Inmunofluorescencia dual de γH2AX y 53BP1 en linfocitos periféricos humanos
14 de julio de 2023
Este protocolo presenta un método para evaluar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante la detección simultánea de focos γH2AX y 53BP1 en núcleos interfase de linfocitos periféricos humanos tratados con bleomicina.
El objetivo de este manuscrito fue evaluar la idoneidad de la cuantificación simultánea de focos Gamma H2AX y 53BP1 para evaluar el daño genómico inducido en linfocitos periféricos humanos por bleomicina. Varios factores pueden causar roturas de doble hebra. Por lo tanto, las células cuentan con varios mecanismos de reparación, que involucran tanto a Gamma H2AX como a la proteína de unión 53 1, que pueden colocalizarse cerca de la rotura de doble cadena.
Después de recolectar muestras de sangre entera, agregue 300 microlitros de muestra a un tubo que contenga 4.7 mililitros de medio completo. Luego agregue cinco microgramos por mililitro de concentración final de sulfato de bleomicina. Para cada muestra, configure un control negativo.
Coloque el tubo en un termostato a 37 grados centígrados durante dos horas. Centrifugar muestras a 540 G durante cinco minutos. Luego agregue cinco mililitros de solución hipotónica al pellet.
Luego agregue 400 microlitros de solución prefijadora para causar hemólisis. Centrifugar muestras a 540 G durante cinco minutos, luego resuspender el pellet en cinco mililitros de metanol a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para fijar las células. Centrifugar muestras a 540 G durante cinco minutos, luego resuspender el pellet en cinco mililitros de solución fijadora.
Repita este paso una vez más. Centrifugar de nuevo a 540 G durante cinco minutos, luego aspirar el sobrenadante dejando suficiente solución para resuspender el pellet. Deje caer el pellet de celda resuspendida en los portaobjetos.
Preparar las dos soluciones que contienen los anticuerpos primarios anti-Gamma H2AX y anti-53BP1 disueltos en solución de bloqueo. Luego lave las diapositivas dos veces en PBS 1X. Luego mantenga las diapositivas durante 30 minutos en solución de bloqueo.
Añadir a cada portaobjetos 10 microlitros de cada una de las dos soluciones que contienen los anticuerpos primarios disueltos en solución bloqueante. Cubra las diapositivas con parafilm. Incubar a cuatro grados centígrados durante la noche.
Después de la incubación, realice tres lavados en PBS 1X durante cinco minutos. Prepare las dos soluciones que contienen los anticuerpos secundarios DyLight 488 y Alexa Fluor 568 disueltos en solución de bloqueo. Luego agregue a cada portaobjetos 10 microlitros de cada una de las dos soluciones que contienen los anticuerpos secundarios disueltos en solución de bloqueo.
Cubra los portaobjetos con parafilm e incubar a temperatura ambiente durante dos horas. Después de esta segunda incubación, realice tres lavados en PBS 1X durante cinco minutos. Agregue 2,5 microlitros de solución Antifade con DAPI en los cubreobjetos antes del montaje para contrarrestar las manchas de los núcleos.
Para evaluar la cinética de los focos, el procedimiento es el mismo que ahora se describe. La última fase es la observación y cuantificación de focos. Los linfocitos humanos sin focos Gamma H2AX y 53BP1 se muestran en A, en B y en C, se muestran linfocitos humanos con diferentes cantidades de focos Gamma H2AX y 53BP1.
Se observa un bajo nivel de colocalización de focos. Como era de esperar, se observa una frecuencia muy alta de focos Gamma H2AX y 53BP1 entre las células no tratadas no tratadas. Además, se observa una gran diferencia en el número de focos de los dos marcadores.
El curso temporal de los focos Gamma H2AX y 53BP1 a lo largo del tiempo mostró un comportamiento diferente aunque contribuyen a la misma función. El análisis de focos gamma H2AX y 53BP1 tiene la capacidad de evaluar la respuesta celular en contextos de exposición o patológicos. Sin embargo, la inmunofluorescencia dual Gamma H2AX y 53BP1 puede llevar a subestimar la verdadera frecuencia del evento.
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Descripción general
Este protocolo presenta un método para evaluar la formación y reparación de roturas de doble cadena en el ADN mediante la detección simultánea de focos de γH2AX y 53BP1 en núcleos en interfase de linfocitos periféricos humanos tratados con bleomicina.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Genómica
Antecedentes
- Los cortes de doble cadena pueden ser inducidos por diversos factores.
- Las células poseen múltiples mecanismos de reparación para el daño del ADN.
- γH2AX y 53BP1 son proteínas clave implicadas en la reparación del ADN.
- La co-localización de estas proteínas ocurre cerca de los cortes de doble cadena.
Objetivo del estudio
- Evaluar la idoneidad de la cuantificación simultánea de focos de γH2AX y 53BP1.
- Evaluar el daño genómico en linfocitos periféricos humanos.
- Comprender los efectos de la bleomicina sobre la integridad del ADN.
Métodos Utilizados
- Se recolectan muestras de sangre completa de sujetos humanos.
- Las muestras se tratan con sulfato de bleomicina.
- Se establecen controles negativos para su comparación.
- Se realiza la detección de focos de γH2AX y 53BP1 en núcleos en interfase.
Resultados Principales
- Es factible la detección simultánea de focos de γH2AX y 53BP1.
- El tratamiento con bleomicina provoca daño en el ADN medible.
- La cuantificación de los focos se correlaciona con la magnitud del daño genómico.
- Los resultados respaldan el uso de este método para evaluar los mecanismos de reparación del ADN.
Conclusiones
- El protocolo evalúa eficazmente la formación y reparación de roturas de doble cadena en el ADN.
- La detección simultánea de γH2AX y 53BP1 proporciona información valiosa.
- Este método puede aplicarse a diversos estudios sobre daño y reparación del ADN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección cuantitativa de los marcadores de roturas de doble cadena del ADN (DSB), γH2AX y 53BP1, en linfocitos humanos permite una evaluación precisa del daño genómico y de la cinética de reparación. Este enfoque de inmunofluorescencia dual fortalece la confianza predictiva en la detección temprana de genotoxicidad y en la reducción mecanicista de riesgos para compuestos candidatos. La integración de estos parámetros en la etapa de descubrimiento apoya decisiones de cartera ajustadas al riesgo y la continuidad traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de las vías de respuesta al daño del ADN en células humanas.
- Apoya la reducción mecanicista de riesgos mediante la cuantificación de la inducción de roturas de doble cadena y la cinética de reparación.
- Facilita la validación funcional de dianas implicadas en la estabilidad del genoma.
- Mejora la confianza predictiva respecto a las toxicidades genéticas en compuestos líderes.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un sistema validado para cuantificar marcadores de daño del ADN en células humanas primarias.
- Permite lecturas cuantitativas y reproducibles de roturas de doble cadena inducidas por compuestos.
- Apoya la estandarización de ensayos para la selección de alto contenido de moduladores del daño del ADN.
- Facilita la evaluación confiable de los perfiles de seguridad de compuestos en fases tempranas de cribado.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relaciona la cuantificación del marcador de daño en el ADN con estrategias de biomarcadores traslacionales.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento in vitro hasta la evaluación preclínica de seguridad.
- Permite el avance ajustado al riesgo de candidatos con perfiles favorables de reparación del ADN.
- Proporciona una comprensión mecanicista de las respuestas celulares relevantes para la enfermedad y el tratamiento.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de inmunofluorescencia dual se sitúa dentro del continuo desde el descubrimiento temprano hasta la fase preclínica, permitiendo la evaluación basada en hipótesis del daño y la reparación del ADN en linfocitos humanos.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica los focos de marcadores de roturas de doble cadena (DSB) para aclarar la participación de las vías de reparación del ADN y la desactivación de riesgos biológicos.
- Screening: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para el perfilado de genotoxicidad de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones a lo largo del tiempo de los focos de γH2AX y 53BP1 para análisis comparativo.
- Investigación Traslacional: Conecta hallazgos in vitro con estrategias preclínicas de biomarcadores para la respuesta al daño del ADN.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la evaluación del daño en el ADN en diversos programas de descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la evaluación del daño al ADN.
- Valor operativo: Estandariza la cuantificación de marcadores de roturas de doble cadena para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas de genotoxicidad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en perfiles de reparación del ADN.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de inmunofluorescencia y análisis cuantitativo de imágenes.
- Necesita acceso a anticuerpos validados e infraestructura para imágenes de fluorescencia.
- Exige la estandarización entre equipos en los protocolos de preparación de muestras y cuantificación.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes tipos celulares o sistemas modelo.
- Posible subestimación de la frecuencia real de roturas de doble cadena debido a limitaciones en la co-localización de marcadores.
