Name: Hibridación in situ de fluorescencia de ARN para la localización de ARN no codificante largo en células de osteosarcoma humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprende a localizar ARN no codificante largo en células de osteosarcoma humano mediante hibridación in situ de fluorescencia. Este protocolo detallado utiliza SNHG6 como referencia para investigadores en biología del cáncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de (1) el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2020YFE0201600); (2) la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza (81973877 y 82174408); (3) Centro de Innovación Colaborativa de Shanghái de Transformación Industrial de Preparación de MTC Hospitalaria; (4) Proyectos de investigación dentro del presupuesto de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái (2021LK047).

Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo. La Figura 1 muestra el protocolo general para ARN FISH; La Tabla 1 contiene la composición de todas las soluciones y la Tabla 2 contiene las secuencias de cebadores utilizadas en este protocolo.
1. Preparación de la sonda
<ol><li>Identificar y adquirir la secuencia FASTA de un lncRNA diana de interés, por ejemplo, de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Siguiendo las indicaciones del sitio web, diseñe las sondas ISH en línea19 y revise las sugerencias del algoritmo de diseño para enumerar las sondas que se pedirán con la etiqueta Cy3.</li>
	<li>Incubar el tampón de hibridación a 37 °C durante 2 h de antelación.</li>
	<li>Disuelva 4 sondas de densidad óptica (OD) en 160 μL de ddH2O tratado con dietilpirocarbonato (DEPC) a una concentración de 1 mg/ml lejos de la luz. NOTA: La densidad óptica (DO) representa la unidad de medida del ADN y el ARN. Por lo general, 1 unidad OD = 33 μg/mL de ADN.</li>
	<li>Prepare 200 μL de la mezcla de la sonda para cada pocillo (1,2 μL-10 μL de sonda, 70 μL de tampón de hibridación, componga el volumen con ddH2 O tratadocon DEPC a 200 μL) y configure una serie de 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL y 6 μg/mL. NOTA: La concentración de la sonda debe explorarse experimentalmente de antemano. Una concentración alta de la sonda conducirá a una unión inespecífica de lncRNAs, mientras que una concentración baja de la sonda conducirá a una detección insensible o fallida de lncRNAs.</li>
	<li>Desnaturalizar la mezcla de la sonda a 73 °C durante 5 min. NOTA: Si la sonda de ADN marcada con Cy3 es bicatenaria, desnaturalice la sonda a ADN monocatenario a 95 °C durante 5 minutos, luego enfríe rápidamente durante 2 minutos en hielo.</li>
</ol>2. Preparación celular
<ol><li>Siembre 50.000 células 143B por pocillo en cubreobjetos de vidrio estériles en una placa de cultivo celular de 12 pocillos e incube durante 24 h (37 °C, 5% de CO2) en DMEM. NOTA: El número específico de células sembradas aquí varía con el tamaño de la célula, lo cual es apropiado para que las células sembradas alcancen una confluencia del 50% después de ser incubadas durante 24 h. Los cubreobjetos de vidrio estéril son redondos para ser adecuados para la placa de 12 pocillos.</li>
	<li>Retire el medio y lave durante 2 x 5 minutos con 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS). NOTA: Prepare 1x PBS con ddH2O. No se puede usar PBS sin tratamiento con DEPC porque contiene RNasa. Realice todos los pasos siguientes en condiciones libres de RNasa.</li>
	<li>Retire 1x PBS y agregue 200 μL de etanol al 100% en cada pocillo para fijar durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el etanol, agregue 200 μL de Triton X-100 al 0,1% (en 1x PBS) en cada pocillo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. NOTA: El tiempo debe controlarse estrictamente con la permeabilización Triton X-100 y no puede ser demasiado largo.</li>
	<li>Retire Triton X-100 al 0,1% y lave 2 x 5 min con 1x PBS. NOTA: Si el protocolo tiene que ser pausado aquí, reemplace el PBS con etanol al 70% (dilución de etanol al 100% con ddH2O libre de RNasa) y almacene la muestra a 4 °C durante un máximo de 3 meses.</li>
	<li>Retirar 1x PBS, añadir 200 μL de tampón de citrato salino sódico (SSC) 2x (dilución de 20x SSC con ddH2O sin RNasa) en cada pocillo e incubar durante 30 min a 37 °C.</li>
	<li>Retire 2 tampones SSC, agregue 200 μL de etanol al 70% en cada pocillo e incube durante 3 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche el etanol al 70%, agregue 200 μL de etanol al 85% (dilución de etanol al 100% con ddH2O libre de ARNasa) en cada pocillo e incube durante 3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche el etanol al 85%, agregue 200 μL de etanol al 100% en cada pocillo e incube durante 3 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Absorber y desechar etanol al 100%; Deja que los pozos se sequen.</li>
</ol>3. Hibridación fluorescente in situ (FISH)
<ol><li>Añadir 200 μL de mezcla de sonda (desnaturalizada como en el paso 1.5) a cada pocillo e incubar a 37 °C durante la noche (16-18 h). NOTA: Existe una fuerte correlación positiva entre la temperatura de hibridación y la concentración de la sonda; Por lo tanto, para optimizar el fondo, se debe reducir tanto la temperatura de hibridación como la concentración de la sonda.</li>
	<li>Al día siguiente, saque muestras a 37 °C y deseche la mezcla de sonda. Añadir 200 μL de tampón 0,4x SSC/0,3% Tween-20 a cada pocillo (precalentado a 65 °C) y lavar durante 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el tampón 0,4x SSC/0,3% Tween-20, agregue 200 μL de tampón 2x SSC/0,1% Tween-20 a cada pocillo y lave durante 2 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retirar 2x SSC/tampón Tween-20 al 0,1%, añadir 200 μl de solución de tinción 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/ml) y teñir durante 20 minutos lejos de la luz.</li>
	<li>Deseche la solución de tinte DAPI y lave con 1x PBS durante 2 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Agregue 50 μL de medio de montaje que contenga goma en el portaobjetos y coloque el cubreobjetos de vidrio en el portaobjetos para fijarlo. NOTA: Asegúrese de colocar el cubreobjetos en el portaobjetos con la celda hacia abajo.</li>
	<li>Observar bajo un microscopio de fluorescencia. NOTA: Utilice un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal láser; Este último produce una imagen de mayor sensibilidad y claridad.</li>
</ol>

FISH para la localización de ARN largo no codificante en células de osteosarcoma humano

<ol><li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li>
<li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation%2C+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li>
<li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation%2C+migration%2C+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Research%22%5BJournal%5D)">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li>
<li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li>
<li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a%2FRASSF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li>
<li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K%2FAKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ceRNA+in+cancer%3A+possible+functions+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li>
<li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li>
<li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+%28bDNA%29+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li>
<li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261(2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a%2Fb+and+miR-214+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3(2019).</li>
<li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li>
<li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p%2FULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82(2019).</li>
<li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+Oncology+Research%3A+POR%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li>
<li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853(2018).</li>
<li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+RNA+FISH+%28smFISH%29+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79(2019).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo RNA FISH no solo puede detectar la localización de lncRNAs en las células, sino también detectar la colocalización de otros RNAs, ADN o proteínas en las células, que también se pueden utilizar para detectar la ubicación de lncRNAs en tejidos embebidos en parafina. Sin embargo, el protocolo específico en estos casos es diferente porque los tejidos embebidos en parafina necesitan ser desparafinados21. Este procedimiento experimental se puede aplicar en placas de 48 o 96 pocillos, pero...

Nuestra comprensión del genoma humano se ha ampliado enormemente gracias a los recientes avances en la tecnología del genoma completo. Alrededor del 93% del genoma humano se puede transcribir en ARN, pero solo el 2% de los ARN se pueden traducir en proteínas; el 98% restante de los ARN que no tienen función de traducción de proteínas se denominan ARN no codificante (ncRNA)1. Como una clase de ARN no codificantes (ncRNAs), los ncRNAs largos (lncRNAs), que contienen más de 200 nucleótidos2, han atraído cada vez más atención debido a su participación en muchos procesos fisiológicos y patológicos de las células, como la diferenciación, el control del ciclo, la apoptosis, la migración y la invasión 3,4,5. Los LncRNAs desempeñan sus funciones a través de diversos mecanismos, como la regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica nuclear, el control del proceso de empalme del ARNm y la modificación postranscripcional6. Los LncRNAs regulan la aparición, el desarrollo y la metástasis de las neoplasias malignas tanto a nivel transcripcional como postranscripcional. La regulación transcripcional se realiza en el núcleo afectando la transcripción del ARN a través de la unión a las estructuras cromosómicas, mientras que la regulación postranscripcional se realiza en el citoplasma mediante el control de los genes diana a través de un mecanismo endógeno de ARN competitivo (ARNce) 5,7,8. El CeRNA ha revelado un nuevo mecanismo de interacción del ARN, a saber, que los lncRNAs pueden actuar como una esponja para adsorber miRNAs e inhibir la degradación mediada por miRNAsde genes diana relacionados. Por lo tanto, la información sobre la localización subcelular de los lncRNAs, ya sea que un lncRNA específico se encuentre en el citoplasma o en el núcleo, es importante para ayudar a identificar sus funciones biológicas.
En la actualidad, la localización de lncRNA se detecta principalmente mediante dos métodos, uno es mediante el ensayo de aislamiento de la fracción de núcleo/citoplasma y el otro es mediante ARN FISH. En el primero, se extraen los ARN de las fracciones citoplasmática y nuclear respectivamente, y luego se realiza la amplificación por PCR con cebadores específicos de lncRNA para detectar la proporción de lncRNAs en el citoplasma y el núcleo. La ventaja de este método es la eficiencia del tiempo, mientras que la desventaja es que la localización real del lncRNA no se refleja directamente en la proporción relativa de lncRNAs en el citoplasma y el núcleo. RNA FISH puede detectar la localización de lncRNA en las células mediante el diseño de secuencias de cadenas antisentido específicas de lncRNA seguidas de marcaje con colorantes fluorescentes10. Los métodos FISH de ARN se han mejorado con avances en las técnicas de sonda y los métodos de detección, incluidos los conjuntos de sondas de múltiples oligonucleótidosmarcados con fluoróforos 11, las sondas LNA 12 y las sondas de ADN ramificado (ADNb)13. RNA FISH no solo puede detectar la localización de lncRNA, sino también detectar la colocalización de otros ARN, ADN o proteínas mediante el uso de inmunofluorescencia bicolor o multicolor14.
En este trabajo, hemos incluido como ejemplo el protocolo detallado de detección de localización intracelular del gen huésped de ARN nucleolar pequeño 6 (SNHG6) de lncRNA en células de osteosarcoma (143B) mediante ARN FISH. SNHG6 es un lncRNA de 600-730 nucleótidos en su forma madura empalmada e identificado como un nuevo oncogén en diversos cánceres humanos, incluido el cáncer colorrectal, el cáncer gástrico, el carcinoma de células claras de ovario, el osteosarcoma y el carcinoma hepatocelular15,16,17,18. Los estudios han confirmado la participación de SNHG6 en los comportamientos biológicos de las células cancerosas, como la proliferación, la EMT y la autofagia, y han demostrado la localización citoplasmática de SNHG6 donde puede afectar a los genes diana mediante la unión (esponja) de los miRNAs15,16,17. En este documento se presenta este protocolo detallado de detección de la localización intracelular de SNHG6 mediante ARN FISH.

<table><tbody><tr><td>Contador automático de células</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>Recuento de células</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular-12</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>3513,corning Coloque</td><td>los cubreobjetos en la placa</td></tr> <tr><td>&nbsp; Línea celular (143B)</td><td>Banco de células de la Academia China de Ciencias</td><td>CRL-8303</td><td>línea celular de cáncer de osteosarcoma</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga (15 mL, 50 mL)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp; 430790, Corning</td><td>Centrífuga las células</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>abs7026</td><td>Las células se siembran en los cubreobjetos</td></tr><tr><td>Cy3 label-SNHG6 DNA probe</td><td>Shanghai GenePharma Co., Ltd</td><td>A10005</td><td>Detectar SNHG6</td></tr><tr><td>ubicación DMEM media</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>LM-E1141</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Incubadora</td> <td>de baño secoHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.</td><td>DKT200-2&nbsp;</td><td>Incubación a diferentes altas temperaturas</td></tr><tr><td>Etanol 100%&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td><td>10009218</td><td>deshidratación</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Shanghai Biotechnology Co., LTD</td><td>Olympus BX43 equipado con una cámara de Olympus U-TV0.5XC-3 (SN: 5J01719), olympus</td><td>Observación y posicionamiento</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td><td>DHP-9051</td><td>Las muestras se incubaron a 37 &deg;C.</td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>E675004</td><td>Coloque los cubreobjetos en la corredera</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td><td>TS-8S</td><td>Portaobjetos de lavado</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>188105</td><td>Los cubreobjetos se colocan en el portaobjetos</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600198</td><td>Membrana permeable y membrana nuclear</td></tr><tr><td>&nbsp; Tripsina (0.25%)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>25200056, Gibco</td><td>tratamiento con tripsina de células</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A600560</td><td>detergente</td></tr></tbody></table>

hibridación in situ de fluorescencia de arn para la localización de arn no codificante largo en células de osteosarcoma humano

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

Se han estudiado las funciones importantes de los ARN largos no codificantes (ARNnc) en el cáncer, como la regulación de la proliferación, la transición epitelio-mesenquimal (EMT), la migración, la infiltración y la autofagia de las células cancerosas. La detección de localización de lncRNAs en las células puede proporcionar información sobre sus funciones. Mediante el diseño de la secuencia de cadena antisentido específica de lncRNA seguida de marcaje con colorantes fluorescentes, se puede aplicar la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para detectar la localización celular de lncRNAs. Junto con el desarrollo de la microscopía, las técnicas de ARN FISH permiten ahora incluso la visualización de los lncRNAs mal expresados. Este método no solo puede detectar la localización de lncRNAs por sí solo, sino también detectar la colocalización de otros RNAs, ADN o proteínas mediante el uso de inmunofluorescencia bicolor o multicolor. Aquí, hemos incluido el procedimiento de operación experimental detallado y las precauciones de ARN FISH mediante el uso del gen huésped de ARN nucleolar pequeño de lncRNA 6 (SNHG6) en células de osteosarcoma humano (143B) como ejemplo, para proporcionar una referencia para los investigadores que desean realizar experimentos de ARN FISH, especialmente lncRNA FISH.

Se muestran imágenes representativas de SNHG6 FISH en células de osteosarcoma humano (Figura 2). El control negativo se trata con la sonda Ctrl negativa; el control positivo se trata con la sonda U6 20. La sonda SNHG6 y la sonda U6 están marcadas con Cy3, que emite fluorescencia roja. El DAPI es un tinte que tiñe el ADN, que emite fluorescencia azul. Este resultado muestra que SNHG6 se localiza principalmente en el citoplasma, y esta información puede proporcionar una...

El presente protocolo describe un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN para localizar los lncRNAs en células de osteosarcoma humano.

Hibridación in situ de fluorescencia de ARN para la localización de ARN no codificante largo en células de osteosarcoma humano

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

El objetivo de nuestra investigación es proporcionar un protocolo detallado de ARN FISH que proporcione una referencia para los científicos que quieran realizar experimentos de ARN FISH. Nuestra investigación ha establecido que el ARN FISH se puede utilizar para localizar lncRNA en células de osteosarcoma humano. Nuestro protocolo proporcionó un procedimiento experimental completo y las precauciones para el ARN FISH utilizando lncRNA-SNHG6 en células de osteosarcoma humano como referencia.

rna-fluorescence-situ-hybridization-for-long-non-coding-rna

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

Este protocolo se utiliza con éxito para detectar cuantitativamente los niveles y los patrones espaciales de la expresión del ARNm de múltiples tipos de tejidos a través de las especies de vertebrados. El método puede detectar transcripciones baja abundancia y permite el tratamiento de cientos de diapositivas simultáneamente. Se presenta el protocolo de uso de perfiles de expresión de la formación del cerebro del embrión aviar como ejemplo.

Radioactivo In situ La hibridación para la detección de diversos patrones de expresión génica en el tejido

Aquí se describe un fluorescente de todo el...

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

situ (ISH) &gt; 'jove_content permite la visualización de ARN en células y tejidos. Aquí mostramos cómo la combinación de RNAscope ISH con inmunohistoquímica o colorantes histológicos se puede utilizar con éxito para detectar ARNm localizados en axones en secciones de cerebros humanos y de ratones.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

Aquí, describimos un análisis en situ el hibridación que permite la detección sensible y específica de secuencias tan cortas como 50 nucleótidos con resolución del solo-nucleótido en el nivel unicelular. El ensayo, que se puede realizar manual o automáticamente, puede habilitar la visualización de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en el contexto del tejido.

Visualización de variantes genéticas, metas cortas y mutaciones puntuales en el contexto morfológico del tejido con un ensayo de ARN In Situ hibridación

Reproducible, contar los números de los mRNAs de los ovocitos, in situ de la fluorescencia de una molécula de RNA hibridación (RNA-pescado) fue optimizado para las células no adherentes. Ovocitos se recolectaron, cruzado por hibridación con las sondas específicas de transcripción y cuantificaron utilizando un software de cuantificación de la imagen.

Uso de la sola molécula fluorescente en Situ del hibridación (SM-pescado) para cuantificar y Localize mRNAs en oocitos murinos

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Este protocolo proporciona un enfoque detallado para evaluar los niveles de modificación de m6Ade ARN específico utilizando MeRIP-qPCR.

Ensayo MeRIP-qPCR para detectar niveles de modificación m6A de ARN específico en células osteosarcoma

Este protocolo experimental proporciona un método estable, rentable y eficiente que combina el knockdown de lncRNA con ensayos formadores de colonias para cuantificar el efecto del lncRNA en la proliferación celular del osteosarcoma.

Ensayo de formación de colonias que detecta la capacidad proliferativa de células de osteosarcoma por knockdown de ARNCn

La presencia de células madre del cáncer (CSC) en sarcomas óseos se ha vinculado recientemente a su patogénesis. En este artículo, presentamos el aislamiento de células madre cancerosas a partir de cultivos celulares primarios obtenidos de biopsias humanas de osteosarcoma convencional (OS) utilizando la capacidad de las células madre cancerosas de crecer bajo condiciones no adherentes.

Establecimiento de Cultivos Celulares del Cáncer Humano de osteosarcoma convencional Tallo

Aprende a localizar ARN no codificante largo en células de osteosarcoma humano mediante hibridación in situ de fluorescencia. Este protocolo detallado utiliza SNHG6 como referencia para investigadores en biología del cáncer.

Hibridación in situ de fluorescencia de ARN para la localización de ARN no codificante largo en células de osteosarcoma humano

Explorar más videos