Name: LipidUNet-Machine Learning Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Aprende a caracterizar y cuantificar depósitos lipídicos en epitelio pigmentario retinario derivado de iPSC usando LipidUNet. Este método semiautomatizado facilita el análisis de gotas lipídicas para estudiar la degeneración macular relacionada con la edad.

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Agradecemos al núcleo histológico del Instituto Nacional del Ojo (NEI) por el uso del sistema confocal Zeiss. Este trabajo fue apoyado por los fondos NEI IRP (número de subvención ZIA EY000533-04).

Modelado y análisis de la degeneración de la retina

<ol><li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899(2017).</li>
<li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li>
<li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li>
<li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li>
<li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch%27s+membrane+and+choroid%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li>
<li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li>
<li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360(2021).</li>
<li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293(2021).</li>
<li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li>
<li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+%28Y402H%29+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li>
<li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years%2C+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020%3A+the+Right+to+Sight%3A+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li>
</ol>

Sin divulgaciones.

Este protocolo proporciona un método para etiquetar, obtener imágenes y cuantificar eficientemente los depósitos de lípidos en modelos de enfermedades in vitro monogénicas y poligénicas para enfermedades oculares degenerativas. El software basado en IA, LipidUNet, se puede aplicar a tres marcadores lipídicos comunes, APOE, Nile Red y BODIPY, y proporciona un método rápido y automático para el análisis que permite que la cuantificación sea estándar e imparcial.
La principal limitación de LipidUNet es el hecho de que el conjunto de datos de entrenamiento para la IA se limitó a imágenes de aumento de 40x de células cultivadas en una placa de 96 pocillos. Como resultado del conjunto de imágenes de entrenamiento, LipidUNet, en su forma actual, se limita a analizar imágenes de aumento de 40x. El software se puede utilizar para analizar imágenes 40x de células cultivadas en otras superficies de cultivo además de una placa de 96 pocillos, pero se debe tener cuidado de examinar las máscaras de salida generadas para verificar el umbral preciso por parte del software. Se necesitarán más conjuntos de imágenes (con diferentes aumentos) para ampliar el alcance de las muestras / imágenes que puede analizar.
El protocolo tiene varios pasos críticos. En el paso del marcador lipídico, el usuario debe confirmar que su compuesto de etiquetado elegido (BODIPY, APOE, Nile Red) ha etiquetado su muestra de manera efectiva. Las células maduras del EPR a menudo están muy pigmentadas, lo que puede afectar la señal fluorescente de la inmunotinción de anticuerpos. Cuando la señal de fluorescencia es débil o cuando hay demasiada tinción de fondo, LipidUNet no puede discernir las gotas de lípidos con precisión. Por una razón similar, se deben usar los ajustes de adquisición seleccionados correctamente para el paso de creación automática de imágenes del protocolo. Si las imágenes adquiridas son de mala calidad, LipidUNet tendrá dificultades para enmascarar adecuadamente las imágenes y, por lo tanto, la cuantificación será inexacta (Figura 6A-L). Finalmente, el post-procesamiento de las imágenes es un paso importante, ya que LipidUNet tiene requisitos específicos para que el software funcione.
En comparación con los flujos de trabajo para el análisis de lípidos que utilizan umbrales manuales, o técnicas que implican umbrales automáticos en software como Fiji, LipidUNet ofrece una segmentación no sesgada y confiable a través de imágenes con deposición de lípidos variable, como se refleja en una pequeña tasa de error en la identificación de partículas lipídicas (Figura 7). El software permite al usuario la entrada de imágenes de entrenamiento adicionales, lo que permite el análisis de conjuntos de imágenes más allá de aquellos que utilizan un objetivo de aumento de 40x o incluso aquellos que utilizan un marcador lipídico diferente, como se describe en el protocolo. En el futuro, el software será entrenado para analizar imágenes 3D de modo que sea posible la cuantificación del volumen del depósito lipídico. Las enfermedades oculares degenerativas que implican la deposición de lípidos como un importante contribuyente a la patología son prevalentes, y se prevé que los casos aumenten a medida que la población de ancianos se expanda13. Los modelos precisos de la enfermedad y las herramientas de análisis eficientes, como hemos descrito en este protocolo, permitirán el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas.

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células ubicadas en la parte posterior del ojo adyacentes a los fotorreceptores de la retina. RPE juega un papel vital en el mantenimiento de una visión adecuada al proporcionar apoyo metabólico y estructural a los fotorreceptores. Las células sanas del EPR se caracterizan por una morfología hexagonal distinta. Están conectados por uniones estrechas, que permiten que el EPR actúe como una barrera entre el coriocapilar ubicado en su lado basal y los fotorreceptores ubicados apicalmente. Para mantener el ecosistema retiniano, el EPR transporta metabolitos clave, por ejemplo, glucosa, a los fotorreceptores de una manera que minimiza el consumo de glucosa en el EPR1. Debido a esta limitación, el EPR depende de otros metabolitos para mantener sus necesidades metabólicas, incluidos los ácidos grasos, que el EPR convierte en cetonas a través de la β-oxidación2. Dada la propensión del EPR a utilizar ácidos grasos, que probablemente se reciclan de la digestión del segmento externo de los fotorreceptores (POS), como fuente de energía, los cambios perjudiciales en las vías de procesamiento de lípidos en el EPR a menudo conducen a, o están implicados en, enfermedades degenerativas de la retina monogénicas y poligénicas3.
La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), una enfermedad ocular degenerativa poligénica que causa la degeneración del EPR, también se ha relacionado con la autofagia aberrante y el metabolismo de los lípidos en la monocapa del EPR. La falla de una monocapa de EPR disfuncional para procesar POS y realizar otras funciones críticas conduce a depósitos extracelulares (sub-RPE) llamados depósitos lineales basales (BLinD) ubicados entre el EPR y la membrana de Bruch, un sello distintivo de las patologías de DMAE. Los principales componentes de BLinD incluyen lipoproteínas, la más abundante de las cuales es la apolipoproteína E (APOE)4. La acumulación de capas delgadas de BLinD puede conducir a drusas blandas, que se reconoce como un síntoma clínico de AMD 5,6.
Varios grupos han demostrado que los modelos de enfermedad in vitro derivados de células madre que causan disfunción del EPR presentan acumulación de lípidos sub-EPR 7,8,9. Hallam et al. (2017) generaron RPE derivado de células madre pluripotentes inducidas (iRPE) de pacientes con un alto riesgo de DMAE debido a un polimorfismo del gen CFH. El iRPE mostró acumulación de drusas, marcada por APOE, y el RPE de alto riesgo acumuló depósitos mayores que el iRPE generado a partir de pacientes de bajo riesgo10.
Para crear un modelo in vitro que recapitule las características celulares de la DMAE, como las gotas de lípidos y la deposición de drusas, se establecieron líneas de iRPE generadas a partir de muestras de sangre de pacientes utilizando un protocolo guiado por el desarrollopreviamente publicado 11. Los iRPE fueron sometidos a suero humano competente para el complemento (CC-HS), una solución que contiene anafilatoxinas que imitan una posible causa de DMAE: aumento de la señalización alternativa del complemento8. La deposición celular y subcelular resultante de depósitos de lípidos se midió utilizando marcadores lipídicos y lipoproteicos de uso común, APOE, Nile Red y BODIPY. A través de estos marcadores, se demostró que la señalización activada del complemento a través de CC-HS exacerbó la acumulación de lípidos en las células iRPE8.
Para desarrollar un modelo de enfermedad para una enfermedad degenerativa retiniana monogénica, se desarrollaron líneas iRPE a partir de pacientes con enfermedad de Stargardt, una enfermedad causada por mutaciones en el gen ABCA4 en RPE. Se ha demostrado previamente que cuando ABCA4 es eliminado, la lipofuscina A2E, un depósito intracelular conocido por contener altos niveles de fosfolípidos y productos de peroxidación lipídica dependientes de la luz, se acumula dentro del RPE12. Las líneas knockout ABCA4 se desarrollaron junto con las líneas de pacientes, y ambas fueron sometidas a alimentación POS. El Stargardt iRPE demostró patología inducida por fagocitosis POS, exhibiendo una mayor acumulación de lípidos cuantificada por la tinción BODIPY. Los EPR derivados de las iPSC ABCA4 KO se sometieron a tratamiento CC-HS; la cuantificación de la señal de BODIPY también mostró un defecto en el manejo de lípidos en el modelo de enfermedad de Stargardt9.
Dada la prevalencia de estas enfermedades y la necesidad de terapias eficaces, junto con los modelos de enfermedad relevantes descritos anteriormente, es necesario establecer métodos sólidos para cuantificar la eficacia de los tratamientos potenciales. Para cuantificar los depósitos de lípidos de una manera objetiva, automatizada y estandarizada, se creó un software basado en el aprendizaje automático, LipidUNet, para que, cuando se combina con herramientas de análisis de máscaras, la deposición de lípidos se pueda identificar de manera rápida y efectiva utilizando los marcadores comunes Nile Red, BODIPY y APOE. Las estadísticas resumidas obtenidas utilizando esta tubería de análisis se pueden analizar y mostrar gráficamente, lo que permite una fácil comparación de las condiciones de tratamiento. El esquema del protocolo se muestra en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del protocolo: las células del EPR se cultivan en una placa de 96 pocillos y se desafían con suero humano activo o segmentos externos bovinos purificados para modelar diferentes tipos de degeneraciones retinianas in vitro. Las células del EPR se fijan y tiñen para depósitos de lipoproteínas con Nile Red, BODIPY y APOE. Se utiliza un microscopio confocal para adquirir pilas Z de partículas lipídicas marcadas con fluorescencia, que posteriormente se procesan en proyecciones de intensidad máxima 2D. Se entrenó un algoritmo de aprendizaje automático para reconocer y segmentar correctamente las partículas de lipoproteínas. Se generan tablas de resumen que contienen el recuento de partículas y varias métricas de forma que se pueden utilizar para el trazado posterior y el análisis estadístico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; m Sistema de filtrado Steriflip</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>1x Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-Triyodo-L-tironina</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Bovina, Fracción V</td><td>MP Biomedical</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 conejo anti-cabra IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21431</td><td>APOE anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>anticuerpo primario APOE</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB947</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>Proteger de la luz</td></tr><tr><td>Complemento suero humano competente</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1-LITER</td><td></td></tr><tr><td>CTS N2 Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>A13707-01</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01 Medios de montaje de</td><td>portaobjetos</td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio Deslizadores # 1 1/2 22 mm x 22 mm</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica 72204-01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio 25 mm x 75 mm- 1,2 mm de espesor</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>71870-01</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha</td><td>Life Technologies</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales Life</td><td>Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Nilo Red</td><td>Sigma</td><td>72485-100MG</td><td>Proteger de la luz</td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído al 16%, ciencias</td><td>de microscopía electrónica de</td> grado EM <td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptococo</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato 10x</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Segmentos exteriores de varilla (OS)</td><td>InVision Bioresources</td><td>98740</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725274</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Ultrapure</td><td>Affymetrix</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Life Technologies</td><td>A14701SA</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato R</td><td>& D Sistemas</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

lipidunet-machine learning based method of characterization and quantification of lipid deposits using ipsc-derived retinal pigment epithelium

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células hexagonales ubicadas en la parte posterior del ojo. Proporciona alimento y apoyo a los fotorreceptores y capilares coroideos, realiza fagocitosis de segmentos externos fotorreceptores (POS) y secreta citoquinas de manera polarizada para mantener la homeostasis de la retina externa. El EPR disfuncional, causado por mutaciones, envejecimiento y factores ambientales, resulta en la degeneración de otras capas de la retina y causa pérdida de la visión. Una característica fenotípica distintiva de la degeneración del EPR son los depósitos ricos en lípidos intra y subcelulares. Estos depósitos son un fenotipo común en diferentes enfermedades degenerativas de la retina. Para reproducir el fenotipo de depósito lipídico de las degeneraciones retinianas monogénicas in vitro, se generó RPE derivado de células madre pluripotentes inducidas (iRPE) a partir de los fibroblastos de los pacientes. Las líneas celulares generadas a partir de pacientes con Stargardt y enfermedad de degeneración retiniana de inicio tardío (L-ORD) se alimentaron con POS durante 7 días para replicar la función fisiológica del EPR, lo que causó la patología inducida por fagocitosis POS en estas enfermedades. Para generar un modelo para la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), una enfermedad poligénica asociada con la activación alternativa del complemento, el iRPE fue desafiado con anafilatoxinas alternativas del complemento. Los depósitos lipídicos intra y subcelulares se caracterizaron utilizando rojo del Nilo, boro-diprometeno (BODIPY) y apolipoproteína E (APOE). Para cuantificar la densidad de los depósitos lipídicos, se desarrolló un software basado en el aprendizaje automático, LipidUNet. El software fue entrenado en imágenes de proyección de máxima intensidad de iRPE en superficies de cultivo. En el futuro, será entrenado para analizar imágenes tridimensionales (3D) y cuantificar el volumen de gotas de lípidos. El software LipidUNet será un recurso valioso para descubrir fármacos que disminuyan la acumulación de lípidos en modelos de enfermedades.

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo para identificar depósitos de lípidos teñidos por Nile Red, BODIPY y APOE. El software desarrollado puede identificar y cuantificar automáticamente los depósitos de lípidos y funciona mejor cuando se optimiza el protocolo descrito. Se incluyen ejemplos de EPR diferenciado con éxito (Figura 3A) y EPR pobremente diferenciado (Figura 3B), ya que la calidad del modelo celular afecta en gran medida la calidad de la segmentación adecuada de la imagen.
Dos de los tres marcadores descritos en el protocolo, Nile Red y BODIPY, se identifican como pequeños puntos circulares que son claramente brillantes en imágenes fluorescentes (Figura 5 y Figura 6). Una imagen "positiva" del protocolo sería una identificación apropiada de estos depósitos distintos (Figura 5A-D y Figura 5E-H). Un resultado "negativo" mostraría una segmentación incorrecta de la imagen al confundir la fluorescencia de fondo con un depósito, ya sea debido a una tinción débil (Figura 6A-C y Figura 6D-F) o debido a una alta intensidad de fondo (Figura 6G-I).
Los depósitos de APOE tienen una variedad de tamaños y formas, apareciendo más ovalados o irregulares en lugar de los depósitos circulares de Nile Red y BODIPY. Estos depósitos también son menos punteados, y la intensidad de la señal puede diferir entre depósitos debido a variaciones en la permeabilización de la muestra. La identificación correcta identificará cada depósito, incluidos aquellos que están menos saturados (Figura 5I-L), mientras que la segmentación incorrecta no recogerá estos depósitos (Figura 6J-L). Por lo tanto, es importante optimizar los métodos de tinción e imagen para evitar variaciones drásticas. Una forma de hacerlo es prestando especial atención a los pasos de permeabilización de la muestra durante la inmunotinción. Para optimizar la señal fluorescente, las células pueden ser lisadas antes de la fijación e inmunotinción para APOE, lo que resulta en una saturación uniforme y una mejor segmentación de los depósitos de APOE.
También se proporcionan imágenes segmentadas de células maduradas en una plataforma de cultivo que no sea una placa de 96 pocillos. El software LipidUNet se ejecutó en imágenes de células cultivadas en un pozo trans, y mientras que los depósitos de lípidos están umbralizados, también lo son los poros en la membrana del transpozo (Figura 6M-O). Debido a la similitud en forma y tamaño, el software LipidUNet en su forma actual enmascarará tanto los depósitos de lípidos como los poros transwell indiscriminadamente.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> Figura 5: Resultados representativos. (A,E,I) El EPR chapado en 96 pocillos se tiñe con tinción nuclear de Hoechst (azul) y rojo del Nilo (magenta), BODIPY (verde) o APOE (naranja) y son las proyecciones de intensidad máxima de una pila Z. (B, F, J) Las imágenes de entrada en escala de grises para el software LipidUNet después del procesamiento de imágenes. (C, G, K) Máscaras generadas por LipidUNet, donde todos los depósitos están identificados correctamente. (D,H,L) Los contornos de cada partícula enmascarada están numerados. Estas etiquetas permiten conectar cada partícula de la imagen a una entrada en el spreadheet con los datos en bruto. (A-D) muestra la tinción del Rojo del Nilo, y el software es capaz de reconocer los depósitos contra el fondo con precisión a pesar de una señal más débil. (E-H) muestra un fuerte contraste entre la señal BODIPY y el fondo, lo cual es ideal. LipidUNet identifica correctamente cada depósito en la imagen. (I-L) muestra una fuerte señal APOE y representa la variabilidad de la saturación de la señal que a menudo se ve con esta tinción. No obstante, la segmentación de imágenes es capaz de identificar los bordes de cada depósito APOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> Figura 6: Resultados subóptimos. (A,D,G,J,M) El EPR de 96 pocillos se tiñe con tinción nuclear de Hoechst (azul) y rojo del Nilo (magenta), BODIPY (verde) o APOE (naranja) y son las proyecciones de intensidad máxima de una pila Z. (B, E, H, K, N) Las imágenes de entrada en escala de grises para el software LipidUNet después del procesamiento de imágenes. (C,F,I,L,O) Las máscaras incorrectas generadas por LipidUNet. Los círculos rojos indican dónde el software ha identificado incorrectamente un depósito de lípidos. (A-C) El procesamiento de Nile Red es incorrecto porque el software ha identificado la tinción de fondo como un depósito. Esto puede suceder más a menudo cuando hay un fondo alto pero pocos depósitos de lípidos en la imagen. Se muestran dos ejemplos de tinción BODIPY: una imagen de mala calidad debido a la tinción BODIPY débil (D-F) y (G - I) una señal BODIPY fuerte con fondo alto. En ambos casos, el software es incapaz de distinguir pequeños depósitos de lípidos circulares del anillo circular de fondo que rodea el núcleo. Si bien la tinción y las imágenes deben optimizarse para evitar estos errores, la versión más reciente de LipidUNet se ha mejorado en gran medida para estas imágenes. (J-L) Segmentación incorrecta de APOE. Dado que los depósitos son más variables en tamaño y saturación de señal, el software tiene dificultades para reconocer algunos depósitos. (M-O) RPE sembrado en un pozo trans y teñido con Rojo del Nilo. Aquí se muestra una rebanada de la pila Z con depósitos de lípidos de Nile Red y poros transwell. El software es incapaz de distinguir entre los dos, como se muestra por el círculo rojo que contiene poros transwell y la flecha verde que apunta a los depósitos de Nilo Red. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> Figura 7: Comparación de herramientas de máscara. (A, B, C) El EPR de 96 pocillos con cantidades variables de deposición de lípidos se identifica con rojo del Nilo (rojo). Las imágenes se enmascaran utilizando tres métodos de enmascaramiento comunes diferentes, Find Maxima, Max Entropy y Renyi Entropy, y se comparan con la máscara generada por LipidUNet. La imagen original se acompaña de un recuento manual de los depósitos de lípidos, mientras que las máscaras muestran los recuentos previstos por cada método de segmentación. La tasa de error media se calculó para cada método de segmentación utilizando la siguiente fórmula: media[(|Recuento previsto - Recuento manual|/Conteo manual) x 100]. La máscara generada por LipidUNet identifica con mayor precisión los depósitos de lípidos en las imágenes con deposición variable en comparación con otros métodos de enmascaramiento (tasas de error promedio: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropy, 203% Renyi Entropy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Número de gato</td>
			<td>Stock Conc.</td>
			<td>Final Conc.</td>
			<td>Ml</td>
		</tr><tr><td>MEM alfa</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>Suplemento N2</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>NA</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FBS inactivado por calor</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>NA</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>NMEM NEAA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10mM</td>
			<td>0,01 mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Piruvato de sodio</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100mM</td>
			<td>1mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u/mL</td>
			<td>100U/mL</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Taurina</td>
			<td>T4571</td>
			<td>50mg/mL</td>
			<td>250ug/mL</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>Hidrocortisona</td>
			<td>H6909</td>
			<td>18.1mg/L</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>T3</td>
			<td>T5516</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0.013ug/L</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Volumen total, ml</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Composición del reactivo RPE-MM. Una lista de reactivos y concentraciones óptimas para RPE-MM.

Las enfermedades oculares degenerativas que afectan la capa del epitelio pigmentario de la retina del ojo tienen orígenes monogénicos y poligénicos. Se han desarrollado varios modelos de enfermedades y una aplicación de software, LipidUNet, para estudiar los mecanismos de la enfermedad, así como posibles intervenciones terapéuticas.

LipidUNet-Machine Learning Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

En este estudio, nuestro objetivo es comprender la patogénesis de la macrodegeneración relacionada con la edad y encontrar el tratamiento potencial para ella. Esta tubería semiautomatizada para el análisis de gotas de lípidos proporciona un sistema robusto para estudiar el metabolismo y las enfermedades del envejecimiento. Nuestro laboratorio se centra en la búsqueda de dianas farmacológicas para el tratamiento de la DMAE, ya sea mediante cribados genéticos o de moléculas pequeñas que tienen como objetivo reducir la acumulación de depósitos de lípidos.

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El perfil de madre humanas pluripotentes inducidas (iPS), el epitelio pigmentario de la retina (RPE) derivadas de células (iPS) (iPS-RPE) inducido por el hombre-madre pluripotentes, y RPE fetal microRNA (miRNA), fueron comparados.

Perfiles de expresión de microARN de las células iPS humanas, de la retina del epitelio pigmentario Derivado de Ips y Fetal epitelio pigmentario de la retina

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) apoya la retina sensorial a través del reciclaje de los subproductos del ciclo visual, que se acumulan como lipofuscina. Estos productos son autofluorescentes y pueden ser visualizados cualitativamente in vivo. Aquí, describimos un método para obtener imágenes cuantitativas de lipofuscina RPE mediante oftalmoscopia láser de barrido confocal.

Cuantitativa del fondo de ojo autofluorescencia para la Evaluación de Enfermedades de la Retina

Describimos un método para separar eficientemente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) de la retina en los ojos humanos y generar montones planos completos de EPR / coroides para análisis histológicos y morfométricos del EPR.

Generación eficiente y consistente de epitelio pigmentario retiniano/cordoides de montaje plano a partir de ojos humanos para análisis histológico

Los modelos de ratón pueden ser herramientas útiles para investigar la biología del epitelio pigmentado de la retina (EPR). Se ha establecido que los ratones pueden desarrollar una serie de patologías del EPR. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para dilucidar y cuantificar patologías de EPR en ratones utilizando luz, electrones de transmisión y microscopía confocal.

Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad

Este protocolo describe un modelo de acumulación de lipofuscina en cultivos epiteliales pigmentarios (EPR) humanos altamente diferenciados y polarizados y un ensayo de fagocitosis de segmento externo (SG) mejorado para detectar la capacidad total de consumo/degradación de SG del EPR. Estos métodos superan las limitaciones de los modelos anteriores de lipofuscina y los ensayos clásicos de fagocitosis del segmento externo de persecución de pulsos.

Modelos mejorados de lipofuscina y cuantificación de la capacidad de fagocitosis del segmento externo en cultivos epiteliales de pigmento retiniano humano altamente polarizados

El presente estudio describe metodologías basadas en la descelularización para visualizar y cuantificar la deposición de tejido adiposo intramuscular (IMAT) a través del volumen muscular intacto, así como cuantificar las métricas de los adipocitos individuales que componen IMAT.

Cuantificación basada en la descelularización de la infiltración grasa del músculo esquelético

El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es un epitelio de múltiples funciones del ojo. Aquí presentamos un protocolo para establecer cultivos celulares primarios derivados del RPE murino.

Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

Nilo rojo de fijo Caenorhabditis elegans es un método para la medición cuantitativa de los depósitos de lípidos neutros, mientras que el aceite rojo O tinción facilita la evaluación cualitativa de la distribución de lípidos entre los tejidos.

Cuantificación de lípidos abundancia y evaluación de la distribución de lípidos en Caenorhabditis elegans por Nilo rojo y aceite rojo O manchas

Esta técnica describe la grabación en tiempo real del consumo de oxígeno y los tipos de acidificación extracelular en los tejidos retinianos explanted ratón utilizando un analizador de flujo extracelular.

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

La formación de una red adecuada de sarcomere es importante para la maduración de los cardiomiocitos derivados del iPSC. Presentamos un enfoque basado en la super resolución que permite la evaluación cuantitativa de la maduración estructural de los cardiomiocitos derivados de células madre, para mejorar las condiciones de cultivo promoviendo el desarrollo cardíaco.

Análisis de la red α-Actinin en cardiomiocitos humanos derivados de iPSC mediante microscopía de localización de molécula única

Aprende a caracterizar y cuantificar depósitos lipídicos en epitelio pigmentario retinario derivado de iPSC usando LipidUNet. Este método semiautomatizado facilita el análisis de gotas lipídicas para estudiar la degeneración macular relacionada con la edad.

LipidUNet-Machine Learning Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium (Video) | JoVE Journal

LipidUNet-Machine Learning Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

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