01</td><td></td></tr><tr><td>Separador de tubo magnético Luminex (o comparable)</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (Austin, TX)</td><td>CN-0288-01</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas MagPlex (magnéticas, fluorescentes, 6.5-y micro; cuentas de diámetro m)</td><td>Luminex Corp.&nbsp; (Austin, TX)</td><td>MC-1**** (varía según la etiqueta de la perla)</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Protein LoBind</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td><Péptidos>fuertes, anticuerpos, & Reactivos de detección</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atezolizumab (anticuerpo monoclonal humanizado anti-PDL1 IgG1), control positivo</td><td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td><td>n/a (medicamentos recetados)</td><td></td></tr><tr><td>PDL1 humano recombinante biotinilado&nbsp;</td><td>Sino Biological (Wayne, PA)</td><td>10084-H49H-B</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421-congugado burro anti-humano IgG</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td><td>709-675-149</td><td></td></tr><tr><td>Brillante Violeta 421-conguligado burro anti-conejo IgG</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td><td>711-675-152</td><td></td></tr><tr><td>PD-1 humano recombinante (polihistidina marcada)</td><td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td><td>PD1-H5256&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>R-ficoeritrina conjugada con estreptavidina (SAPE)</td><td>Agilent (Santa Clara, CA)</td><td>PJRS34-1</td><td></td></tr><tr><td>Trastuzumab (Herceptin, anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado), control negativo</td><td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td><td>n/a (medicamentos recetados)</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de flujo de doble reportero basado en perlas fluorescentes magnéticas del bloqueo de anticuerpos inducidos por la vacuna del péptido pdl1-vaxx de la interacción pd-1/pd-l1

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

La inhibición de los receptores de puntos de control (PD-1, PD-L1 y CTLA-4) con anticuerpos monoclonales ha mostrado un gran beneficio en ensayos clínicos para el tratamiento de pacientes con cáncer y se ha convertido en un enfoque fundamental en la inmunoterapia moderna contra el cáncer. Sin embargo, solo un subgrupo de pacientes responde a la inmunoterapia con anticuerpos monoclonales de punto de control. Por lo tanto, es urgente desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra el cáncer. Se ha desarrollado una nueva vacuna contra el cáncer con el epítopo peptídico de células B PDL1 (ligando de muerte programada 1), con los aminoácidos 130-147 unidos al péptido MVF (proteína de fusión del virus del sarampión de células T "promiscuas") a través de un enlazador GPSL. Las pruebas preclínicas han indicado que esta vacuna PDL1 (PDL1-Vaxx) estimula eficazmente los anticuerpos altamente inmunogénicos en animales. Los animales inmunizados con PDL1-Vaxx muestran una carga tumoral reducida y tasas de supervivencia extendidas en varios modelos de cáncer animal. Los mecanismos de acción indican que los anticuerpos provocados por la vacuna inhiben la proliferación de células tumorales, inducen la apoptosis y bloquean la interacción PD-1/PD-L1. Este manuscrito presenta un ensayo basado en perlas magnéticas que utiliza un sistema de análisis de flujo de doble reportero para evaluar la interacción PD-1/PD-L1 y su bloqueo por los anticuerpos anti-PDL1 levantados contra PDL1-Vaxx.

El ensayo fue capaz de cuantificar con precisión la inhibición de la interacción PD-1/PD-L1 por cuatro anticuerpos policlonales únicos, generados contra los péptidos de la vacuna rhPD-L1, que se están explorando como posibles agentes terapéuticos contra el cáncer. El esquema de este ensayo se proporciona en la Figura 1. La cantidad de rhPD-L1 biotinilada que se unió a las perlas conjugadas con rhPD-1 y la inhibición de esta unión por los cuatro candidatos a anticuerpos inducidos por PLD1-Vaxx se midió en Reporter Channel 1 utilizando un reactivo de detección de estreptavidina-PE que se unió directamente a rhPD-L1 (Figura 2).
Los cuatro anticuerpos policlonales anti-péptido PDL1 bloquearon la interacción de rhPD-L1 con PD-1 que había sido inmovilizada en microesferas en grados variables. El porcentaje de inhibición de los diferentes anticuerpos anti-péptidos PDL1 osciló entre el 48% y el 74% a la concentración máxima ensayada de 1.000 μg/mL. El anticuerpo monoclonal de control positivo atezolizumab logró un bloqueo del 92% de la interacción PD-1/PD-L1 a la concentración máxima probada14 de 4 μg/mL (Figura 2). Todos los anticuerpos experimentales PDL1-Vaxx mostraron una inhibición dependiente de la concentración de la unión de rhPD-L1 a las perlas conjugadas de rhPD-1 en comparación con trastuzumab, el anticuerpo de control negativo que no se esperaba que interactuara con el sistema PD-1/PD-L1.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> Figura 2: Bloqueo de la interacción de rhPD-L1 con rhPD-1 acoplado a perlas magnéticas por anticuerpos anti-péptido PDL1, como se muestra en un nuevo inmunoensayo basado en perlas fluorescentes. La PD-1 humana recombinante se acopló a microesferas magnéticas, y las perlas se incubaron con rhPD-L1 biotinilado que había sido preincubado con diferentes anticuerpos anti-péptido PDL1. Se utilizó un reactivo de detección de estreptavidina-ficoeritrina para unir la biotina y, por lo tanto, evaluar la cantidad relativa de rhPD-L1 que estaba disponible para unirse a PD-1. Se probaron anticuerpos policlonales criados en conejos contra las vacunas peptídicas PDL1 (anti-PDL1[36], anti-PDL1[50], anti-PDL1[95] y anti-PDL1[130]) para determinar su actividad inhibitoria y mostraron un bloqueo del 48%-74% de las interacciones recombinantes PD-1/PD-L1 en la concentración más alta probada. Se utilizó atezolizumab (un anticuerpo monoclonal anti-PDL1 diferente) como control positivo. El anticuerpo monoclonal comercial trastuzumab (anti-HER2) no relacionado se utilizó como control negativo. Esta figura es una adaptación de Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> Figura 3: Comparativa de la unión de diferentes anticuerpos inducidos por PDL1-Vaxx a rhPD-L1 complejados con perlas magnéticas recubiertas de rhPD1. Se utilizó un anticuerpo de detección secundaria conjugado con 421 violeta brillante para comparar la unión de diferentes anticuerpos policlonales anti-péptido PDL1 de conejo a rhPD-L1 a través de perlas recubiertas de rhPD-1. La señal de fluorescencia azul BV421 se registró en el canal 2 del instrumento de doble reportero; esta señal se correlaciona con la eficiencia de unión relativa de los anticuerpos experimentales anti-péptido PDL1. Trastezumab (anti-HER2), un anticuerpo monoclonal que se dirige a un punto de control diferente al de PD-1/PD-L1, se utilizó como control negativo. MFI representa la intensidad media media de fluorescencia de las perlas, que se midió en pocillos de reacción duplicados por condición. Esta figura es una adaptación de Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se compararon las capacidades relativas de los cuatro anticuerpos candidatos experimentales inducidos por PDL1-Vaxx para unirse a rhPD-L1 utilizando un sistema de detección separado (IgG anti-conejo conjugada BV421) que se evaluó en el segundo canal reportero del instrumento. Estos resultados indicaron que los cuatro anticuerpos policlonales anti-péptido PDL1 se unieron a rhPD-L1 de una manera dependiente de la concentración14 (Figura 3). El anticuerpo anti-PDL1(130) mostró la señal de unión a rhPDL1 más alta de los cuatro candidatos a anticuerpos inducidos por PDL1-Vaxx.

Los inhibidores de puntos de control son objetivos importantes en el desarrollo de terapias para la batalla contra el cáncer. Este informe presenta una nueva vacuna contra el cáncer basada en péptidos PDL1, PDL1-Vaxx, que induce la producción de anticuerpos policlonales neutralizantes que bloquean la formación del complejo PD-1/PDL1. Este trabajo también detalla el desarrollo y prueba de un ensayo basado en perlas fluorescentes para analizar esta actividad.

Análisis de flujo de doble reportero basado en perlas fluorescentes magnéticas del bloqueo de anticuerpos inducidos por la vacuna del péptido PDL1-Vaxx de la interacción PD-1/PD-L1

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

Nuestro proyecto, dirigido por el profesor Pravin Kaumaya, se centra en el desarrollo de vacunas de péptidos epítopos de células B que puedan utilizarse para estimular el sistema inmunitario y luchar mejor contra el cáncer. Creemos que las vacunas peptídicas dirigidas a objetivos de puntos de control inmunitario pueden incluso combinarse con otras terapias para mejorar los resultados de los pacientes. Queríamos probar la capacidad de bloqueo de nuestros anticuerpos anti PD-L1 en un ensayo tradicional de microperlas en el que la proteína PD-L1 recombinante humana se unía a perlas MagPlex.Encontramos que, una vez que el PD-L1 se unió a las perlas, éstas tenían una baja capacidad de unión para su ligando PD-1. Esto nos impidió utilizar esta vía de bloqueo de pruebas. Cuando la unión de la proteína a las perlas inhibe la unión al ligando o a los anticuerpos, el pretratamiento con los anticuerpos de prueba en solución es una opción, añadiendo posteriormente perlas recubiertas de ligando a la mezcla de bloqueadores diana.Su interacción puede ser examinada. Este puede ser un camino diferente para estudiar la misma interacción diana-ligando-unión Hemos desarrollado vacunas contra el cáncer B-Vaxx, PD1-Vaxx, PDL1-Vaxx y CTLA4-Vaxx. Estas vacunas se dirigen al HER2 y varios marcadores de puntos de control inmunitario están implicados en diversas formas de cáncer.B-Vaxx y PD1-Vaxx se encuentran en ensayos clínicos en curso en Australia y EE. UU. Esperamos que nuestras vacunas de punto de control inmunitario beneficien a más pacientes. En experimentos previos con microesferas, encontramos que PD-1 interactuaba bien con su ligando PD-L1. Por lo tanto, rediseñamos el protocolo, preuniendo los anticuerpos del péptido anti-PD-L1 a la proteína PD-L1 biotinilada antes de agregar las perlas MagPlex marcadas con PD-1.Esto nos permitió probar nuestra capacidad de anticuerpos para bloquear la interacción PD-1/PD-L1. Seguiremos centrándonos en las inmunoterapias combinadas que superen la resistencia al tratamiento. También queremos explorar terapias combinadas más efectivas que inhiban mejor el crecimiento tumoral, prevengan la metástasis y prolonguen las tasas de supervivencia de los pacientes.

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En este video, demostramos una técnica para realizar la co-inmunoprecipitación de proteínas PD-1 mutadas y de tipo salvaje marcadas con GFP utilizando perlas recubiertas con anticuerpos anti-GFP. Las proteínas PD-1-GFP unidas a perlas se incuban con proteínas SHP2 que interactúan con PD-1, lo que permite la identificación de motivos estructurales específicos en PD-1 que desempeñan un papel fundamental en la interacción de SHP2.

Ensayo de inmunoprecipitación para estudiar las interacciones entre receptores enzimáticos y células transfectadas

Análisis citométrico de flujo de Complementación fluorescencia bimolecular proporciona un método cuantitativo de alto rendimiento para estudiar la interacción proteína-proteína. Esta metodología se puede aplicar a los sitios de unión de proteínas y de mapeo para los factores que regulan la interacción proteína-proteína de cribado.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Describimos técnicas basadas en imágenes de animales enteros y citometría de flujo para monitorear la expansión de las células T CD8+ específicas de antígeno en respuesta a la inmunización con nanopartículas en un modelo murino de vacunación.

Imaging Whole-animal y de citometría de flujo Las técnicas para T CD8 + respuestas celulares Análisis de antígeno-específicos después de nanopartículas Vacunación

Aquí, presentamos un protocolo de co-inmunoprecipitación y un ensayo de actividad enzimática en el grano al mismo tiempo estudiar la contribución de los dominios de la proteína específica de los receptores de la membrana plasmática para reclutamiento de la enzima y la actividad enzimática.

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Desarrollamos un ensayo de citometría de flujo simple para evaluar la unión de los anticuerpos de bloqueo de PD-1 a los células T, que requieren sólo una gota de sangre periférica de los pacientes con cáncer.

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Se utilizó un sistema de análisis de flujo para ensayos multiplexados basados en perlas que proporciona una lectura de dos reporteros para el desarrollo de ensayos serológicos multiplex y de neutralización de anticuerpos que pueden medir simultáneamente anticuerpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

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Este protocolo describe un ensayo de bloqueo para inhibidores de PD-1/PD-L1 utilizando tecnología de resonancia de plasmón de superficie. Emplea una estrategia de inmovilización de dos pasos y un sistema de amortiguación personalizado para medir con precisión las unidades de respuesta, lo que facilita la evaluación de las tasas de bloqueo de compuestos o productos biológicos. Además, admite la identificación de alto rendimiento de inhibidores de PD-1/PD-L1.

Identificación de inhibidores de PD-1/PD-L1 con tecnología de resonancia de plasmón de superficie

Selectivamente la etiqueta fluorescente GnRH-I, II y III Los derivados son instrumentos fiables para el seguimiento y la cuantificación de la captación celular. Este manuscrito introduce experimentos para visualizar, cuantificar y comparar la eficiencia de absorción de estos conjugados de GnRH en diversas líneas celulares.

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Análisis de flujo de doble reportero basado en perlas fluorescentes magnéticas del bloqueo de anticuerpos inducidos por la vacuna del péptido PDL1-Vaxx de la interacción PD-1/PD-L1 (Video) | JoVE Journal

Análisis de flujo de doble reportero basado en perlas fluorescentes magnéticas del bloqueo de anticuerpos inducidos por la vacuna del péptido PDL1-Vaxx de la interacción PD-1/PD-L1

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