Name: In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a diferenciar células endoteliales a partir de células madre pluripotentes humanas y a estimularlas mecánicamente en un chip fluidico. Este protocolo permite estudiar la mecanobiología vascular con alta reproducibilidad.

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Este trabajo contó con el apoyo de la Beca de Investigación Avanzada 2021 de la Asociación Europea de Hematología, el Premio Global de Investigación 2021 de la Sociedad Americana de Hematología y el Fondo de Apoyo a la Estrategia Interna ISSF3 financiado por el Welcome Trust y la Universidad de Edimburgo. Agradecemos a Fiona Rossi, del Centro de Citometría de Flujo, por su apoyo en el análisis de citometría de flujo. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia Creative Commons Attribution (CC BY) a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja de este envío.

Diferenciación y estimulación mecánica de células endoteliales derivadas de hiPSC

<ol><li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+before+birth%3A+clues+from+gene+knockouts+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Death before birth: clues from gene knockouts and mutations.</a> Trends in Genetics. 11 (3), 87-93 (1995).</li>
<li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation Research. 92 (2), 133-135 (2003).</li>
<li>Peacock, H. M., Daems, M., Jones, E. A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+control+of+endothelial+cell+fates+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic control of endothelial cell fates in development.</a> Cardiac and Vascular Biology. 8, 127-166 (2021).</li>
<li>Chong, D. C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+arteriovenous+fate+acquisition+during+mammalian+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2153-2165 (2011).</li>
<li>Jaffredo, T., Gautier, R., Eichmann, A., Dieterlen-Lièvre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraaortic+hemopoietic+cells+are+derived+from+endothelial+cells+during+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intraaortic hemopoietic cells are derived from endothelial cells during ontogeny.</a> Development. 125 (22), 4575-4583 (1998).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+Tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate Tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+haematopoietic+cells+emerging+from+the+mouse+aortic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium.</a> Nature. 464 (7285), 116-120 (2010).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+embryonic+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis.</a> Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).</li>
<li>Diaz, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+blood+development+through+prostaglandin+E2+and+the+cAMP-PKA+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Lundin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP+regulates+hematopoietic+stem+cell+formation+in+response+to+the+biomechanical+forces+of+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow.</a> Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicry+of+embryonic+circulation+enhances+the+hoxa+hemogenic+niche+and+human+blood+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development.</a> Cell Reports. 40 (11), 111339(2022).</li>
<li>Azzoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+circulation+triggers+a+metabolic+switch+required+for+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition.</a> Cell Reports. 37 (11), 110103(2021).</li>
<li>Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li>
<li>Batsivari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+hematopoietic+stem+cell+development+through+functional+correlation+of+their+proliferative+status+with+the+intra-aortic+cluster+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).</li>
<li>Canu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endothelial-to-haematopoietic+transition+at+the+single+cell+level+identifies+cell+cycle+regulation+as+a+driver+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation.</a> Genome Biology. 21 (1), 157(2020).</li>
<li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2020).</li>
<li>Yang, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+KLF1+enhances+the+differentiation+and+maturation+of+red+blood+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen%3A+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219(2018).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+human+macrophages+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).</li>
<li>Fidanza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analyses+and+machine+learning+define+hematopoietic+progenitor+and+HSC-like+cells+derived+from+human+PSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs.</a> Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
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<li>Nguyen, J., Lin, Y. Y., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+endothelial+differentiation%3A+Tissue-specific+ECs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The next generation of endothelial differentiation: Tissue-specific ECs.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1188-1204 (2021).</li>
<li>Petazzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+cells+support+the+development+of+human+hematopoietic+progenitors+in+vitro+via+secretion+of+IGFBP2%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Crosse, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layered+spatial+transcriptomics+identify+secretory+factors+promoting+human+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 822(2020).</li>
<li>Calvanese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+human+haematopoietic+stem+cells+from+haemogenic+endothelium+to+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth.</a> Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).</li>
<li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+first+hematopoietic+stem+cell+generation+in+human+embryo+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.</a> Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).</li>
<li>Hwa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+arterial-venous+fusions+and+fate+specification+in+mouse+embryos+lacking+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11965(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El protocolo que aquí describimos permite la generación de células endoteliales mecanosensibles a partir de células madre pluripotentes humanas y el estudio de su respuesta a la estimulación mecánica mediada por un esfuerzo de cizallamiento controlado. Este protocolo está totalmente basado en citoquinas y es totalmente compatible con los reactivos GMP para su posible traducción en la producción de células para la terapia celular.
La derivación de las hiPSCs proporciona a los científicos un modelo instrumental para las primeras etapas del desarrollo embrionario que permite el estudio de procesos que de otro modo serían difíciles de estudiar in vivo24. De hecho, los tejidos embrionarios humanos disponibles para la investigación se recolectan de embriones que carecen de circulación, y esto podría tener un impacto significativo en la firma molecular controlada por señales mecánicas. El enfoque descrito aquí permite obtener imágenes en vivo y estudiar en tiempo real la respuesta celular al esfuerzo cortante. La combinación de hiPSCs con fluídica proporciona un modelo de estudio que supera la limitada disponibilidad y la inaccesibilidad de los tejidos fetales en desarrollo cuando el inicio de la circulación remodela y controla el establecimiento del sistema cardiovascular y sanguíneo 3,9,10,25.
Una limitación del protocolo es que las células endoteliales derivadas de este protocolo podrían no reflejar las diversas identidades de las diferentes células endoteliales presentes en los tejidos en desarrollo. Para superar esta limitación, podría ser necesaria una combinación específica de citocinas durante el proceso de diferenciación que precede a la estimulación fluídica para obtener la identidad deseada o el fenotipo específico del tejido26. El aislamiento de los subconjuntos endoteliales se puede obtener utilizando un inmunofenotipo más refinado durante la etapa de aislamiento. Este protocolo aísla las células endoteliales basándose únicamente en la expresión de CD34, lo que permite el aislamiento de la columna en lugar de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS); Esto reduce la muerte celular y el riesgo de contaminación. Además, este protocolo está diseñado específicamente para estudiar el papel del esfuerzo cortante mediado por el flujo laminar. Habrá que emplear enfoques fluídicos alternativos para estudiar el efecto de otras señales mecánicas, como el estiramiento o la compresión, u otros tipos de flujo, como el flujo perturbado o perturbado.
Hemos demostrado previamente que las células endoteliales derivadas de iPSC imitan las identidades celulares arteriovenosas heterogéneas27 similares a las observadas en la aorta dorsal fetal28,29,30. Esto es de particular importancia en el contexto del desarrollo de los vasos y la especificación celular, que se sabe que está controlada por la circulación sanguínea. Estudios en diferentes modelos demostraron que la falta de circulación resulta en una alteración de la especificación arteriovenosa11,14,31. Todavía se desconocen los mecanismos que conectan las señales mecánicas con la especificación de la célula y la línea descrita aquí permite estudios funcionales refinados que no podrían probarse in vivo.
Esta línea describe la producción y la estimulación de células endoteliales derivadas de hiPSCs utilizando canales fluídicos disponibles comercialmente, evitando la necesidad de fundir los dispositivos como para los dispositivos de polidimetilsiloxano (PDMS) ampliamente utilizados12. Además, el uso de chips PDMS hace que la recolección de las células estimuladas sea particularmente desafiante, mientras que con este protocolo, las células se pueden recuperar fácilmente del canal. Esto mejora significativamente la potencia analítica, lo que permite realizar análisis posteriores, como análisis proteómicos y transcriptómicos, citometría de flujo y ensayos funcionales, que podrían necesitar más cultivos o ensayos in vivo .

Durante el desarrollo embrionario, el corazón es el primer órgano en establecer la funcionalidad1, con contracciones detectables desde la etapa más temprana de la formación del tubo endocárdico2. La circulación, junto con las señales mecánicas mediadas por el flujo de sangre dentro del vaso, controla muchos aspectos cruciales del desarrollo temprano. Antes del establecimiento de la circulación fetal, la vasculatura se organiza en un plexo capilar primario; Al funcionar cardíacamente, este plexo se reorganiza en vasculatura venosa y arterial3. El papel de las señales mecánicas en la especificación arteriovenosa se refleja en la expresión panendotelial de los marcadores arteriales y venosos antes del inicio del flujo sanguíneo4.
Las fuerzas hemodinámicas no solo controlan el desarrollo de la vasculatura en sí, sino que también juegan un papel fundamental en el control de la formación de células sanguíneas. Las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) emergen de células endoteliales especializadas llamadas endotelio hemogénico 5,6,7,8, presentes en diferentes regiones anatómicas de los embriones exclusivamente en la etapa temprana del desarrollo. Los modelos con deficiencia cardíaca, junto con los modelos in vitro, han demostrado que las señales mecánicas instruyen y aumentan la producción de HSPC del endotelio hemogénico 9,10,11,12,13,14.
Se ha demostrado que diferentes tipos de dinámica de flujo controlan diferencialmente el ciclo celular 15, lo que se sabe que es importante tanto en el endotelio hemogénico16,17 como en la especificación de células arteriales18. En conjunto, las señales mecánicas son determinantes críticos de la identidad y función celular durante el desarrollo. Los nuevos dispositivos fluídicos in vitro nos permiten superar las limitaciones que conlleva el estudio de la mecanobiología del desarrollo durante el desarrollo de la sangre humana in vivo.
El objetivo general del protocolo en este manuscrito es describir, paso a paso, la línea experimental para estudiar el efecto del estrés cortante en las células endoteliales humanas derivadas in vitro de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Este protocolo contiene instrucciones detalladas sobre la diferenciación de las hiPSC en células endoteliales y su posterior siembra en chips fluídicos para el protocolo de estimulación. Con esto, se puede probar la capacidad de diferentes células endoteliales derivadas in vitro para detectar el esfuerzo cortante mediante el análisis de su orientación en respuesta al flujo. Esto permitirá a otros laboratorios abordar preguntas sobre la respuesta al estrés de cizallamiento y sus consecuencias funcionales en diferentes identidades de células endoteliales.

<table><tbody><tr><td>0.6 Luer portaobjetos sin recubrimiento</td><td>ibidi</td><td>IB-80186</td><td></td></tr><tr><td>25% BSA</td><td>Life Technologies</td><td>A10008-01</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Citado como reactivo de disociación</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Merck</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de aspiración</td><td>Sardtedt</td><td>86.1252.011</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Citado como Suplemento de cultivo de células neuronales (50x)</td></tr><tr><td>BD FACS DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td>Versión 8.0.1</td><td>Citado como software de citometría de flujo</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa 5 Láser</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Kit de microperlas</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>30-046-702</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PE clon 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>12-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP-eFluor 710 clon 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>44-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar superficie repelente de células placas de 6 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657970</td><td>Citado como placa repelente celular</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>13122-1mg-CAY</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10&nbsp; criopreservación celular</td><td>Merck</td><td>C2874-100ML</td><td>Citado como solución de criopreservación</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>VWR</td><td>200-664-3</td><td>Citado como DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DPB Ca2+ Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Colador EASY 40 &mu; m</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>FcR Reactivo de bloqueo</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>Versión 1.53c</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo</td><td></td><td>Versión 10.7.1</td><td>Citado como análisis de citometría de flujo oftware</td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19-10uG</td><td></td></tr><tr><td>Unidad fluídica</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>Citado como suplemento de L-glutamina</td></tr><tr><td>Ham F-12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Holotransferrina</td><td>Merk</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana</td><td>Fujifilm UK Ltd</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Sistema de bombeo</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>Citado como Sistema de bombeo</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>ioLight/Thisle Scientific</td><td>IOL-IO-INVERT</td><td>Citado como microscopio invertido en incubadora</td></tr><tr><td>Liofilizado BSA&nbsp;</td><td>Merck</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separador</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td>Citado como Separador magnético</td></tr><tr><td>MS Columnas</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>Citado como Columna magnética</td></tr><tr><td>MTG</td><td>Merck</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Cuaderno para sistema de bombeo</td><td>ibidi</td><td>10908</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído 37-41%</td><td>Fisher Chemicals</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Pastette</td><td>Greiner Bio-one</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Estreptococos</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Set de Perfusión AMARILLO/VERDE: 50 cm, ID 1,6 mm, depósitos de 10 mL</td><td>Ibidi</td><td>IB-10964</td><td>Citado como Juego de perfusión</td></tr><tr><td>Poliestireno Tubos de fondo redondo</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td>Citado como Tubos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>Prisma 9</td><td></td><td>Versión 9.4.0</td><td></td></tr><tr><td>Software de control de bombas</td><td>ibidi</td><td>versión 1.6.1</td><td>Citado como Software de bomba</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Tecchonologies</td><td>5872</td><td>Citado como Solución de separación</td></tr><tr><td>rhBMP4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>rhEPO</td><td>R& D</td><td>287-TC-500</td><td></td></tr><tr><td>rhIGF1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL11</td><td>Peprotech</td><td>200-11-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL6</td><td>R& D</td><td>206-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>Life technologies</td><td>A29248</td><td>Citado como Laminin</td></tr><tr><td>rhSCF</td><td>Life Technologies</td><td>PHC2111</td><td></td></tr><tr><td>rhTPO</td><td>R& D</td><td>288-TPN-025</td><td></td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R& D</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Conector serie para &micro;-portaobjetos: estériles, estériles</td><td>ibidi</td><td>IB-10830</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-CD34 SFM media Life</td><td>Technologies</td><td>10639011</td><td>citado como medio sin suero para células CD34+ (SFM-34)</td></tr><tr><td>StemPro-CD34 Suplemento de nutrientes&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10641-025</td><td>Citado como 34 suplemento de nutrientes</td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Life Technologies</td><td>A1000701</td><td>Citado como Culture media&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplemento StemPro</td><td>Life Technologies</td><td>A10006-01</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina (VTN-N) proteína humana recombinante, truncada</td><td>Invitrogen</td><td>A31804</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Citado como iRock</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

El corazón es el primer órgano que se establece funcionalmente durante el desarrollo, iniciando así la circulación sanguínea muy temprano en la gestación. Además de transportar oxígeno y nutrientes para asegurar el crecimiento fetal, la circulación fetal controla muchos eventos cruciales del desarrollo que tienen lugar dentro de la capa endotelial a través de señales mecánicas. Las señales biomecánicas inducen cambios estructurales en los vasos sanguíneos, establecen la especificación arteriovenosa y controlan el desarrollo de células madre hematopoyéticas. La inaccesibilidad de los tejidos en desarrollo limita la comprensión del papel de la circulación en el desarrollo humano temprano; Por lo tanto, los modelos in vitro son herramientas fundamentales para el estudio de la mecanobiología de los vasos. En este trabajo se describe un protocolo para diferenciar células endoteliales de células madre pluripotentes inducidas humanas y su posterior siembra en un dispositivo fluídico para estudiar su respuesta a señales mecánicas. Este enfoque permite el cultivo a largo plazo de células endoteliales bajo estimulación mecánica, seguido de la recuperación de las células endoteliales para su caracterización fenotípica y funcional. El modelo in vitro establecido aquí será fundamental para dilucidar los mecanismos moleculares intracelulares que transducen la señalización mediada por señales mecánicas, que en última instancia orquestan el desarrollo de los vasos durante la vida fetal humana.

Describimos aquí un protocolo para la diferenciación y mecanoestimulación de células endoteliales derivadas de hiPSCs que permite el estudio de su respuesta a señales mecánicas (Figura 1). Este protocolo da como resultado la producción de células endoteliales funcionalmente mecanosensibles. Proporcionamos aquí resultados representativos y describimos el fenotipo esperado para evaluar cómo responden las células a la estimulación de citoquinas durante la diferenciación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg"> Figura 1: Esquema del protocolo de diferenciación y estimulación mecánica. Esquema del protocolo de diferenciación que muestra el momento de las diferentes mezclas de citoquinas, el aislamiento celular CD34+ , la siembra de chips fluídicos y el análisis final de las células estimuladas mecánicamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Cultivo de las hiPSC Es importante iniciar el protocolo a partir de hiPSCs que estén creciendo correctamente en condiciones de autorrenovación. Un buen indicador de la calidad del cultivo es la velocidad de su crecimiento. Después de la descongelación, las células pueden necesitar de 2 a 3 semanas para alcanzar la fase correcta de crecimiento que asegurará una buena diferenciación. Cuando las células pueden ser pasadas dos veces por semana en una proporción de 1:6 alcanzando una confluencia casi completa, este es el momento en que están listas para ser diferenciadas el mismo día en que necesitan ser pasadas.
Diferenciación de las hiPSCs en células endoteliales El primer paso de la diferenciación, que consiste en la formación de cuerpos embrioides (EB), depende de la línea celular y puede necesitar cierta optimización para la línea celular específica en uso. La disociación descrita en los pasos del protocolo 1.3.2.2-1.3.2.4 puede modificarse reduciendo o ampliando la incubación con el reactivo de disociación y la posterior disociación con la pipeta de Pasteur. Además, se pueden utilizar otros reactivos de disociación para este paso, además de la disociación física de las colonias con una herramienta de corte o una punta de pipeta P100. Los EB de buena calidad muestran un borde definido en el día 2 de la diferenciación y aparecen claros y brillantes cuando se observan con un microscopio; las áreas más oscuras podrían indicar la muerte celular dentro de los EB (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg"> Figura 2: Morfología de los cuerpos embrioides. (A) Cuerpos embrioides del día 2 que muestran bordes externos bien definidos y tamaño constante. (B) Cuerpos embrioides de día 2 de mala calidad que muestran una muerte celular extensa que conduce a la desagregación de la estructura. Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En el día 2, la adición de CHIR99021 a los EB inhibe la proteína GSK-3, lo que resulta en la activación de la vía Wnt. Las diferentes líneas celulares tienen diferentes respuestas al tratamiento con CHIR, y esto debe probarse cuantificando el número de células CD34+ obtenidas en el día 8 mediante el uso de diferentes concentraciones (Figura 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg"> Figura 3: Diferenciación de células endoteliales con diferentes tratamientos CHIR. Compromiso de las células endoteliales cuantificado por citometría de flujo en el día 8 de diferenciación por la expresión de la membrana CD34, después del tratamiento con CHIR en el día 2 a (A) 3 μM, (B) 5 μM y (C) 7 μM. Los datos de citometría de flujo se obtuvieron utilizando citómetros de cinco láseres y un software específico (ver Tabla de materiales). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Aislamiento de células CD34+ Es importante validar que el enriquecimiento de CD34+ utilizando las perlas magnéticas proporciona al menos un 80% de CD34+ después de la elución de la columna. Para garantizar una pureza suficiente, se puede analizar una alícuota de células obtenidas del aislamiento magnético mediante citometría de flujo, asegurándose de utilizar un clon de anticuerpo diferente al utilizado para el enriquecimiento magnético. En este caso, se utilizó el clon 4H11 y se logró una pureza de ~85% después del enriquecimiento (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg"> Figura 4: Expresión de CD34 en la membrana antes y después del enriquecimiento por clasificación magnética. Los cuerpos embrioides disociados del día 8 (gris) y las células después del enriquecimiento magnético (verde) se tiñeron para la expresión de CD34 y se analizaron mediante citometría de flujo, mostrando un enriquecimiento exitoso después de la clasificación. Los datos de citometría de flujo se obtuvieron utilizando citómetros de cinco láseres y un software específico (ver Tabla de materiales). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Siembra de células en el canal fluídico Al sembrar las células en el canal fluídico, es crucial realizar un seguimiento de la adhesión y proliferación de las células endoteliales. Después de la siembra, las células tardan ~5 h en adherirse completamente al canal (Figura 5A). También se puede probar una solución de recubrimiento alternativa para mejorar la adherencia en esta etapa. Para confirmar que las células analizadas son mecanosensibles y, por lo tanto, capaces de responder a la estimulación mecánica, se puede probar la orientación de las células a lo largo del tiempo. Las células antes de la estimulación muestran una orientación aleatoria (Figura 5A y Figura 5C) y se reorientan paralelamente a la dirección del flujo (Figura 5B, C). El protocolo aquí descrito permite la recolección de las células del canal para realizar análisis posteriores, por ejemplo, citometría de flujo, para el estudio de su inmunofenotipo de membrana, proporcionando la identidad endotelial de las células estimuladas (Figura 5D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg"> Figura 5: Mecanosorreactividad de las células endoteliales derivadas de hiPSCs . (A) Capa confluente de células CD34+ aisladas 48 h después de la siembra. (B) Capa reorientada de células endoteliales 3 días bajo cultivo dinámico. (C) Análisis de orientación de las células endoteliales después de 5 días de cultivo dinámico. (D) Perfil de expresión de CD34 de células cultivadas bajo flujo durante 5 días. (E) Porcentaje de células CD34+ de la población celular recuperadas del canal fluídico. Las imágenes se tomaron con un microscopio invertido en la incubadora; Los datos de citometría de flujo se obtuvieron utilizando citómetros de cinco láseres y un software específico (ver Tabla de materiales). Barras de escala = 100 μm (A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reactivos</td>
			<td>Concentración de existencias</td>
			<td>Volumen añadido</td>
			<td>Concentración final</td>
		</tr><tr><td>Medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Mezcla de nutrientes F-12 para jamón (F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Suplemento N-2 (100x)</td>
			<td>100 x</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 vez</td>
		</tr><tr><td>Suplemento B-27 (50x)</td>
			<td>50 x</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>1 vez</td>
		</tr><tr><td>Ácido ascórbico</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>1,25 ml</td>
			<td>25 μg/mL</td>
		</tr><tr><td>α-monotioglicerol (MTG)</td>
			<td>11,5 M</td>
			<td>19,5 μL</td>
			<td>448,5 μM</td>
		</tr><tr><td>Albúmina sérica humana</td>
			<td>100 mg/mL</td>
			<td>2,5 ml</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
		</tr><tr><td>Holo-Transferrina</td>
			<td>100 mg/mL</td>
			<td>0,75 ml</td>
			<td>150 μg/mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Composición y receta de 500 mL de medio de diferenciación libre de suero (SFD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Días de diferenciación</td>
			<td>Mezcla de citoquinas</td>
			<td>Citoquina</td>
			<td>Concentración final</td>
		</tr><tr><td>Día 0 - 2</td>
			<td>Mezcla 1</td>
			<td>BMP4</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr><tr><td>Día 2</td>
			<td>Mezcla 2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 μM</td>
		</tr><tr><td>A partir del día 3</td>
			<td rowspan="2">Mezcla 3 y 4</td>
			<td>VEGF</td>
			<td>15 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>bFGF</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr><tr><td>A partir del día 6</td>
			<td rowspan="8">Mezcla 4</td>
			<td>IL6</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FLT3L</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IGF1</td>
			<td>25 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL11</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>SCF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>EPO</td>
			<td>3 U/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>TPO</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL3</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Mezclas de citocinas utilizadas para la diferenciación de células endoteliales, días en los que se añaden al medio SFD y concentración final.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Esfuerzo cortante (dyn/cm2)</td>
			<td>Tiempo (h)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Hasta el final del experimento</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Valores de esfuerzo cortante para el cultivo dinámico y la duración de su aplicación.
Figura suplementaria S1: Geometría y dimensiones del chip y la tubería utilizados para este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria S2: Guía paso a paso para el software que controla la bomba de aire con una descripción de cada paso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S3: Guía para el análisis de orientación utilizando FIJI que muestra el dibujo de la forma de la celda, el ajuste elíptico y la medición final. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria S1: Tamaño de la unidad, volumen de resuspensión y concentraciones de existencias para las citocinas utilizadas en el protocolo de diferenciación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Aquí se describe un flujo de trabajo simple para diferenciar las células endoteliales de las células madre pluripotentes humanas, seguido de un protocolo detallado para su estimulación mecánica. Esto permite el estudio de la mecanobiología del desarrollo de las células endoteliales. Este enfoque es compatible con los ensayos posteriores de células vivas recogidas del chip de cultivo después de la estimulación mecánica.

In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Nuestra investigación explora cómo las señales mecánicas instruyen el destino de las células endoteliales durante el desarrollo, para lo cual combinamos la diferenciación de células madre pluripotentes inducida por humanos con la estimulación mecánica mediada por fluidos. Las células endoteliales están constantemente expuestas al movimiento de la sangre, por lo que se pierden señales importantes en el cultivo estático, lo que hace que este sea el principal desafío en el estudio de la biología de las células endoteliales utilizando sistemas de cultivo tradicionales. Las señales mecánicas, de hecho, activan muchas vías de señalización cruciales que podrían pasarse por alto en células cultivadas en condiciones estáticas.Nuestro protocolo proporciona una guía sencilla, paso a paso, sobre cómo diferenciar y estimular mecánicamente las células endoteliales derivadas de células madre pluripotentes inducidas. Esto ayudará a muchos laboratorios a adoptar un cultivo térmico para abordar fácilmente las preguntas sobre el comportamiento de las células endoteliales mientras están bajo flujo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se describe una metodología para ofrecer la médula humana derivados de la sangre endoteliales que forman colonias de células (ECFCs) y médula ósea procedentes de células madre mesenquimales (MSC), integrado en un gel de colágeno / fibronectina, por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes. Esta combinación de células / gel genera una red humana vascular que conecta con la vasculatura del ratón.

Bioingeniería Humanos redes microvasculares en ratones inmunodeficientes

Una plataforma de micro-canales-on-a-chip fue desarrollado por la combinación de la técnica de fotolitografía reflowable fotosensible, litografía blanda, y microfluidos. La plataforma de microcanales endotelizado imita la geometría tridimensional (3D) de microvasos in vivo, se ejecuta bajo flujo de perfusión continua controlada, permite la formación de imágenes de alta calidad y en tiempo real y se puede aplicar para la investigación microvascular.

Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

Las células endoteliales primarias de la vena umbilical humana (HUVECs) se cultivaron hasta la confluencia dentro de un dispositivo de red microfluídica. Se ilustró la unión de las células endoteliales y las distribuciones de F-actina, y se cuantificaron en tiempo real los cambios en la concentración de calcio intracelular y la producción de óxido nítrico en respuesta al trifosfato de adenosina (ATP) a nivel de células individuales.

Desarrollo y caracterización de<em&gt; In Vitro</em&gt; Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Y la producción de óxido nítrico

Protocolos para el estudio de la aorta murina embrionaria y perinatal mediante análisis clonal de en vivo y asignación de destino, explantes aórticos y aislada del músculo liso células se detallan aquí. Estos diversos enfoques facilitan la investigación de la morfogénesis de la aorta embrionaria y perinatal en el desarrollo normal y la patogénesis en la enfermedad.

Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

Los progenitores endoteliales derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-EP) tienen el potencial de revolucionar los tratamientos de enfermedades cardiovasculares y permitir la creación de modelos de enfermedades cardiovasculares más fieles. En este documento, se describe la encapsulación de iPSC-EPs en microambientes tridimensionales de colágeno (3D) y un análisis cuantitativo del potencial vasculogénico de estas células.

Un modelo 3D In Vitro y una tubería computacional para cuantificar el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC

Aquí, proporcionamos un chip microfluídico y un sistema microfluídico de circulación automáticamente controlado y altamente eficiente que recapitula el microambiente inicial de neovascularización, permitiendo que las células endoteliales (ECs) sean estimuladas por un alto estrés esquilar luminal, nivel fisiológico de flujo transendotelial y diversa distribución del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) simultáneamente.

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Este ensayo utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides cultivados en gel de colágeno 3D para analizar los procesos biológicos que controlan la angiogénesis germinada in vitro. La técnica se puede aplicar para probar medicamentos, modelar enfermedades y estudiar genes específicos en el contexto de deleciones que son embrionariamente letales.

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Aquí, desarrollamos un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana para replicar la tensión biomecánica in vivo de las células del músculo liso en la pared aórtica humana.

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Modelado del glicocálix endotelial después de la neumonectomía en un chip fluídico 3D: un enfoque para fabricar un sistema de órgano en chip basado en el sistema vascular

Este artículo describe un método para crear una lesión mecánica en un vaso en embriones de pez cebra. Este modelo de lesión proporciona una plataforma para estudiar la hemostasia, la inflamación relacionada con la lesión y la cicatrización de heridas en un organismo ideal para la microscopía en tiempo real.

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