Name: Eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Aprenda a manipular la expresión génica en el plexo coroideo mediante inyecciones ICV y vectores AAV2/5 en modelos murinos. Este método permite estudiar respuestas inmunes en enfermedades neurológicas como la esclerosis múltiple.

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Agradecemos el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nº 31800903, otorgada a W. Zheng) y del Proyecto de Ciencia y Tecnología de Wenzhou (Nº Y2020426, otorgado a Y. Y. Weng) para este trabajo.

Todos los procedimientos con animales descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas descritas en la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Wenzhou.
1. Animales
<ol><li>Compre ratones machos C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad y con un peso de 20 a 22 g.</li>
	<li>Obtener la línea de ratones transgénicos Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) y ratones machos A2AR flox/flox .</li>
	<li>Asigne aleatoriamente a los ratones a dos grupos y los aloje en jaulas, con un máximo de cinco ratones por jaula, bajo un ciclo estándar de 12 h de luz/12 h de oscuridad durante 1 semana.</li>
	<li>Proporcione a los ratones suficiente comida y agua y manténgalos a una temperatura constante a 25 °C.</li>
</ol>2. Eliminación específica de ChP de A 2ARs con AAV2/5-shRNA
<ol><li>Pesa cada ratón y anota los valores.</li>
	<li>Anestesiar a los ratones por vía intraperitoneal con pentobarbital sódico al 1% a una dosis de 6-8 ml/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital, y colocar el ratón sobre una almohadilla térmica para mantenerlo caliente. NOTA: Es crucial administrar la dosis correcta de pentobarbital sódico de acuerdo con el peso del ratón para garantizar el éxito de la cirugía. La anestesia no debe ser demasiado profunda, ya que puede provocar la mortalidad, pero no debe ser demasiado superficial, ya que el ratón puede despertarse durante el procedimiento, lo que podría afectar la eficacia de la inyección del virus. Verifique la dosis adecuada de anestesia pellizcando los dedos de los pies y asegurándose de que los ratones no respondan.</li>
	<li>Usa una afeitadora de ratón especializada para recortar el vello superior de los ratones anestesiados.</li>
	<li>Aplique ungüento ocular en ambos ojos para evitar que se sequen y fije a los ratones en un aparato estereotáxico para inmovilizar el cerebro. Cubra al animal con una cortina estéril.</li>
	<li>Esterilizar a fondo la piel de la cabeza y el cuello de los ratones con tres rondas de desinfectante yodóforo y alcohol al 75% para reducir la infección postoperatoria. A continuación, aplique lidocaína al 1% por vía tópica en el cuero cabelludo de ratones y haga una pequeña incisión para exponer completamente el cráneo bajo un microscopio. NOTA: Utilice instrumentos estériles durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Prepare dos jeringas de 10 μL: una con AAV2/5-A2AR-shRNA comprado (título: 6,27 × 10 9 vg/μL) y la otra con AAV2/5-Scramble comprado (título: 6,21 × 109 vg/μL). NOTA: Cuando se usa la jeringa, el extremo frontal debe conectarse a un capilar de vidrio, y se puede obtener un rango de 10 μL controlando la longitud del capilar de vidrio.</li>
	<li>Utilice el microscopio para localizar el bregma y la lambda y establezca el punto de coordenadas (AP: -0,58; ML: ±1,10; DL: -2,20) en la jeringa de 10 μL (Figura 1). El punto de coordenadas se basa en el atlas estereotáxico15 del cerebro del ratón.</li>
	<li>Perfora un pequeño agujero en el cráneo en el punto de coordenadas ajustado. NOTA: Bajo el microscopio, la perforación se realiza con un microtaladro estéril contra la superficie del cráneo. Después de la perforación, al extirpar las meninges que cubren el cerebro y exponer el parénquima cerebral subyacente, se previene la lesión de los vasos sanguíneos. Este paso evita que la punta del capilar de vidrio se rompa por las meninges. El diámetro del orificio perforado debe ser suficiente para permitir que la punta de la aguja entre en el tejido cerebral.</li>
	<li>Administrar 2 μL de virus AAV2/5-A2AR-shRNA en el ventrículo cerebral mediante inyección lateral a una velocidad constante de 100 nL/min. Mantenga la aguja en su lugar durante 10 minutos antes de retirarla. Hay que tener en cuenta que el virus se administró con inyección unilateral.</li>
	<li>Selle la piel lesionada con pegamento médico de biofibrina rápidamente para evitar la pérdida de virus, que se puede enjuagar con líquido cefalorraquídeo después de quitar la aguja si el pegamento no se aplica rápidamente. Además, no use bastoncillos de algodón para limpiar el líquido cefalorraquídeo, ya que también puede causar la pérdida del virus.</li>
	<li>Para facilitar la recuperación, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal entre 37,0 ± 0,5 °C, y aplique lidocaína al 1% por vía tópica en el cuero cabelludo del ratón. Dejar que los ratones se recuperen durante 2 semanas antes de inducir el modelo EAE, ya que este período es necesario para la expresión del virus AAV2/5-A 2A R-shRNA y la posterior eliminación de A2AR.</li>
</ol>3. Derribo específico de ChP de A 2AR con un sistema Cre/locus de X-overP1 (Cre/LoxP)
NOTA: Los siguientes procedimientos se pueden lograr utilizando el método descrito anteriormente. Consulte los pasos 2.1-2.11 para conocer los métodos de inyección detallados.
<ol><li>Inyectar 2 μL de CRE-TAT recombinasa en cada ventrículo lateral de un ratón Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato como grupo experimental y 2 μL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) como grupo de control. Utilizando el mismo protocolo anterior (sección 2), inyectar 2 μL de CRE-TAT recombinasa en cada uno de los ventrículos laterales de ratones A2AR flox/flox junto con 2 μL de PBS estéril como grupo de control.</li>
	<li>Preparar secciones de tejido congelado y realizar la tinción nuclear 2 semanas después de la inyección de recombinasa CRE-TAT. Consulte los pasos 4.1-4.3 para obtener más información.</li>
</ol>4. Perfusión transcárdica en ratones
<ol><li>Administrar 60-80 mg/kg de pentobarbital sódico para anestesiar profundamente a los ratones. Confirme el plano de anestesia con un pellizco en el dedo del pie y realice la perfusión transcardíaca con 40 ml de solución estéril de PBS seguida de 20 ml de paraformaldehído (PFA) al 4%. NOTA: El éxito de la perfusión se indica por un color blanco en el hígado, mientras que la presencia de pulmones agrandados o de salida de PBS de la boca durante la perfusión sugiere un fracaso del procedimiento.</li>
	<li>Extrae rápidamente el cerebro del ratón, asegurando una degradación mínima de las proteínas.</li>
	<li>Sumergir el cerebro del ratón en PFA/PBS al 4% durante la noche para la postfijación, seguido de la sustitución con una solución de PB de sacarosa al 30% durante 72 h. NOTA: Es fundamental evitar la deshidratación excesiva del tejido cerebral, por lo que el cerebro no debe dejarse en la solución de sacarosa PB durante demasiado tiempo.</li>
</ol>5. Corte y tinción de tejido congelado
<ol><li>Incruste el cerebro de ratón previamente deshidratado en pegamento de temperatura óptima de corte (OCT), congele el cerebro incrustado y use un micrótomo deslizante para cortar secciones coronales con un grosor de 20 μm.</li>
	<li>Coloque las secciones del cerebro en el portaobjetos de vidrio. Una vez que las secciones del cerebro estén secas, guárdelas en un refrigerador a -20 ° C para experimentos posteriores.</li>
	<li>Coloque cada portaobjetos de vidrio en una caja con marco y sumérjalo en un recipiente lleno de PBS para enjuagar bien el portaobjetos. Enjuague suavemente los portaobjetos cerebrales con la solución de PBS tres veces, durante 10 minutos cada vez. NOTA: Se debe tener precaución para evitar que las secciones del cerebro se caigan del portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Tiñe los portaobjetos cerebrales con una solución de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min.</li>
	<li>Enjuague los portaobjetos cerebrales con una solución de PBS durante 5 minutos.</li>
	<li>Aplique una gota de medio de montaje antidecoloración en las secciones del cerebro.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos en las secciones del cerebro, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y analice las secciones con un microscopio de fluorescencia convencional.</li>
</ol>6. Inducción EAE
NOTA: Realizar la inducción de EAE después de 2 semanas de la inyección de recombinasa de shRNA o CRE-TAT11.
<ol><li>Cree una solución acuosa mezclando 2,5 mg de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG35-55) con 2 ml de PBS. Prepare una solución completa de aceite de adyuvante de Freunds (CFA) mezclando M. tuberculosis (H37Ra) con adyuvante de Freunds incompleto (IFA).</li>
	<li>Mezcle las soluciones acuosa y oleosa en una proporción de 1:1. Use un tubo en T para batir la mezcla a un estado de aceite en agua. NOTA: La tubería en T también se denomina tubería de tres vías. Es un tubo de plástico que puede controlar la dirección de flujo de la solución para mezclar completamente el MOG35-55 y el CFA.</li>
	<li>Utilizar un homogeneizador de alta velocidad para hacer la emulsión de antígeno MOG para el modelo EAE en condiciones de baño de hielo.</li>
	<li>Anestesiar a los ratones por vía intraperitoneal con pentobarbital sódico al 1% a una dosis de 6-8 mL/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital.</li>
	<li>Inyectar por vía subcutánea la emulsión de antígeno MOG en cuatro puntos diferentes (cuello, espalda, caderas izquierda y derecha) a un volumen de 10 ml/kg para un total de cuatro inyecciones cada uno. NOTA: Es importante seleccionar cuidadosamente el lugar de inyección, ya que los diferentes sitios pueden tener efectos variables en la morbilidad y mortalidad de los ratones. Además, las inyecciones repetidas de MOG pueden provocar tolerancia inmunitaria, por lo que el equipo de investigación eligió un solo método de inyección para prevenir este posible problema.</li>
	<li>Inyectar inmediatamente 500 ng/ml de toxina pertussis (TP) por vía intraperitoneal a una dosis de 5 mg/kg después de la inyección de MOG. NOTA: La TP aumenta la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE) y facilita la infiltración de células T en el cerebro.</li>
	<li>Después de 48 h, inyectar intraperitonealmente la solución de TP al mismo volumen.</li>
</ol>7. Puntuación de déficit neurológico
<ol><li>Evaluar y calificar diariamente a los ratones mediante una escala de valoración16 de 0 a 15 para valorar la incidencia y gravedad de la EAE en función de los siguientes déficits neurológicos: Cola: 0 indica que no hay signos, 1 representa una cola medio paralizada y 2 indica una cola completamente paralizada. Extremidades: 0 indica que no hay signos, 1 representa una marcha débil o alterada, 2 indica paresia y 3 representa una extremidad completamente paralizada.</li>
	<li>Asigne a un animal tetrapléjico que tenga parálisis completa una puntuación de 12 y asigne a la mortalidad una puntuación de 15.</li>
</ol>8. Tinción de hematoxilina-eosina (H&E)
<ol><li>Tome el cerebro de ratón deshidratado e insértelo en parafina fundida. Deje que el bloque de parafina se enfríe y solidifique para su uso posterior. NOTA: El bloque de parafina debe estar completamente seco y frío para evitar daños en los tejidos.</li>
	<li>Corta el bloque de parafina cerebral de ratón en portaobjetos de 5 μm de grosor. Coloque la sección de cerebro de ratón de parafina en un portaobjetos de vidrio y séquelo en un horno a 60 °C durante 3 h.</li>
	<li>Sumerja los portaobjetos secuencialmente en la solución de xileno I durante 10 minutos, la solución de xileno II durante 10 minutos, el 100 % de alcohol I durante 3 minutos, el 100 % de alcohol II durante 3 minutos, el 95 % de alcohol durante 3 minutos, el 90 % de alcohol durante 3 minutos, el 80 % de alcohol durante 3 minutos, el 70 % de alcohol durante 3 minutos y el agua destilada durante 1 minuto.</li>
</ol>9. Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR)
<ol><li>Después de perfundir a los ratones con PBS, retire la ChP de los ventrículos y extraiga el ARN con Trizol. Sintetiza el ADNc con el primer kit de síntesis de ADNc de hebras.</li>
	<li>Realice análisis de qPCR utilizando la premezcla Ex Taq SYBR-green y un sistema de PCR en tiempo real. Utilice los siguientes cebadores A2AR: adelante - GCCATCCCATTCGCCATCA; reverso - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

Silenciamiento selectivo de genes en el plexo coroideo

<ol><li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li>
<li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functions+of+the+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).</li>
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</ol>

Los autores afirman que no tienen intereses financieros contrapuestos ni otras revelaciones que declarar.

La investigación presentó dos enfoques distintos para la eliminación dirigida de los genes ChP. El primer enfoque consistió en la inyección ICV de CRE-TAT, que contiene Cre recombinasa, en ratones A2AR flox/flox. El segundo abordaje consistió en la inyección de AAV2/5 portadora de ARNh de A2AR. Mediante la utilización de estas dos estrategias, el trabajo logró la eliminación selectiva de A 2A R dentro de la ChP y pudo demostrar los efectos protectores de la inhibición de la señalización d...

A menudo se pensaba que el plexo coroideo (ChP) ayudaba a mantener la homeostasis funcional del cerebro mediante la secreción de líquido cefalorraquídeo (LCR) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)1,2. El aumento de la investigación en las últimas tres décadas ha revelado que la ChP representa una vía distinta para la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC).
Las uniones estrechas (TJs) de la ChP, compuestas por un epitelio ChP monocapa, mantienen la homeostasis inmunológica impidiendo que las macromoléculas y las células inmunitarias entren en el cerebro3. Sin embargo, bajo ciertas condiciones patológicas, el tejido ChP detecta y responde a patrones moleculares asociados al peligro (DAMPs) en el LCR y la sangre, lo que conduce a una infiltración inmune anormal y a una disfunción cerebral 4,5. A pesar de su papel crítico, el pequeño tamaño de la ChP y su ubicación única en el cerebro dificultan el estudio de su función sin afectar a otras regiones cerebrales. Por lo tanto, la manipulación de la expresión génica específicamente en la ChP es un enfoque ideal para comprender su función.
Inicialmente, las líneas transgénicas de enzimas de recombinación de ciclación (Cre), que expresan Cre bajo el control de promotores específicos de genes expresados en la ChP, se utilizaron comúnmente para eliminar genes diana mediante la cría con genes candidatos floxados 6,7,8. Por ejemplo, el factor de transcripción Forkhead box J1 (FoxJ1) se expresa exclusivamente en el epitelio ChP del cerebro prenatal del ratón7. Por lo tanto, la línea FoxJ1-Cre se utilizó a menudo para eliminar genes localizados en la ChP 6,9. Sin embargo, el éxito de esta estrategia depende en gran medida de la especificidad del promotor. Poco a poco se descubrió que el patrón de expresión de FoxJ1 no era lo suficientemente distintivo, ya que FoxJ1 también estaba presente en células epiteliales ciliadas en otras partes del cerebro y del sistema periférico7. Para superar esta limitación, se realizó una inyección intracerebroventricular (ICV) de Cre recombinasa para administrar recombinasa en los ventrículos de las líneas transgénicas floxadas. Esta estrategia mostró una alta especificidad, como lo demuestra la presencia de fluorescencia de tdTomato únicamente en el tejido ChP10,11. Sin embargo, este método todavía está limitado por la disponibilidad de líneas de ratones transgénicos floxed. Para abordar este problema, los investigadores han empleado la inyección de virus adenoasociados (AAV) en ICV para lograr la eliminación específica de ChP o la sobreexpresión de genes diana12,13. Una evaluación exhaustiva de diferentes serotipos de AAV para la infección por ChP reveló que AAV2/5 y AAV2/8 exhiben una fuerte capacidad de infección en la ChP, mientras que no infectan otras regiones cerebrales. Sin embargo, se encontró que AAV2/8 infectaba el epéndimo que rodea a los ventrículos, mientras que el grupo AAV2/5 no mostró infección14. Este método tiene la ventaja de superar las limitaciones de la adquisición de animales transgénicos floxados.
Este artículo describe un protocolo paso a paso para la eliminación de genes en la ChP utilizando dos métodos: ICV de AAV2/5 portador de shRNA del receptor de adenosina A 2A (A 2A R) y proteína recombinasa Cre que consiste en la recombinasa de secuencia TAT (CRE-TAT) para lograr la eliminación específica de ChP de A2A R. Los hallazgos del estudio sugieren que la reducción de A2AR en la ChP puede aliviar la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Este protocolo detallado proporciona una guía útil para los estudios de la función de ChP y la eliminación específica de genes en ChP.

<table><tbody><tr><td>A2ARflox/flox ratones</td><td>Laboratorio Estatal Clave de Oftalmología, Optometría y Ciencias Visuales, Universidad</td><td></td><td></td>Médica de Wenzhou</tr><tr><td>AAV2/5-A2AR-ShRNA</td><td>virus Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD</td><td>pt-4828</td><td></td></tr><tr><td>medio de montaje antidecoloración</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>capilar de vidrio de borosilicato</td><td>Beijing Meiyaxian Technology Co., Ltd</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>aparato estereotáxico cerebral</td><td>RWD, Shenzhen</td><td>69100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 ratones</td><td>Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRE-TAT recombinasa</td><td>Millipore</td><td>SCR508</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Absin</td><td>B25A031</td><td></td></tr><tr><td>máquina cortadora de congelados</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>H37Ra</td><td>Becton Dickinson y compañía</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>jeringa Hamilton</td><td>Hamilton, American</td><td>P/N:&nbsp; 86259</td><td></td></tr><tr><td>Coadyuvante de Freunds incompleto</td><td>Sigma</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal láser</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td></td></tr><tr><td>MOG35-55</td><td>Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD</td><td>4010006243</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento OCT</td><td>Epredia</td><td>6502p</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído</td><td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>pentobarbital sódico</td><td>Boyun Biotech PC13003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pistola de pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>N45014F</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript Kit de síntesis de ADNc de 1ª hebra</td><td>Takara</td><td>&nbsp; 6110A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdRatones de tomate</td><td>Laboratorio Jackson sacarosa</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792-0500</td><td></td></tr><tr><td>homogeneizador de súper alta velocidad</td><td>IKA</td><td>3737025</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>solución</td> <td>de xilenoCompañía de reactivos químicos de Chengdu Kelong</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

El plexo coroideo (ChP) sirve como una puerta de entrada crítica para la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC) tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Investigaciones recientes han demostrado que la regulación de la actividad de la CHP puede ofrecer protección contra los trastornos del SNC. Sin embargo, estudiar la función biológica de la ChP sin afectar a otras regiones cerebrales es un reto debido a su delicada estructura. Este estudio presenta un método novedoso para la eliminación de genes en el tejido ChP utilizando virus adenoasociados (AAV) o proteína recombinasa de la enzima de recombinación de ciclación (Cre) que consiste en la secuencia TAT (CRE-TAT). Los resultados demuestran que después de inyectar AAV o CRE-TAT en el ventrículo lateral, la fluorescencia se concentró exclusivamente en la ChP. Utilizando este enfoque, el estudio eliminó con éxito el receptor de adenosina A 2A (A2A R) en la ChP utilizando sistemas de ARN de interferencia (ARNi) o Cre/locus de X-overP1 (Cre/LoxP), y demostró que esta eliminación podría aliviar la patología de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Esta técnica puede tener implicaciones importantes para futuras investigaciones sobre el papel de la ChP en los trastornos del SNC.

Eliminación de A2AR específica de ChP mediante inyección ICV de AAV2/5-shRNA o CRE-TAT El papel de A2AR en la ChP como un potente regulador de la información neuronal en la patogénesis de EAE sigue sin estar claro. La reducción de la expresión de A2AR específica de ChP podría arrojar luz sobre los efectos reguladores de A2AR sobre el sistema inmune central en EAE y otras inflamaciones del sistema nervioso. En este estudio se utilizó la inyección de CRE-TAT p...

Aquí, describimos un método para alterar selectivamente las expresiones génicas en el plexo coroideo mientras se evita cualquier impacto en otras áreas del cerebro.

Eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

El objetivo de esta investigación es investigar las técnicas de manipulación de la expresión génica en el plexo coroideo. Nuestro estudio ha introducido los dos métodos que permiten la técnica exclusivamente en el plexo coroideo sin ningún impacto perceptible en otras regiones. Nuestros hallazgos pueden mejorar potencialmente futuros estudios sobre la función del plexo coroideo en neurociencia.Nuestra investigación ha revisado que la inhibición de la infiltración de células T a través del plexo coroideo a través del bloqueo selectivo de adenosina a un receptor es suficiente para proteger a los ratones de la patología EAE. Este hallazgo apoya la idea de que la detección de la actividad de la puerta de entrada en el plexo coroideo podría presentar una nueva estrategia prometedora para el tratamiento de la esclerosis múltiple. Este estudio presenta dos métodos alternativos para la manipulación de la expresión génica en el plexo coroideo.Inyección ICV de Cre recombinasa en esos ratones transgénicos o inyección ICV de AAV2/5, o SHI dirigida en los ratones WT. Estos métodos superan los problemas con la promoción de la especificidad y la cría transgénica de ratones.

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Un método para derribar condicionalmente la expresión de una proteína de destino en la retina del pez cebra adulto se describe, lo que implica la inyección intravítrea morfolinos antisentido y electroporating ellos en la retina. La proteína resultante es derribado por varios días, lo que permite realizar pruebas de función de la proteína en la regeneración o la retina intacta.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

En este video, demostramos un método para realizar la transducción de vectores lentivirales de shRNA para obtener líneas celulares knockdown estables en células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas (iHSPCs).

Knockdown de genes mediados por ARN de horquilla corta en iHSPCs in vitro: un sistema de expresión de shRNA basado en lentivirus que se entrega en iHSPCs para la eliminación de la expresión de genes específicos

Se demuestra una técnica mínimamente invasiva conocida como electroporación neonatal zona subventricular. La técnica consiste en la inyección de ADN de plásmido en los ventrículos laterales de cachorros neonatales y la aplicación de corriente eléctrica para suministrar y manipular genéticamente las células madre...

La electroporación neonatal zona subventricular

En este artículo se demuestra un método para la manipulación de la expresión génica en las células ventriculares del telencéfalo adultos de pez cebra utilizando oligonucleótidos antisentido morpholino. Se presenta este método como un protocolo eficiente y rápida que puede ser utilizado para los estudios funcionales en el cerebro de los vertebrados adultos.

Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

Líneas celulares Reporter ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés por parte de las poblaciones heterogéneas. Sin embargo, gen de la orientación mediante recombinación homóloga convencional en células madre de embriones humanos es extremadamente ineficiente. Aquí se describe la orientación del SNC locus cerebro medio específico Pitx3 factor de transcripción con EGFP usando nucleasa dedo de zinc mejorado recombinación homóloga.

Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

Heterotopia nodular periventricular (PNH) es la forma más común de malformación del desarrollo cortical (MCD) en la edad adulta, pero su base genética sigue siendo desconocido en los casos más esporádicos. Recientemente hemos desarrollado una estrategia para identificar genes candidatos novela de MCDs y confirmar directamente su papel causativo en vivo.

Una nueva estrategia Array-CGH, secuenciación del exoma todo y electroporación en el útero en roedores para identificar los Genes causales de las malformaciones del cerebro

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo sobre cómo combinar artificial microRNA mediada por ARN de interferencia con optogenetics estimular específicamente botones presinápticos con menor expresión de genes selectivos dentro de circuitos neuronales intactos.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

En el presente estudio, se derriba la expresión de dos componentes de señalización aguas abajo de la vía PERK, la calcineurina citoprotectora y el CHOP proapoptótico, mediante el uso de shRNAs específicos. De manera opuesta, estos modulan la susceptibilidad de las neuronas corticales primarias a la atrofia de neuritas después de la inducción del estrés del retículo endoplásmico.

Modulación molecular por shRNAs específicos entregados por lentivirus en neuronas estresadas por retículo endoplásmico

Hemos desarrollado un nuevo enfoque de pérdida de función que implica la introducción e integración genómica de secuencias artificiales de micro-ARN en embriones de pollo mediante el uso de electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2. Esta técnica proporciona una metodología de eliminación de genes robusta y estable para estudios de la función de los genes durante el desarrollo.

Enfoque de pérdida de función en la retina embrionaria de pollo mediante el uso de la expresión transgénica mediada por transposones Tol2 de microARN artificiales

La electroporación de organoides cerebrales de primates proporciona un enfoque preciso y eficiente para introducir modificaciones genéticas transitorias en diferentes tipos de progenitores y neuronas en un sistema modelo cercano al desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex de primates. Esto permite el estudio de los procesos evolutivos y del desarrollo neurológico y también se puede aplicar para el modelado de enfermedades.

Microinyección dirigida y electroporación de organoides cerebrales de primates para la modificación genética

Aquí, presentamos la manipulación genética aguda de organoides corticales humanos cortados en rodajas por electroporación. Estos modelos de organoides corticales son particularmente susceptibles a la inyección, ya que las estructuras similares a los ventrículos se pueden identificar fácilmente después del corte, lo que permite la investigación funcional del desarrollo cortical humano, los trastornos del neurodesarrollo y la evolución cortical.

Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas para estudios de la función génica

Aprenda a manipular la expresión génica en el plexo coroideo mediante inyecciones ICV y vectores AAV2/5 en modelos murinos. Este método permite estudiar respuestas inmunes en enfermedades neurológicas como la esclerosis múltiple.

Eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo

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