Name: Identificación de péptidos de pequeñas vesículas extracelulares a partir de macrófagos derivados de la médula ósea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprende a identificar el peptidoma de pequeñas vesículas extracelulares derivadas de macrófagos mediante ultracentrifugación diferencial y espectrometría de masas. Este protocolo revela funciones clave en la inmunidad innata.

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Este estudio contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de China (3157270). Agradecemos al Dr. Feng Shao (Instituto Nacional de Ciencias Biológicas, China) por proporcionar iBMDM.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares y extracción de su peptidoma

<ol><li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li>
<li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+secreted+vesicles+and+intercellular+communications%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+PD-L1+contributes+to+immunosuppression+and+is+associated+with+anti-PD-1+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response.</a> Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).</li>
<li>Ti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS-preconditioned+mesenchymal+stromal+cells+modify+macrophage+polarization+for+resolution+of+chronic+inflammation+via+exosome-shuttled+let-7b%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 308(2015).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+S100A4+derived+from+highly+metastatic+hepatocellular+carcinoma+cells+promotes+metastasis+by+activating+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187(2021).</li>
<li>Xun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-derived+exosomal+miR-138-5p+modulates+polarization+of+tumor-associated+macrophages+through+inhibition+of+KDM6B%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B.</a> Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).</li>
<li>Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer+development+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer development and clinical applications.</a> Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).</li>
<li>Mashouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis%2C+and+mechanisms+in+cancer+metastasis+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 75(2019).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+opportunity%2C+and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).</li>
<li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+exosome+isolation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li>
<li>Palanski, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+urine+peptidomics+workflow+identifies+chemically+defined+dietary+gluten+peptides+from+patients+with+celiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease.</a> Nature Communications. 13, 888(2022).</li>
<li>Kalaora, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+bacteria-derived+HLA-bound+peptides+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma.</a> Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).</li>
<li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+bioactive+peptides+for+biomaterials+design+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics.</a> Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+proteolysis+of+bioactive+peptides+using+a+peptidomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach.</a> Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).</li>
<li>Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidome%3A+Chaos+or+inevitability%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Peptidome: Chaos or inevitability.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128(2021).</li>
<li>Keller, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+exosomes+provide+protection+against+bacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins.</a> Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).</li>
<li>Koeppen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let-7b-5p+in+vesicles+secreted+by+human+airway+cells+reduces+biofilm+formation+and+increases+antibiotic+sensitivity+of+P.+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118(2021).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Al investigar la función de los sEV, es imperativo obtener sEV de alta pureza a partir de muestras biológicas complejas para evitar cualquier contaminación potencial. Se han desarrollado una variedad de métodos para el aislamiento de los sEV13, y entre estos métodos, los métodos basados en la ultracentrifugación diferencial han demostrado una pureza relativamente alta de los sEV. En este estudio, se recolectaron 200 mL de sobrenadante celular durante 6 h, y se obtuvieron alrededor de 200-300 μg de...

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) con un diámetro inferior a 200 nm están presentes en casi todos los tipos de fluidos corporales y son secretadas por todo tipo de células, incluyendo la orina, el sudor, las lágrimas, el líquido cefalorraquídeo y el líquido amniótico1. Inicialmente, los vehículos eléctricos se consideraron como receptáculos para la eliminación de desechos celulares, lo que llevó a una investigación mínima en la década siguiente2. Recientemente, cada vez hay más pruebas de que los sEV contienen proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y otros metabolitos específicos. Estas moléculas son transportadas a las células diana3, contribuyendo a la comunicación intercelular, a través de la cual participan en diversos procesos biológicos, como la reparación de tejidos, la angiogénesis, la inmunidad4 y la inflamación 5,6, el desarrollo tumoral y la metástasis 7,8,9, etc.
Para facilitar el estudio de los sEV, es imperativo aislarlos de muestras complejas. Se han desarrollado diferentes métodos de aislamiento de sEVs basados en las propiedades físicas y químicas de los sEVs, como su densidad, tamaño de partícula y proteínas marcadoras de superficie. Estas técnicas incluyen métodos basados en ultracentrifugación, métodos basados en el tamaño de partículas, métodos basados en captura de inmunoafinidad, métodos basados en precipitación de sEVs y métodos basados en microfluídica10,11,12. Entre estas técnicas, el método basado en la ultracentrifugación es ampliamente reconocido como el estándar de oro para el aislamiento de sEV y es la técnica más utilizada13.
Una cantidad creciente de evidencia sugiere la presencia de una multitud de péptidos biológicamente activos no descubiertos en los peptidomos de varios organismos. Estos péptidos contribuyen significativamente a numerosos procesos fisiológicos mediante la regulación del crecimiento, el desarrollo, la respuesta al estrés 14,15 y la transducción de señales16. El objetivo del peptidomo de los sEV es descubrir los péptidos transportados por estos sEV y proporcionar pistas sobre sus funciones biológicas. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento de sEVs a través de ultracentrifugación diferencial, seguido de la extracción de péptidos de estos sEVs para un análisis más detallado de su peptidoma.

<table><tbody><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Beyotime Technology</td><td>P0012</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>Beyotime Technology</td><td>AF1192</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de filtro centrífugo</td><td>Millipore</td><td>UFC5010BK</td><td></td></tr><tr><td>Botellas de centrífuga de polipropileno</td><td>Beckman Coulter</td><td>357003</td><td>Centrífuga de alta velocidad</td></tr><tr><td>Sustrato quimioluminiscente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Solarbio</td><td>D8220</td><td>100 g</td></tr><tr><td>DMEM medio</td><td>de cultivo Cell World</td><td>N? A</td><td></td></tr><tr><td>GRP94</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>20292</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidad</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti JXN-26</td><td>Rotor centrífugo (JA-25.50)</td></tr><tr><td>Macrófagos derivados de la médula ósea inmortalizados (iBMDM)</td><td>Instituto Nacional de Ciencias Biológicas, China</td><td></td><td>Proporcionado por el Dr. Feng Shao (Instituto Nacional de Ciencias Biológicas, China)</td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Sigma</td><td>l1149</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Tubo de microfuga polipropileno</td><td>Beckman Coulter</td><td>357448</td><td>1,5 mL, Ultracentrífuga de sobremesa&nbsp;</td></tr><tr><td>sistema LC de nano-alto rendimiento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EASY-nLC 1000</td><td></td></tr><tr><td>Análisis de seguimiento de nanopartículas&nbsp;</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight NTA3.4</td></tr><tr><td>Orbitrap Q Exactive HF-X espectrómetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de polialómero Beckman</td><td>Coulter</td><td>326823</td><td>Ultracentrífuga</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa</td><td>Bimake</td><td>B14002</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de vacío SpeedVac</td><td>Concentrador Eppendorf</td><td>plus</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga de sobremesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima MAX-XP</td><td>Rotor de ultracentrífuga (TLA 55)</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>HITACHI</td><td>H-7650B</td><td></td></tr><tr><td>TSG101</td><td>Sigma</td><td>AF8258</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima XPN-100</td><td>Rotor ultracentrífugo (SW32 Ti)</td></tr><tr><td>Disruptor celular ultrasónico</td><td>Scientz</td><td>SCIENTZ-IID</td><td></td></tr><tr><td>Generador de imágenes Western Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDocXRs</td><td>Laboratorio de imágenes 4.0 (beta 7)</td></tr><tr><td>&beta;-actina</td><td>Sigma</td><td>A3853</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de péptidos de pequeñas vesículas extracelulares a partir de macrófagos derivados de la médula ósea

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) suelen ser secretadas por la exocitosis de los cuerpos multivesiculares (MVB). Estas nanovesículas con un diámetro de <200 nm están presentes en diversos fluidos corporales. Estos sEV regulan diversos procesos biológicos como la transcripción y traducción de genes, la proliferación y supervivencia celular, la inmunidad y la inflamación a través de sus cargas, como proteínas, ADN, ARN y metabolitos. En la actualidad, se han desarrollado diversas técnicas para el aislamiento de los sEV. Entre ellos, el método basado en ultracentrifugación se considera el estándar de oro y se usa ampliamente para el aislamiento de vehículos eléctricos. Los péptidos son naturalmente biomacromoléculas con menos de 50 aminoácidos de longitud. Estos péptidos participan en una variedad de procesos biológicos con actividad biológica, como hormonas, neurotransmisores y factores de crecimiento celular. El peptidomo está destinado a analizar sistemáticamente péptidos endógenos en muestras biológicas específicas mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Aquí, introdujimos un protocolo para aislar sEVs por ultracentrifugación diferencial y extrajimos peptidoma para su identificación por LC-MS/MS. Este método identificó cientos de péptidos derivados de sEVs de macrófagos derivados de la médula ósea.

Para los sEVs aislados por ultracentrifugación diferencial (Figura 1), se evaluó su morfología, distribución granulométrica y marcadores proteicos según la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV)17.
En primer lugar, la morfología de los sEV fue observada por TEM, mostrando una estructura típica en forma de copa (Figura 2A). La NTA mostró que los sEV aislados se concentraban principalmente a 13...

Este protocolo describe un procedimiento para aislar pequeñas vesículas extracelulares de macrófagos mediante ultracentrifugación diferencial y extraer el peptidomo para su identificación por espectrometría de masas.

Identificación de péptidos de pequeñas vesículas extracelulares a partir de macrófagos derivados de la médula ósea

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...

Exploramos el papel funcional de las vesículas extracelulares en la inmunidad innata. Hemos desarrollado un protocolo para aislar pequeñas vesículas extracelulares, o sEVs, a través de ultracentrifugación diferencial e identificar el peptidoma por LC-MS/MS, revelando las funciones biológicas clave de los péptidos en sEVs. Se ha demostrado que las vesículas extracelulares median la comunicación intercelular mediante el transporte de carga a las células receptoras, como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos.Al liberar componentes antimicrobianos, actúan como la primera línea de defensa contra los microbios invasores en la inmunidad innata. Si bien la ultracentrifugación diferencial produce pequeños sEV extracelulares de alta pureza, puede llevar mucho tiempo y, a menudo, da como resultado bajos rendimientos. En nuestro estudio, estos son los principales desafíos para la identificación estable de péptidos de baja abundancia en los sEV.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

Los macrófagos han sido reconocidos como un componente crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa. La reciente explosión de conocimientos relativos a los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de la interacción entre los macrófagos y los microbios ha renovado la atención científica a los macrófagos. Este artículo describe un método para diferenciar los macrófagos de médula ósea de ratón.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Se presentan métodos para evaluar la capacidad fagocitaria de primarias macrófagos derivados de médula ósea murinas utilizando la ruina del myelin fluorescencia etiquetada y tinción de gota de lípidos intracelulares.

In Vitro Fagocitosis de la ruina del Myelin por macrófagos derivados de médula ósea

Presentamos un protocolo detallado para aislar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) de tejidos todo, incluyendo a muestras de cerebro y del tumor. Este método ofrece una técnica reproducible para extraer EVs de tejido sólido para mayores análisis aguas abajo.

Extracción de vesículas extracelulares de todo tejido

El presente informe destaca los requisitos cronológicos para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) de la microglia o de los macrófagos sanguíneos. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia se evaluaron como reguladores del crecimiento de la neurita, mientras que los vehículos eléctricos derivados de macrófagos sanguíneos se estudiaron en el control de la invasión de células de glioma C6 en ensayos in vitro. El objetivo es comprender mejor estas funciones EV como mediadores...

Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunes y estudio del impacto funcional en el entorno celular

El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.

Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

Este protocolo demuestra cómo aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC-sEV) con un entorno de laboratorio simple. La distribución del tamaño, la concentración de proteínas, los marcadores de sEV y la morfología de los hUC-MSC-sEV aislados se caracterizan por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el ensayo de proteínas BCA, el western blot y el microscopio electrónico de transmisión, respectivamente.

Un método simple de filtración de sobremesa para aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales humanas

Este protocolo describe todos los procedimientos, desde el cultivo de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (ADSC) y la recolección de sobrenadante hasta la extracción de vesículas extracelulares (EV) mediante ultracentrifugación.

Purificación y Caracterización de Vesículas Extracelulares a partir de Células Madre Mesenquimales Derivadas del Adiposo Humano

Aquí, establecemos un protocolo utilizando cantidades mínimas de secciones de tejido cerebral recién congelado y un método de centrifugación de alta velocidad accesible junto con cromatografía de exclusión por tamaño para obtener pequeñas vesículas extracelulares como fuentes de biomarcadores de microARN (miARN) para trastornos neurológicos.

Aprovechamiento del poder de las cargas de microARN en pequeñas vesículas extracelulares liberadas de secciones de cerebro humano recién congeladas 

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Se presenta un protocolo para la producción, purificación y uso de vesículas de membrana externa (OMV) empaquetadas en enzimas que proporcionan una mayor estabilidad enzimática para su implementación en diversas aplicaciones.

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

Aprende a identificar el peptidoma de pequeñas vesículas extracelulares derivadas de macrófagos mediante ultracentrifugación diferencial y espectrometría de masas. Este protocolo revela funciones clave en la inmunidad innata.

Identificación de péptidos de pequeñas vesículas extracelulares a partir de macrófagos derivados de la médula ósea

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