Name: Métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprende a incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles de agarosa usando lisados de E. coli. Este método permite desarrollar dispositivos diagnósticos portátiles con capacidades de detección novedosas.

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Los autores agradecen enormemente el apoyo de los premios BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) y BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), y del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas - Laboratorios de Ciencia y Tecnología de Defensa EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Los datos que respaldan esta publicación están disponibles en abierto en: 10.25405/data.ncl.22232452. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia Creative Commons Attribution (CC BY) a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja.

1. Tampón de lisado celular y preparación de medios
<ol><li>Preparación de 2x agar YT+P y medio<ol><li>Prepare 2 agar YT+P midiendo 16 g/L de triptona, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1M KH2PO4 y 15 g/L de agar. Para el caldo 2x YT+P, siga la composición anterior pero omita el agar.</li>
		<li>Esterilice esterilizando en autoclave el 2x YT+P.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del tampón S30A<ol><li>Preparar el tampón S30A con 5,88 g/L de Mg-glutamato, 12,195 g/L de K-glutamato y 25 mL/L de 2 M de Tris, ajustado a pH 7,7 con ácido acético.</li>
		<li>Guarde el tampón S30A a 4 °C durante un máximo de 1 semana.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del tampón S30B<ol><li>Preparar el tampón S30B con 5,88 g/L de Mg-glutamato y 12,195 g/L de K-glutamato, ajustado a pH 8,2 con 2 M Tris.</li>
		<li>Guarde el tampón S30B a 4 °C durante un máximo de 1 semana.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación del lisado celular (protocolo de 4 días)
<ol><li>Día 1<ol><li>Vierta el 2x YT+P en placas de agar suplementadas con 100 μg/ml de ampicilina.</li>
		<li>Eliminar E. coli a partir de una cepa de glicerol de -80 °C e incubar durante la noche a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 2<ol><li>Inocular una sola colonia de la placa 2x YT+P en 400 mL de caldo 2x YT+P (suplementado con ampicilina) en un matraz deflector de 1 L.</li>
		<li>Incubar durante 24 h a 37 °C con agitación a 220 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 3<ol><li>Medir y registrar la DO600 de los cultivos de 24 h; crecimiento es suficiente a un DE600 de 3-4. NOTA: Tome una alícuota de 1 ml de cultivo bacteriano y realice una dilución seriada con medio (2x caldo YT+P) antes de medir el OD600 nm. Tenga en cuenta el efecto de dilución al calcular el OD600.</li>
		<li>Transfiera el cultivo uniformemente entre botellas de centrífuga preenfriadas de 500 ml.</li>
		<li>Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C y luego desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Durante la centrifugación, complete la preparación del tampón S30A agregando 2 mL/L de DTT de 1 M al tampón S30A previamente preparado, mezclando y manteniendo el tampón en hielo.</li>
		<li>Vuelva a suspender los gránulos celulares en 200 ml de tampón S30A.</li>
		<li>Agite las botellas vigorosamente hasta que todo el gránulo esté completamente solubilizado, manteniendo las células en hielo tanto como sea posible.</li>
		<li>Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C y luego desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Repita los pasos 2.3.5 a 2.3.7 (ambos inclusive).</li>
		<li>Agregue 40 ml de tampón S30A a cada botella de centrífuga, vuelva a suspender los gránulos y transfiéralos a tubos de centrífuga de 50 ml prepesados.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y elimine el sobrenadante residual con una pipeta, manteniéndolo en hielo tanto como sea posible.</li>
		<li>Vuelva a pesar los tubos de centrífuga, registre la nueva masa y calcule la masa de los gránulos.</li>
		<li>Congele rápidamente los gránulos en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 4<ol><li>Descongele los gránulos en hielo.</li>
		<li>Por 1 g de gránulo, añadir lo siguiente: 1,2 ml de tampón S30A (TDT añadido antes de su uso), 275 μl de inhibidor de la proteasa (8 mM de stock) y 25 μl de lisozima (10 mg/ml de stock).</li>
		<li>Agite vigorosamente hasta que los gránulos estén completamente solubilizados sin grumos restantes, manteniéndolos en hielo tanto como sea posible.</li>
		<li>En tubos de centrífuga de 50 ml, sonicar las suspensiones celulares a 120 W, 20 kHz, 30% de amplitud y 20 s/40 s de pulsos de encendido/apagado durante 5 minutos de sonicación.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 x g durante 1 h a 4 °C para granular los restos de la célula.</li>
		<li>Transfiera el sobrenadante a tubos de centrífuga nuevos de 50 ml.</li>
		<li>Incubar los tubos a 37 °C a 220 rpm durante 80 min.</li>
		<li>Prepare los materiales de diálisis añadiendo 1 mL/L de DTT 1 M al tampón S30B. Mezcle y agregue 900 ml a un vaso de precipitados estéril de 1 l. Agregue un agitador magnético y manténgalo a 4 ° C.</li>
		<li>Después de la reacción de escorrentía, transfiera el extracto celular del paso 2.4.7 a tubos de microcentrífuga de 2 ml y centrifugue a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Consolide el sobrenadante sin gránulos en hielo en un tubo de centrífuga de 50 ml.</li>
		<li>Determine el volumen total de extracto celular producido e hidrate el número necesario de casetes de diálisis MWCO de 10K sumergiéndolos en S30B durante 2 min.</li>
		<li>Cargue los casetes a través de una jeringa con hasta 3 ml de extracto. Diálisar hasta tres casetes por vaso de precipitados de 1 L, agitando a 4 °C durante 3 h.</li>
		<li>Una vez completada la diálisis, que clarifica el extracto, transfiera el extracto a tubos de microcentrífuga de 2 ml. Centrifugar a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Consolide el extracto clarificado en un tubo de centrífuga nuevo sobre hielo y haga un vórtice brevemente para mezclar.</li>
		<li>Determine la concentración de proteínas del extracto con un fluorómetro.</li>
		<li>Diluir el extracto a una concentración de 44,5 mg/mL utilizando ddH2O preenfriado.</li>
		<li>Alícuota en alícuotas de 200 μL, congelar rápidamente en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparación de hidrogeles liofilizados (Método A)
<ol><li>Pesar 0,75 g de agarosa, añadir ddH2O a un volumen de 100 ml y calentar en el microondas en ráfagas de 30 s a altas temperaturas para crear un caldo de agarosa fundido.</li>
	<li>Con una pipeta, transfiera 50 μL de agarosa fundida a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y deje que el gel polimerice durante 20-30 min (la polimerización se produce más rápido si los geles se transfieren a un refrigerador).</li>
	<li>Congele rápidamente los tubos de microcentrífuga, que contienen los geles polimerizados, en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Retire la tapa de los tubos de la centrífuga, cubra las aberturas de los tubos de la centrífuga con una película de cera y perfore la película varias veces con una aguja o punta de pipeta.</li>
	<li>Transfiera los tubos de microcentrífuga que contienen los geles polimerizados a un almacenamiento de -80 °C durante 1-2 h.</li>
	<li>Recupere los tubos de centrífuga del almacenamiento a -80 °C y colóquelos en un liofilizador, asegurándose de que los tubos estén completamente secos.</li>
	<li>Acople el liofilizador con los siguientes ajustes: temperatura: -20 °C, presión: 0,1 mbar.</li>
	<li>Deja que el gel se liofilice durante la noche.</li>
	<li>Recupere los geles del liofilizador y colóquelos en almacenamiento a -80 °C hasta que sea necesario. NOTA: Los geles se pueden almacenar liofilizados hasta por 1 año.</li>
</ol>4. Preparación del stock de solución energética 14x
<ol><li>Combine todos los componentes de la reacción (Tabla 1) en un tubo de centrífuga de 15 ml sobre hielo para producir una solución energética 14x.</li>
	<li>Aliquotar la solución de energía 14x en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar a -80 °C (se pueden utilizar alícuotas de menor volumen). NOTA: La solución energética 14x puede almacenarse durante varios meses a -80 °C si se evita la congelación y descongelación repetida de los tubos.</li>
</ol>5. Preparación del caldo de aminoácidos 4x
<ol><li>Descongele, con hielo, los 20 componentes de aminoácidos de un kit RTS Amino Acid Sampler. Agita los aminoácidos para asegurarte de que se disuelvan por completo.</li>
	<li>En un tubo de centrífuga de 50 ml, combine los 20 aminoácidos y agregue 12 ml de ddH2O. Vortex estéril hasta que la solución se vuelva clara, con solo una ligera neblina de coloración blanca.</li>
	<li>Alícuota los 4x aminoácidos en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (alícuotas de 500 μL).</li>
	<li>Congele rápidamente las alícuotas de la solución de aminoácidos 4x en nitrógeno líquido y mueva las alícuotas al almacenamiento de -80 °C.</li>
</ol>6. Calibración de tampón libre de células
NOTA: El tampón CFPS utilizado para las reacciones de hidrogel se calibró para concentraciones óptimas de DTT, Mg-glutamato y K-glutamato siguiendo el protocolo de Banks et al.34 modificado de Sun et al.35. Las composiciones de las reacciones de calibración se seleccionaron utilizando el método de diseño de experimentos (DOE), seleccionándose siete niveles de factor para K-glutamato (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutamato (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) y TDT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM). Se utilizó JMP Pro 15 para generar un diseño DOE personalizado (Tabla 2) y realizar el análisis para determinar las concentraciones óptimas de los factores.
<ol><li>Recuperar el extracto libre de células del almacenamiento a -80 °C y descongelar en hielo.</li>
	<li>Descongele las existencias de 4 aminoácidos, 14 soluciones energéticas, 40 % de PEG-8000, ADN plasmídico, 3 M de K-glutamato, 100 mM de Mg-glutamato y 100 mM de DTT en hielo.</li>
	<li>Cree una mezcla maestra de calibración combinando 12,5 μL de los 4 aminoácidos, 3,57 μL de la solución energética 14x, 2,5 μL de PEG-8000 al 40 %, 3 μg de ADN plasmídico y 10 μL de extracto libre de células (44,5 mg/ml), y haga hasta 35 μL por reacción con ddH2O.</li>
	<li>Distribuya los 35 μL de mezcla maestra en los pocillos de una placa de microtitulación negra de 384 pocillos.</li>
	<li>Siguiendo el diseño del DOE, agregue el volumen apropiado de Mg-glutamato, K-glutamato y DTT a cada reacción, junto con ddH2O para hacer que cada reacción sea de hasta 50 μL.</li>
	<li>Transfiera la placa de microtitulación a un lector de placas para la detección y el análisis de fluorescencia utilizando la configuración del lector de placas descrita (para mCherry): excitación: 587 nm, emisión: 610 nm, ancho de banda de longitud de onda: 12 nm, óptica: superior, temperatura: 37 °C, con lecturas de fluorescencia recogidas cada 5 minutos durante 4 h de tiempo total de lectura. Incubar las placas agitándolas en un ajuste pulsado a 60 rpm.</li>
	<li>Cargue los resultados en el diseño JMP DOE y genere un perfil de predicción para determinar los niveles óptimos de concentración para K-glutamato, Mg-glutamato y DTT en función de las variables de respuesta deseadas; En este caso, la fluorescencia máxima y la velocidad de reacción fueron las variables de respuesta.</li>
	<li>Combine los reactivos como se muestra en la Tabla 3 para crear el tampón CFPS 2X</li>
	<li>Alícuota y almacenar a -80 °C</li>
</ol>7. CFPS en hidrogeles liofilizados rehidratados (Método A)
NOTA: Los plásmidos utilizados en las reacciones de CFPS se crearon utilizando componentes del kit de herramientas modular EcoFlex para E. coli36 y descritos en Whitfield et al.11 El mCherry y el eGFP estaban bajo el control del promotor JM23100 constitutivo. Estos componentes están disponibles en Addgene.
<ol><li>Recupere el extracto libre de células del almacenamiento a -80 °C y descongele en hielo durante aproximadamente 20 minutos.</li>
	<li>Recoja el tampón CFPS 2x y el ADN plasmídico, y descongele en hielo.</li>
	<li>Recoja los hidrogeles liofilizados y déjelos alcanzar la temperatura ambiente durante 15 minutos dejando reposar los geles en el banco.</li>
	<li>Transfiera los geles a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, recortando los geles con un bisturí si es necesario para que quepan en los pocillos.</li>
	<li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, combine 10 μl de extracto libre de células con 25 μl de tampón 2x CFPS y 4 μg de ADN plasmídico; hasta un volumen total de 50 μL con ddH2O para crear la solución de CFPS.</li>
	<li>Pipetear la solución de CFPS sobre los hidrogeles liofilizados.</li>
	<li>Deje que los geles se remojen en el sistema CFPS durante 5-10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera los geles a una placa de microtitulación negra de 384 pocillos con una espátula.</li>
	<li>Transfiera la placa de microtitulación a un lector de placas para la detección y el análisis de fluorescencia utilizando la configuración del lector de placas descrita en el paso 6.6. Se dispone de resultados representativos en estudios previos31,33.</li>
</ol>8. Síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles desplegables (Método B)
<ol><li>Recupere el extracto libre de células del almacenamiento a -80 °C y descongele en hielo durante aproximadamente 20 minutos.</li>
	<li>Recoja el ADN del plásmido y descongele en hielo.</li>
	<li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo, combine 10 μl de extracto libre de células con 3 μg de ADN plasmídico y 25 μl de tampón 2x CFPS, lo que hace un volumen total de 37,5 μl.</li>
	<li>Mida 3 g de agarosa y agréguelo a 100 ml de tampón ddH2O para crear un 3% de agarosa.</li>
	<li>Calienta en el microondas la agarosa al 3% en ráfagas de 30 s a alta potencia.</li>
	<li>Pipetear 12,5 μL de agarosa fundida en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL que contengan una mezcla de CFPS hasta un volumen total de 50 μL.</li>
	<li>Deje que la agarosa fundida se enfríe, pero no se polimerice, dejando la agarosa en un bloque térmico ajustado a 50 °C.</li>
	<li>Combine la agarosa fundida con la solución de CFPS; mezcle mediante pipeteo y agitación con la punta, y asegúrese de moverse rápidamente para evitar la polimerización en gel antes de que se pueda mezclar la solución de CFPS.</li>
	<li>Deje que los geles se enfríen a temperatura ambiente y polimericen durante aproximadamente 2 minutos.</li>
	<li>Transfiera la agarosa polimerizada a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con una espátula y congele rápidamente en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Coloque los hidrogeles ultracongelados en un almacenamiento de -80 °C durante 1 h.</li>
	<li>Recuperar los geles del almacenamiento; Retire las tapas de los tubos de microcentrífuga, cubra los tubos con una película de cera y perfore la película para permitir que se seque la humedad.</li>
	<li>Conecte el liofilizador con los siguientes ajustes: temperatura: -20 °C, presión: 0,1 mbar, liofilización durante 18 h (durante la noche).</li>
	<li>Guarde los dispositivos CFPS liofilizados en un almacenamiento de -80 °C hasta su uso.</li>
	<li>Los dispositivos CFPS liofilizados, con un volumen húmedo aproximado de 50 μL, se pueden rehidratar con 50 μL de ddH2O sin exceso de líquido. La rehidratación dura aproximadamente 30 min.</li>
	<li>Transfiera los geles a una placa de microtitulación negra de 384 pocillos con una espátula.</li>
	<li>Transfiera la placa de microtitulación a un lector de placas para la detección y el análisis de fluorescencia utilizando la configuración del lector de placas descrita en el paso 6.6. Los resultados representativos están disponibles en publicaciones anteriores31,33.</li>
</ol>

Incorporación de reacciones de CFPS en una variedad de matrices de hidrogel

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</ol>

A continuación se describen dos protocolos para la incorporación de reacciones de CFPS basadas en lisado de células de E. coli en hidrogeles de agarosa. Estos métodos permiten la expresión génica simultánea en todo el material. El protocolo se puede adaptar a otros sistemas de CFPS y se ha llevado a cabo con éxito con kits de CFPS disponibles en el mercado, además de los lisados celulares preparados en laboratorio que se detallan aquí. Es importante destacar que el protocolo permite la expresión génica en ausenc...

La biología sintética integra diversas disciplinas de ingeniería para diseñar y diseñar piezas, dispositivos y sistemas de base biológica que puedan realizar funciones que no se encuentran en la naturaleza. La mayoría de los enfoques de biología sintética todavía están ligados a células vivas. Por el contrario, los sistemas de biología sintética libres de células facilitan niveles sin precedentes de control y libertad en el diseño, lo que permite una mayor flexibilidad y un tiempo más corto para la ingeniería de sistemas biológicos, al tiempo que elimina muchas de las limitaciones de los métodos tradicionales de expresión génica basados en células 1,2,3. El CFPS se utiliza en un número cada vez mayor de aplicaciones en numerosas disciplinas, incluida la construcción de células artificiales, la creación de prototipos de circuitos genéticos, el desarrollo de biosensores y la producción de metabolitos 4,5,6. El CFPS también ha sido particularmente útil para producir proteínas recombinantes que no pueden expresarse fácilmente en células vivas, como las proteínas propensas a la agregación, las proteínas transmembrana y las proteínas tóxicas 6,7,8.
El CFPS se realiza normalmente en reacciones líquidas. Esto, sin embargo, puede restringir su despliegue en algunas situaciones, ya que cualquier dispositivo líquido libre de células debe estar contenido dentro de un recipiente de reacción. La justificación para el desarrollo de los métodos presentados aquí fue proporcionar protocolos sólidos para incrustar dispositivos de biología sintética libres de células en hidrogeles, no como una plataforma de producción de proteínas per se, sino para permitir el uso de hidrogeles como un chasis físico para el despliegue de dispositivos libres de células más allá del laboratorio. El uso de hidrogeles como chasis de CFPS tiene varias ventajas. Los hidrogeles son materiales poliméricos que, a pesar de un alto contenido de agua (a veces superior al 98%), poseen propiedades sólidas 9,10,11. Tienen usos como pastas, lubricantes y adhesivos y están presentes en productos tan diversos como lentes de contacto, apósitos para heridas, cintas adhesivas marinas, enmiendas de suelo y pañales para bebés 9,11,12,13,14. Los hidrogeles también están siendo investigados activamente como vehículos de administración de fármacos 9,15,16,17. Los hidrogeles también pueden ser biocompatibles, biodegradables y poseer algunas respuestas a estímulos propios 9,18,19,20. Por lo tanto, el objetivo aquí es crear una sinergia entre la funcionalidad derivada de la biología molecular y la ciencia de los materiales. Con este fin, se han realizado esfuerzos para integrar la biología sintética libre de células con una variedad de materiales, incluidos el colágeno, la laponita, la poliacrilamida, la fibrina, el péptido PEG y la agarosa 11,21,22, así como para recubrir superficies de vidrio, papel y tela 11,23,24 con dispositivos CFPS. Los protocolos presentados aquí demuestran dos métodos para incrustar reacciones de CFPS en matrices de hidrogel a macroescala (es decir, >1 mm), utilizando agarosa como material de ejemplo. La agarosa fue elegida debido a su alta capacidad de absorción de agua, propiedades autogelificantes controladas y propiedades mecánicas sintonizables 11,24,25,26. La agarosa también es compatible con CFPS funcionales, es más barata que muchas otras alternativas de hidrogel y es biodegradable, lo que la convierte en una opción atractiva como sistema modelo experimental. Sin embargo, se ha demostrado previamente que estos métodos son apropiados para incorporar CFPS en una gama de hidrogeles alternativos11. Teniendo en cuenta la amplia gama de aplicaciones de los hidrogeles y la funcionalidad de los CFPS, los métodos aquí demostrados pueden proporcionar una base a partir de la cual los investigadores puedan desarrollar materiales de hidrogel biológicamente mejorados adecuados para sus propios fines.
En estudios previos, se han utilizado sistemas de microgel con un rango de tamaño de 1 μm a 400 μm para realizar CFPS en hidrogeles sumergidos en tampón de reacción 23,27,28,29,30,31. Sin embargo, el requisito de sumergir los hidrogeles dentro de tampones de reacción de CFPS limita las oportunidades para su uso como materiales por derecho propio. Los protocolos presentados aquí permiten que las reacciones de CFPS ocurran dentro de los hidrogeles sin la necesidad de sumergir los geles en tampones de reacción. En segundo lugar, el uso de geles a macroescala (entre 2 mm y 10 mm de tamaño) permite el estudio de la interacción física entre los hidrogeles y la expresión génica libre de células. Por ejemplo, con esta técnica, es posible estudiar cómo la matriz de hidrogel afecta a las reacciones de CFPS11 y cómo las reacciones de CFPS pueden afectar a la matriz de hidrogel31. Los tamaños más grandes de los hidrogeles también permiten el desarrollo de nuevos materiales bioprogramables32. Por último, al incorporar las reacciones de CFPS en los hidrogeles, también se reduce potencialmente la necesidad de recipientes de reacción de plástico. Para el despliegue de sensores sin células, esto tiene claras ventajas sobre los dispositivos que dependen de los artículos de plástico. En conjunto, la incorporación de reacciones de CFPS en hidrogeles proporciona varias ventajas para el despliegue de dispositivos libres de células más allá del laboratorio.
El objetivo general de los métodos presentados aquí es permitir el funcionamiento de las reacciones de CFPS dentro de matrices de hidrogel. Se muestran dos métodos diferentes para incluir reacciones de producción de proteínas libres de células en materiales de hidrogel a macroescala (Figura 1). En el Método A, los componentes de CFPS se introducen en hidrogeles de agarosa liofilizados para formar un sistema activo. En el Método B, la agarosa fundida se mezcla con los componentes de la reacción CFPS para formar un sistema completo de hidrogel CFPS, que luego se liofiliza y se almacena hasta que se necesita. Estos sistemas se pueden rehidratar con un volumen de agua o tampón y analito para comenzar la reacción.
Este estudio utiliza sistemas basados en lisado de células de Escherichia coli. Estos son algunos de los sistemas experimentales de CFPS más populares, ya que la preparación del lisado de células de E. coli es simple, económica y logra altos rendimientos proteicos. El lisado celular se complementa con los componentes macromoleculares necesarios para realizar la transcripción y la traducción, incluidos los ribosomas, los ARNt, las aminoacil-ARNt sintetasas y los factores de iniciación, elongación y terminación. En concreto, en este trabajo se demuestra la producción de eGFP y mCherry en hidrogeles de agarosa utilizando lisados de células de E. coli y se monitoriza la aparición de fluorescencia mediante un lector de placas y microscopía confocal. Los resultados representativos para el lector de placas de microtitulación se pueden ver en Whitfield et al.31, y los datos subyacentes están disponibles públicamente 33. Además, la expresión de proteínas fluorescentes a través de los geles se confirma mediante microscopía confocal. Los dos protocolos demostrados en este artículo permiten el ensamblaje y almacenamiento de dispositivos genéticos basados en CFPS en materia con el objetivo final de crear un entorno físico adecuado para la distribución de circuitos de genes libres de células de una manera que apoye el despliegue en el campo.

<table><tbody><tr><td><Material>fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-214793B</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10752.22</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Severn Biotech</td><td>30-15-50</td><td></td></tr><tr><td>Kit de muestreo de aminoácidos</td><td>VWR</td><td></td><td></td>BTRABR1401801</tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937-1G</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>Coenzima A (CoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282-100MG</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Alfa Aesar</td><td>J14121.MC</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Carbosynth</td><td>NG01208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-25G</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149-100G</td><td></td></tr><tr><td>Lisozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522-250MG</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>757551-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD037-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Kit de concentración de proteínas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A50668</td><td></td></tr><tr><td>Rossetta 2 DE 3 E.coli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71397-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-500G</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558-1G</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Thermo Fisher Scientific 211705</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>ARNt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Alfa Aesar</td><td>J23160.MC</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubos de microcentrífuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS4323-500EA</td><td></td></tr><tr><td>10K Casetes de diálisis MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66381</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga de 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120-9500</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 1-2 LD Plus Liofilizador</td><td>Christ</td><td>N.º de pieza 101521, 101522, 101527</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H-X3R</td><td></td></tr><tr><td>Negro Placas de microtitulación de 384 pocillos</td><td>Fischer Scientific</td><td>66</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222S</td><td></td></tr><tr><td>Elga Purelab Chorus</td><td>Microcentrífuga Elga</td><td>#####</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>EP00532</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidad</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34183</td><td></td></tr><tr><td>Licencia JMP Agitador</td> magnético <td>SAS Institute</td><td>15</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fischer Scientific</td><td>15353518</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-966</td><td></td></tr><tr><td>Fotoespectrómetro (Biofotómetro)</td><td>Eppendorf</td><td>16713</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas y puntas</td><td>Gilson</td><td>#####</td><td></td></tr><tr><td>Balanza de precisión</td><td>Fluorímetro Sartorius</td><td>16384738</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitación</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>Desmembrador sónico (sonicador)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12893543</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora estática</td><td>Sanyo</td><td>MIR-162</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas y agujas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66490</td><td></td></tr><tr><td>Thermo max Q8000 (Incubadora agitadora)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Lux Lector de placas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00GD1</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Cole-parmer</td><td>OU-04724-05</td><td></td></tr><tr><td>VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/&deg; c metro</td><td>VWR</td><td>662-1657</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

Las redes de genes sintéticos proporcionan una plataforma para que los científicos e ingenieros diseñen y construyan sistemas novedosos con funcionalidad codificada a nivel genético. Si bien el paradigma dominante para el despliegue de redes de genes se encuentra dentro de un chasis celular, las redes de genes sintéticos también pueden desplegarse en entornos libres de células. Entre las aplicaciones prometedoras de las redes de genes libres de células se encuentran los biosensores, ya que se ha demostrado que estos dispositivos se encuentran contra objetivos bióticos (virus del Ébola, Zika y SARS-CoV-2) y abióticos (metales pesados, sulfuros, pesticidas y otros contaminantes orgánicos). Los sistemas libres de células generalmente se implementan en forma líquida dentro de un recipiente de reacción. Sin embargo, ser capaz de incrustar tales reacciones en una matriz física puede facilitar su aplicación más amplia en un conjunto más amplio de entornos. Con este fin, se han desarrollado métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en una variedad de matrices de hidrogel. Una de las propiedades clave de los hidrogeles que conducen a este trabajo es la alta capacidad de reconstitución en agua de los materiales de hidrogel. Además, los hidrogeles poseen características físicas y químicas que son funcionalmente beneficiosas. Los hidrogeles se pueden liofilizar para su almacenamiento y rehidratarse para su uso posterior. Se presentan dos protocolos paso a paso para la inclusión y el ensayo de reacciones de CFPS en hidrogeles. En primer lugar, se puede incorporar un sistema CFPS a un hidrogel mediante rehidratación con un lisado celular. El sistema dentro del hidrogel puede ser inducido o expresado constitutivamente para una expresión completa de proteínas a través del hidrogel. En segundo lugar, el lisado celular se puede introducir en un hidrogel en el punto de polimerización, y todo el sistema se puede liofilizar y rehidratar en un punto posterior con una solución acuosa que contiene el inductor del sistema de expresión codificado dentro del hidrogel. Estos métodos tienen el potencial de permitir redes de genes libres de células que confieren capacidades sensoriales a los materiales de hidrogel, con el potencial de ser desplegados más allá del laboratorio.

Este protocolo detalla dos métodos para incrustar reacciones de CFPS en matrices de hidrogel, con la Figura 1 presentando una descripción general esquemática de los dos enfoques. Ambos métodos son susceptibles de liofilización y almacenamiento a largo plazo. El método A es la metodología más utilizada por dos razones. En primer lugar, se ha demostrado que es el método más aplicable para trabajar con una variedad de materiales de hidrogel11. En segundo lugar, el Método...

Aquí, presentamos dos protocolos para incrustar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en matrices de hidrogel a macroescala sin la necesidad de una fase líquida externa.

Métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...

Sabemos que los sistemas vivos integran continuamente información de muchas fuentes diferentes y que estas señales desencadenan respuestas complejas y sutiles. Gran parte de este procesamiento de la información se produce a nivel molecular. Estamos interesados en operar estos procesos dentro de los materiales, pero sin células.El propósito es dar a los materiales una funcionalidad novedosa. Los desafíos en este trabajo se asocian principalmente con la reacción de síntesis de proteínas libres de células, en lugar de trabajar con hidrogel. La reacción celular requiere lisado celular de alta calidad, así como ADN de alta calidad y pureza para funcionar bien.Este protocolo permite a los investigadores incrustar reacciones de biología molecular en un material físico biodegradable que se puede llevar fuera del laboratorio. Además, debido a que la salida de la reacción interactúa directamente con el chasis del material, existe potencial para el desarrollo de materiales con nuevas capacidades de detección y respuesta. A corto plazo, consideramos que estos métodos proporcionan una nueva ruta para el despliegue de dispositivos de diagnóstico libres de células.Este protocolo permite crear una serie de dispositivos y organizarlos espacialmente de una manera que no es posible para las reacciones líquidas. Nuestros intereses futuros son dobles. En primer lugar, estamos interesados en ampliar la naturaleza de los hidrogeles que utilizamos para aportar más funcionalidad material al trabajo.En segundo lugar, estamos interesados en aumentar la complejidad y el rendimiento de las redes de genes que operamos en geles, ampliando la funcionalidad biológica de estos sistemas.

methods-for-embedding-cell-free-protein-synthesis-reactions-macro

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se presentan los protocolos de 3 dimensiones (3D) en la encapsulación de células dentro de los hidrogeles sintéticos. El procedimiento de encapsulación, se destaca por dos métodos utilizados para el entrecruzamiento (michael-tipo y además iniciada por la luz los mecanismos de los radicales libres), así como una serie de técnicas para evaluar el comportamiento de células encapsuladas.

La encapsulación celular en hidrogeles 3D para ingeniería de tejidos

En este protocolo, se demuestra la fabricación de una amplia microactuator de mensajes desplazadas verticalmente en que se basa la tecnología, y cómo esta tecnología de base pueden ser modificados para llevar a cabo de alto rendimiento de cultivo de células mecánica dinámica, tanto en la cultura de dos dimensiones y tres dimensiones paradigmas.

Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

Este video ilustrar un método rápido y eficiente de metacrilato de poli (etilenglicol), lo que permite polimerizaciones de cadena y la síntesis de hidrogel. Demostrará cómo introducir de manera similar funcionalidades metacrilamida en péptidos, detalle los métodos analíticos comunes para evaluar la eficiencia de funcionalización, proporcionar sugerencias para la solución de problemas y modificaciones avanzadas y demostrar las técnicas típicas de caracterización de hidrogel.

Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel

Se presenta la síntesis de un hidrogel de proteína dividida intein mediada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. La mezcla de los dos copolímeros de proteínas desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido que se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es altamente pH y...

Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

Describimos un proceso secuencial para la formación mediada por luz y el posterior modelado bioquímico de matrices de hidrogel sintético para aplicaciones de cultivo celular tridimensional. Se demuestra la construcción y modificación de hidrogeles con química fotoclic citocompatible. Además, se presentan técnicas sencillas para cuantificar y observar patrones y determinar la viabilidad celular dentro de estos hidrogeles.

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Diferentes métodos para manipular arquitectura tridimensional en Hidrogeles basados en proteína se evalúan aquí con respecto a las propiedades del material. Las redes macroporoso son funcionalizadas con un péptido de la célula-adhesivo, y se evalúa su viabilidad en cultivo de células utilizando dos líneas celulares de diferentes modelos.

Fácil manipulación de arquitecturas en Hidrogeles basados en proteínas para aplicaciones de la cultura de célula

En este método, utilizamos fotopolimerización e inmovilización de técnicas de química haga clic en crear patrones de proteína o péptido en la superficie del hidrogel de polietilenglicol (PEG), proporcionando señales bioactivas para el estudio de las respuestas celulares en vitro .

Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

Hidrogeles de ingeniería de la proteína recombinantes son ventajosos para el cultivo celular 3D ya que permiten completa afinabilidad de la espina dorsal del polímero y por lo tanto, el microambiente de la célula. Aquí, describimos el proceso de purificación de proteína recombinante como elastina y su aplicación en la encapsulación de la célula de hidrogel 3D.

Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D

Aquí, se presenta un protocolo para encapsular y cultivo de células en hidrogeles de poly(ethylene glycol) (PEG), funcionalizados con un fluorógenos matriz metaloproteinasa (MMP)-péptido degradable. MMP celular y actividad metabólica se miden directamente las culturas de hidrogel utilizando un lector de microplacas estándar.

Medición de metaloproteinasa de la matriz celular Global y actividad metabólica en hidrogeles 3D

Este artículo describe los protocolos para la fabricación de microgel de metacriloilo de gelatina de alto rendimiento utilizando dispositivos microfluídicos, la conversión de microgeles en polvo resuspendible (micro-aerogeles), el ensamblaje químico de microgeles para formar andamios de hidrogel granular y el desarrollo de biotintas de hidrogel granular con microporosidad preservada para bioimpresión 3D.

Andamios de hidrogel granular de metacriloilo de gelatina: fabricación de microgel de alto rendimiento, liofilización, ensamblaje químico y bioimpresión 3D

Aprende a incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles de agarosa usando lisados de E. coli. Este método permite desarrollar dispositivos diagnósticos portátiles con capacidades de detección novedosas.

Métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala

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