Evaluación rápida de la citotoxicidad in vitro del receptor de antígeno quimérico que expresa jurkat mediante imágenes fluorescentes
27 de octubre de 2023
Un protocolo para evaluar la destrucción cuantitativa de células tumorales por células Jurkat que expresan el receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a un solo antígeno tumoral. Este protocolo se puede utilizar como plataforma de cribado para la optimización rápida de las construcciones de bisagras de CAR antes de la confirmación en células T derivadas de sangre periférica.
Las células T con CAR se mejoran constantemente para lograr mejores respuestas en ensayos clínicos en humanos. Estamos identificando formas de evaluar esto en nuestro laboratorio utilizando un método imparcial de alto rendimiento, como el uso de imágenes fluorescentes para detectar las combinaciones que funcionan mejor. Hay varias combinaciones de construcciones que se pueden diseñar para cualquier fragmento de variable de cadena única modificando la geometría de los dominios extracelular y bisagra.
Hemos diseñado este protocolo para identificar las combinaciones con mejor eficacia en la eliminación de células diana utilizando células Jurkat. Se trata de un protocolo rápido y de alto rendimiento para cribar construcciones de CAR en función de su citotoxicidad en las células diana utilizando células Jurkat, que luego se validan con células T convencionales. Se pueden probar una docena de construcciones diferentes de CAR en una placa de 96 pocillos simultáneamente utilizando esta técnica.
Aquí, en Akhavan Lab, cuantificamos en números absolutos la ciclosis directa de las células diana por las células Jurkat que expresan CAR de una manera de alto rendimiento para detectar múltiples construcciones de CAR. El objetivo principal de nuestro laboratorio es mejorar la traslación clínica de la terapia de células T con CAR contra tumores cerebrales de alto grado. Aprovechamos los cribados de fármacos de alto rendimiento como una modalidad para mejorar la citotoxicidad de las células T con CAR, así como para dirigirnos al microambiente tumoral.
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Visión general
Este protocolo describe un método de alto rendimiento para evaluar la citotoxicidad de las células Jurkat que expresan CAR contra células tumorales. Permite una rápida selección de varias construcciones de CAR para identificar las combinaciones más efectivas para dirigirse a antígenos tumorales específicos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología del cáncer
- Terapia celular
Antecedentes
- Las células T CAR se están refinando para mejorar los resultados clínicos.
- Los métodos de selección de alto rendimiento son esenciales para optimizar las construcciones de CAR.
- Las células Jurkat sirven como modelo para evaluar la eficacia de CAR.
- Este estudio se centra en la citotoxicidad de las construcciones de CAR contra células diana.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo para seleccionar eficientemente las construcciones de CAR.
- Cuantificar los efectos citotóxicos de las células Jurkat que expresan CAR.
- Identificar configuraciones óptimas de CAR para dirigirse a antígenos tumorales.
Métodos utilizados
- Imágenes fluorescentes para selección de alto rendimiento.
- Evaluación de múltiples construcciones de CAR en formato de placa de 96 pocillos.
- Cuantificación de la muerte de células diana por células Jurkat que expresan CAR.
- Comparación con respuestas de células T convencionales para validación.
Principales resultados
- Identificación de construcciones de CAR efectivas para la muerte de células tumorales.
- Demostración de capacidades de alto rendimiento usando células Jurkat.
- Evaluación cuantitativa de la citotoxicidad en diferentes construcciones.
- Potencial para la rápida optimización de diseños de CAR antes de la aplicación clínica.
Conclusiones
- El protocolo permite una selección eficiente de construcciones de CAR.
- Las células Jurkat proporcionan un modelo confiable para evaluar la eficacia de CAR.
- Este enfoque puede acelerar el desarrollo de terapias con células T CAR.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Rapid, high-throughput cytotoxicity evaluation of CAR constructs in Jurkat cells enables early-stage de-risking and prioritization of CAR designs before resource-intensive primary T cell validation. This platform accelerates the identification of hinge-optimized CARs with superior target cell killing, supporting efficient portfolio triage in oncology cell therapy pipelines. By quantifying cytotoxicity across multiple constructs simultaneously, teams can make data-driven decisions at critical discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of CAR construct permutations for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying direct cytotoxicity in a controlled system.
- Facilitates predictive confidence in construct selection prior to primary T cell engineering.
Screening & Assay Development
- Prepares validated CAR-Jurkat systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes cytotoxicity assays with quantitative fluorescent imaging outputs.
- Enables reproducible, scalable evaluation of multiple CAR constructs in parallel.
- Supports reliable compound or construct evaluation in 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early cytotoxicity data with translational goals by confirming findings in PBMC-derived T cells.
- Provides continuity from discovery-stage construct optimization to preclinical validation steps.
- Reduces risk of late-stage attrition by filtering out suboptimal CAR designs early.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput cytotoxicity platform fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging construct design with preclinical validation. It enables rapid hypothesis testing and construct triage before advancing to resource-intensive primary T cell or in vivo studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of hinge and extracellular domain modifications for CAR efficacy.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible cytotoxicity data for construct comparison and ranking.
- Analytics: Provides absolute cell counts and statistical outputs (e.g., one-way ANOVA) to inform decision-making.
- Translational Research: Confirms construct performance in PBMC-derived T cells, supporting translational continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for ongoing CAR construct optimization campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CAR construct selection.
- Operational Value: Standardizes and scales cytotoxicity evaluation, enabling efficient resource allocation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by filtering constructs early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CAR candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CAR construct design and lentiviral transduction of Jurkat cells.
- Needs access to fluorescent imaging instrumentation and analytical software for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis parameters.
- Adaptation to other cell models or antigens may require protocol optimization.
- Dependent on robust statistical analysis (e.g., ANOVA) for construct comparison.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![Imágenes dinámicas de células T receptoras de antígeno quimérico con [18F]Tomografía por emisión de positrones tetrafluoroborato/Tomografía computarizada](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
