Name: Células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo cocultivadas con glía mixta primaria para reducir la inflamación inducida por priones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprende a utilizar células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo en cocultivo con glía mixta primaria para reducir la inflamación inducida por priones. Este método demuestra el potencial terapéutico de la terapia celular en enfermedades neurodegenerativas.

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Los autores agradecen a Lab Animal Resources por su cría de animales. Nuestras fuentes de financiación para este manuscrito incluyen el Fondo Boettcher, el Fondo Murphy Turner, la Facultad de Medicina Veterinaria de CSU y el Consejo de Investigación de la Facultad de Ciencias Biomédicas. Las figuras 2A, 2C y 3A se crearon con BioRender.com.

Los ratones fueron criados y mantenidos en el Laboratorio de Recursos Animales del Estado de Colorado, acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Lab Animal Care International, de acuerdo con el protocolo # 1138, aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Colorado.
1. Aislar e infectar glía cortical primaria mixta con priones
<ol><li>Para aislar glía mixta primaria que contiene astrocitos y microglía, obtenga crías de ratón C57Bl/6 de cero a dos días de edad. NOTA: Este protocolo es una adaptación de los protocolos anteriores 15,16.</li>
	<li>Eutanasia a los cachorros uno a la vez por decapitación y extraer su cerebro, separando y desechando el cerebelo y el tronco encefálico.<ol><li>Coloque el cerebro en una placa de Petri de 3 cm que contenga MEM/EBSS fría con 2x penicilina/estreptomicina/neomicina (PSN). Bajo un endoscopio de disección, separe los hemisferios cerebrales y extraiga y deseche el mesencéfalo. Retire y deseche el hipocampo y las meninges de la corteza.</li>
		<li>Coloque ambos hemisferios corticales en un tubo cónico de 50 mL que contenga 5 mL de MEM/EBSS + 2x PSN y colóquelo en hielo.</li>
	</ol></li>
	<li>En una campana de cultivo de tejidos, retire el medio del tubo cónico de 50 ml aspirando suavemente con una pipeta, dejando los trozos de tejido cortical en el fondo del tubo. Con una pipeta de vidrio recubierta, agregue 10 mL de medio de disociación precalentado y triture el tejido con la pipeta de vidrio 10-20x.</li>
	<li>Transfiera la suspensión a un vaso de precipitados de 50 ml que contenga una pequeña barra de agitación y colóquela en una placa de agitación en la posición más baja, aproximadamente 30 rpm, durante 10 minutos. Retire el vaso de precipitados de la placa de agitación y colóquelo en un ángulo de 30° durante 3 minutos para permitir que el pañuelo se asiente en el fondo. Retire la suspensión celular (sobrenadante) y transfiérala a un nuevo tubo cónico de 50 mL con hielo.</li>
	<li>Agregue DNasa-I (4,000 U/mL) a 10 mL de medio de disociación y resuspenda el tejido y revuelva durante 10 minutos más. Repita agregando medios de disociación nuevos (sin DNasa-I) de 2 a 4 veces adicionales (una vez por cada dos crías de ratón utilizadas) y transfiriendo la suspensión celular al tubo cónico de 50 ml en hielo, hasta que solo quede tejido fibroso en el fondo del vaso de precipitados.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular en el tubo cónico durante 10 min a 1.000 × g a 4 °C. Aspire el sobrenadante y reemplácelo con medio de crecimiento glial. Cuente las células con un hemocitómetro y coloque las células en placas a una densidad de 106 en placas tratadas con cultivo celular de 10 cm. Colocar en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.</li>
	<li>Después de 24 h, retire el medio y reemplácelo con medio glial nuevo. Deje que las células alcancen el 100% de confluencia en 2 semanas; Luego, divídelos y empláchalos para experimentar.</li>
	<li>Para la infección priónica in vitro , placa la glía a 100.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos y permite alcanzar una confluencia del 80%-100%. Exponga homogeneizados cerebrales, tanto priones como normales, diluidos al 20% en PBS a la luz ultravioleta durante 30 minutos antes de agregarlos al cultivo celular. Aspirar el medio de la glía que se va a infectar y, a cada pocillo, añadir 1,5-2 mL de medio de crecimiento glial que contenga un volumen final de 0,1% de homogeneizado de cerebro normal o priónico.</li>
	<li>Después de 72 h, aspire el medio y lave las células con PBS para eliminar cualquier homogeneizado cerebral residual. Reemplácelo con medios de crecimiento glial frescos (que no contengan homogeneizados cerebrales).</li>
	<li>Para aislar las células AdMSCs, use una pipeta serológica y aspire suavemente el tejido adiposo junto con ~ 1 mL de solución de HBSS / Tripsina. Transfiera a una placa de Petri de 4 cm que contenga 2 mL de medio DMEM/F12 con una mezcla de 200 U/mL de DNasa-I y 400 U/mL de colagenasa/dispasa. Con unas tijeras pequeñas, corte los trozos de tejido adiposo en trozos pequeños (de menos de 5 mm de tamaño) e incube a 37 °C durante 1,5 h.</li>
	<li>Transfiera el contenido de la placa de Petri a un tubo cónico de 50 mL con una pipeta serológica y triture la mezcla ~ 10x con la pipeta. Asegúrate de que el tejido se rompa fácilmente y forme una mezcla relativamente homogénea. Centrifugar la mezcla a 4 °C durante 5 min a 1.000 × g para granular la fracción vascular estromal, que aparecerá de color rojo.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante con cuidado y lavar el pellet con 5 mL de PBS estéril precalentado y centrifugar a 4 °C a 1.000 × g durante 3 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio AdMSC (DMEM de baja glucosa que contiene L-glutamina y suplementado con 15% de suero fetal bovino inactivado por calor (hiFBS), 1% de aminoácidos, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de PSN).</li>
	<li>Coloque un colador de células de 40 μm encima de un tubo cónico estéril de 50 ml y pipetee la suspensión de células a través del filtro para eliminar cualquier tejido no disociado. Añada 9 mL de AdMSC a una placa tratada con cultivo celular de 10 cm y pipetee la suspensión celular colada en la placa. Colocar en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.</li>
	<li>Retire y reemplace con un nuevo medio AdMSC al día siguiente. Espere a que las celdas confluyan en un 80-90% cuando estarán listas para ser pasadas entre 72 h y 96 h.</li>
	<li>Aísle las AdMSC como se ha descrito anteriormente y pasélas dos veces para obtener una población homogénea consistente 14. Lave las células dos veces con PBS estéril y pipetee 2 mL de tripsina precalentada (0,25%) en cada placa. Incubar las células a 37 °C durante 5 min o hasta que se desprendan completamente de la placa. Agregue 8 mL de medio AdMSC precalentado a cada placa, pipetea para mezclar la suspensión celular, transfiera al tubo cónico y centrifugue a 1,000 × g a 4 °C para pellet.</li>
	<li>Vuelva a suspender las AdMSC en 3-10 ml de medio (dependiendo del número de placas utilizadas) y cuente las células con un hemocitómetro. Placa de 100.000 células/pocillo en placas de 6 pocillos que contienen medios AdMSC. Colocar en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, estimula las células con citoquinas u homogeneizado cerebral.<ol><li>En el caso de las células estimuladas por citocinas, elabore medios AdMSC que contengan 10 ng/mL de TNFα o 200 ng/mL de IFNγ. Utilice medios frescos para los pozos de control.</li>
		<li>Para los tratamientos de homogeneizado cerebral infectado por priones, obtenga un 20% de homogeneizado cerebral (en PBS) de ratones priónicos infectados terminalmente (cepas de 22L o RML). Homogeneizar el cerebro normal o infectado por PrMSC con una concentración final del 0,1% para los controles.</li>
		<li>Aspire los medios de los pocillos y pipetee 1,5 ml de medios que contengan citocinas u homogeneizados cerebrales en los pocillos correspondientes. Realizar por triplicado. Regrese las placas a la incubadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Retire el medio, lave las células 2 veces con PBS precalentado, aísle el ARN agregando 350 ml de tampón de lisis que contenga 1% de βME a cada pocillo y use un elevador de células para eliminar los lisados celulares. Realice el aislamiento de ARN siguiendo el protocolo del fabricante del mini kit, incluido un paso de digestión de DNasa. Para RT-qPCR, transcriba 25 ng de ARN por muestra y amplifique el ADNc con SYBR Green y cebadores para cada gen a 10 mM. Analice la expresión de ARNm utilizando el método 2-ΔΔCT y normalice a la expresión del gen de referencia β-actina 17. NOTA: Todas las RT-PCR se realizaron siguiendo las pautas de MIQE.</li>
	<li>Microglía de placa BV2 a 50.000 células por pocillo, o glía mixta primaria a 100.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos. Trate las células BV2 al día siguiente con medios que contengan un 0,1% de homogeneizado cerebral normal o infectado por priones. En el caso de la glía mixta, espere hasta que las células tengan un 80-90% de confluencia para infectar con homogeneizado cerebral.</li>
	<li>Incubar las células en medios que contengan homogeneizado cerebral durante 72 h. Lave las células 2 veces con PBS para eliminar el homogeneizado cerebral restante y agregue medios frescos y devuélvalos a la incubadora.</li>
	<li>Utilice AdMSC en el pasaje 3 para el co-cultivo. Si estimula las AdMSCs, utilice medios que contengan 10 ng/mL de TNFα y trate durante 24 horas antes de co-cultivar con BV2 o glía mixta. Lave las AdMSC estimuladas 3 veces con PBS para eliminar cualquier resto de TNFα.</li>
	<li>Tripsinice las AdMSC como se describe en el paso 1.15 y vuelva a suspender en los medios AdMSC.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión de AdMSC a 1.000 × g a 4 °C durante 5 min. Durante este tiempo, reemplace los medios en las células BV2 o la glía mixta con 2 mL por pocillo de medio AdMSC y coloque insertos para placas de 6 pocillos con un tamaño de poro de 0,4 micrómetros en la mitad de los pocillos. Agregue 2 mL de medio AdMSC a cada inserto y 2 mL adicionales de medio a los pocillos que no reciben insertos.</li>
	<li>Cuando termine de peletizar AdMSC, vuelva a suspender el pellet en el medio AdMSC. Cuente las AdMSC con un hemocitómetro y agregue de 50.000 a 100.000 células a cada inserto.</li>
	<li>En el caso de las células BV2, incubar los cocultivos durante 24 h. En el caso de la glía mixta, incube durante tan solo 24 h y hasta 7 días.</li>
	<li>Después de la incubación con AdMSC durante el tiempo deseado, retire los insertos y deséchelos, o colóquelos en una nueva placa de 6 pocillos, lave los insertos 2 veces con PBS, agregue el tampón proporcionado por el kit de aislamiento de ARN a las células de glía mixta o BV2 y raspe los insertos para analizar el ARN de AdMSC.</li>
	<li>Tratar las AdMSC en el pasaje 2 con medios que contengan 10 ng/mL de TNFα. Al día siguiente, lavar las células con PBS estéril precalentado 3x e incubar en medios AdMSC sin suero durante 4 h.</li>
	<li>Para realizar el ensayo de células migratorias, agregue 25.000 AdMSC por inserto e incube las células durante 24 h a 37 °C. Durante este tiempo, las células migratorias se moverán desde la cámara superior del inserto y se adherirán a la parte inferior del inserto. Aspire cuidadosamente el contenido tanto del pocillo como de los insertos y lave 2 veces con PBS, dejando 1 ml de PBS en cada pocillo para asegurarse de que los insertos permanezcan húmedos en cada lado.</li>
	<li>Una a la vez, con pinzas, retire los insertos y limpie suave pero minuciosamente la cámara superior con un hisopo de algodón para eliminar las células que no hayan migrado. Aspire el PBS restante y pipetee 500 μL de solución de violeta cristalina tanto en el pocillo como en la cámara superior del inserto, asegurándose de que la membrana del inserto esté completamente sumergida.</li>
	<li>Incubar los insertos durante 1 h en una solución de violeta cristalina a temperatura ambiente. Para retener mejor el color, realice los siguientes pasos rápidamente, con solo un inserto a la vez.<ol><li>Aspire la solución de violeta cristalina del pocillo y de la cámara superior del inserto y lávela 3 veces con PBS. Vuelva a limpiar la cámara superior con un bastoncillo de algodón.</li>
		<li>Coloque el inserto en un pocillo en una nueva placa de 24 pocillos que contenga 1 mL de PBS. Coloque la placa sobre un microscopio invertido con una cámara conectada. Con el objetivo 10x, tome imágenes de cuatro áreas aleatorias hacia el centro de la plaquita, enfocándose solo en la parte inferior de la plaquita.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de realizar esto con cada pocillo, cargue las imágenes en el software de procesamiento de imágenes de su elección y ajuste el fondo para mejorar el contraste con las celdas teñidas de púrpura. Cuente las celdas manualmente con un contador de celdas.</li>
</ol>

Cultivo de AdMSCs y glía para reducir la inflamación inducida por priones

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<li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+activities+of+reactive+microglia+and+astrocytes+associated+with+prion+diseases+are+dysregulated+in+opposite+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions.</a> Cells. 10 (7), 1728(2021).</li>
<li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 115(2012).</li>
<li>Shan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effect+of+autologous+compact+bone-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+on+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).</li>
<li>Johnson, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+immune+cells+trafficking+fluorescent+prion+rods+hours+after+intraperitoneal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2349(2010).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSC-secreted+TGF-beta+regulates+lipopolysaccharide-stimulated+macrophage+M2-like+polarization+via+the+Akt%2FFoxO1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10, 345(2019).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Aquí demostramos un protocolo fiable y relativamente barato para evaluar los efectos de las células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AdMSCs) en la disminución de la inflamación inducida por priones en un modelo de células gliales. Las AdMSC se pueden aislar y expandir fácilmente en cultivo para su uso en tan solo 1 semana. Este protocolo produce consistentemente una población heteróloga de células que expresan marcadores consistentes con los de las células estromales mesenquimales por inmunofluoresc...

La inflamación glial desempeña un papel clave en una variedad de enfermedades neurodegenerativas, como el Parkinson, el Alzheimer y la enfermedad priónica. Aunque la agregación anormal de proteínas se atribuye a gran parte de la patogénesis de la enfermedad y la neurodegeneración, las células gliales también desempeñan un papel en la exacerbación de esta 1,2,3. Por lo tanto, dirigirse a la inflamación inducida por la glía es un enfoque terapéutico prometedor. En la enfermedad priónica, la proteína priónica celular (PrPC) se pliega mal a la proteína priónica asociada a la enfermedad (PrPSc), que forma oligómeros y agregados e interrumpe la homeostasis en el cerebro 4,5,6.
Uno de los primeros signos de la enfermedad priónica es una respuesta inflamatoria de los astrocitos y la microglía. Los estudios que suprimen esta respuesta, ya sea por eliminación de la microglía o modificación de los astrocitos, generalmente no han mostrado mejoría o empeoramiento de la patogénesis de la enfermedad en modelos animales 7,8,9. Modular la inflamación glial sin eliminarla es una alternativa intrigante como terapéutica.
Las células estromales mesenquimales (MSC) han tomado la delantera como tratamiento para una variedad de enfermedades inflamatorias, debido a su capacidad para modular la inflamación de manera paracrina 10,11. Han demostrado la capacidad de migrar a los sitios de inflamación y responder a las moléculas de señalización en estos entornos mediante la secreción de moléculas antiinflamatorias, factores de crecimiento, microARN y más 10,12,13. Hemos demostrado previamente que las MSC derivadas del tejido adiposo (denominadas AdMSCs) son capaces de migrar hacia el homogeneizado cerebral infectado por priones y responder a este homogeneizado cerebral mediante la regulación positiva de la expresión génica para citocinas antiinflamatorias y factores de crecimiento.
Además, las AdMSC pueden disminuir la expresión de genes asociados con el factor nuclear-kappa B (NF-κB), la señalización del inflamasoma que contiene el dominio de pirina de la familia de receptores tipo Nod 3 (NLRP3) y la activación glial, tanto en la microglía BV2 como en la glía mixta primaria 14. Aquí, proporcionamos protocolos sobre cómo aislar tanto las AdMSC como la glía mixta primaria de ratones, estimular las AdMSC para que regulen al alza los genes moduladores, evaluar la migración de AdMSC y cocultivar AdMSC con glía infectada con priones. Esperamos que estos procedimientos puedan proporcionar una base para una mayor investigación del papel de las MSC en la regulación de la inflamación inducida por la glía en enfermedades neurodegenerativas y otras enfermedades.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>pipetas serológicas de 5 mL</td><td>Celltreat</td><td>229005B</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo celular de 10 cm</td><td>Peak Serum</td><td>PS-4002</td><td></td></tr><tr><td>pipetas serológicas de 10 ml</td><td>Celltreat</td><td>229210</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de</td> <td>15 mLCelltreat</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubos cónicos</td><td>Celltreat</td><td>667050B</td><td></td></tr><tr><td>BV2 línea celular de microglía</td><td>AcceGen Biotech</td><td>ABC-TC212S</td> Elevador de <td></td></tr><tr><td>células</td><td>Biologix Research Company</td><td>70-2180</td><td></td></tr><tr><td>Violeta cristalino</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>&nbsp; 12785</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Caisson Labs</td><td>DFL14-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos esenciales</td><td>Thermo Scientific</td><td>11130051</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (100%)</td><td>EMD Millipore</td><td>EX0276-1</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (calor inactivado)</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB4</td><td>Se puede comprar como calor inactivado o inactivado en el laboratorio</td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>EMD Millipore</td><td>1.04003.1000</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio 10 mL pipeta serológica</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 7077-10N</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Balances Solución salina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro/Cámara Neubauer</td><td>Daigger</td><td>HU-3100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM de alta glucosa</td><td>Cytiva</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM de baja glucosa que contiene L-glutamina</td><td>Cytiva</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>MEM/EBSS</td><td>Cytiva</td><td>SH30024. FS</td><td></td></tr> aminoácidos <tr><td>no esenciales</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145-100M</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (16%)</td><td>MP Biomedicals</td><td>219998320</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina/neomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4083-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Cytiva</td><td>&nbsp; SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Proteína IFN-gamma recombinante de ratón</td><td>R& D Systems</td><td>485-MI</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Recombinante TNF-alfa (aa 80-235) Proteína, CF</td><td>R& D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td>Recubrir el interior de las pipetas de vidrio aspirando hacia arriba y hacia abajo dos veces en Sigmacote y dejando secar completamente. Envolver en papel de aluminio y pipetas de autoclave 24 h después.</td></tr><tr><td>Stemxyme</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004106</td><td>Mezcla de colagenasa/dispasa</td></tr><tr><td>Hisopo de algodón estéril envuelto individualmente</td><td>Puritan Medical</td><td>&nbsp; 25-8061WC</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de cultivo de tejidos Thincert, 24 pocillos, tamaño de poro = 8 y micro; m</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662638</td><td></td></tr><tr><td>Thincert Insertos de cultivo de tejidos, 6 pocillos, tamaño de poro = 0,4 y micro; m</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657641</td><td></td></tr></tbody></table>

células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo cocultivadas con glía mixta primaria para reducir la inflamación inducida por priones

Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells Co-Cultured with Primary Mixed Glia to Reduce Prion-Induced Inflammation

Las células estromales mesenquimales (MSC) son potentes reguladores de la inflamación a través de la producción de citocinas antiinflamatorias, quimiocinas y factores de crecimiento. Estas células muestran la capacidad de regular la neuroinflamación en el contexto de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad priónica y otros trastornos del plegamiento incorrecto de proteínas. Las enfermedades priónicas pueden ser esporádicas, adquiridas o genéticas; Pueden ser el resultado del mal plegamiento y la agregación de la proteína priónica en el cerebro. Estas enfermedades son invariablemente mortales, sin tratamientos disponibles.
Uno de los primeros signos de la enfermedad es la activación de los astrocitos y la microglía y la inflamación asociada, que se produce antes de la agregación de priones detectable y la pérdida neuronal; por lo tanto, las propiedades antiinflamatorias y reguladoras de las MSC se pueden aprovechar para tratar la astrogliosis en la enfermedad priónica. Recientemente, demostramos que las MSC derivadas del tejido adiposo (AdMSC) cocultivadas con células BV2 o glía mixta primaria reducen la inflamación inducida por priones a través de la señalización paracrina. En este artículo se describe un tratamiento fiable que utiliza AdMSCs estimuladas para disminuir la inflamación inducida por priones.
Una población heterocigota de AdMSCs puede aislarse fácilmente del tejido adiposo murino y expandirse en cultivo. La estimulación de estas células con citoquinas inflamatorias mejora su capacidad para migrar hacia el homogeneizado del cerebro infectado por priones y producir moduladores antiinflamatorios en respuesta. Juntas, estas técnicas se pueden utilizar para investigar el potencial terapéutico de las MSC en la infección por priones y se pueden adaptar para otras enfermedades neuroinflamatorias y de plegamiento incorrecto de proteínas.

La estimulación de AdMSCs con TNFα o interferón-gamma (IFNγ) durante 24 h induce cambios en la expresión de moléculas antiinflamatorias y factores de crecimiento. El tratamiento de las AdMSC con TNFα o interferón-gamma (IFNγ) aumenta el ARNm del gen 6 (TSG-6) estimulado por TNF, mientras que el TNFα, pero no el IFNγ, provoca un aumento del ARNm del factor de crecimiento transformante beta-1 (TGFβ-1). La estimulación con TNFα o IFNγ induce un aumento en el ARNm del factor de crecimiento endotelial vascul...

Las células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AdMSC) tienen potentes propiedades inmunomoduladoras útiles para tratar enfermedades asociadas con la inflamación. Demostramos cómo aislar y cultivar AdMSCs murinas y glía mixta primaria, estimular AdMSCs para que regulen al alza los genes antiinflamatorios y los factores de crecimiento, evaluar la migración de AdMSCs y co-cultivar AdMSCs con glia primaria infectada con priones mixtos.

Células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo cocultivadas con glía mixta primaria para reducir la inflamación inducida por priones

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are potent regulators of inflammation through the production of anti-inflammatory cytokines, chemokines, and growth ...

Nuestro trabajo se centra en las enfermedades priónicas, que son enfermedades neurodegenerativas mortales causadas por el mal plegamiento de la proteína priónica en el cerebro. Pocos estudios se han centrado en el impacto de las células gliales en la muerte neuronal. Queremos entender si detener la inflamación causada por las células gliales puede ser un enfoque terapéutico.Recientemente se ha producido un descubrimiento en el campo de las células estromales mesenquimales, que revela que las propiedades protectoras se derivan de las vesículas extracelulares que liberan. Nuestro objetivo es profundizar en el contenido de estas vesículas y comprender cómo proporcionan protección contra la inflamación glial inducida por priones. Actualmente, en el campo de la neurodegeneración, hay algunas vías que tienen éxito para detener la neuroinflamación.Entre ellas se encuentran las moléculas pequeñas y la modulación genética mediante adenovirus o lentivirus. Sin embargo, ninguno ha sido capaz de reducir completamente la inflamación, específicamente en grandes áreas del cerebro. El hallazgo más significativo que hemos podido establecer es que, a través de la terapia celular, podemos ralentizar la progresión de la enfermedad priónica a través de la inhibición de la inflamación glial.El uso de un modelo combinado con el modelo primario de células gliales de la enfermedad nos permitirá seguir indagando sobre las vías de estrés celular importantes en la neuroprotección, de una manera más eficiente y directa que el uso únicamente de modelos in vivo.

adipose-derived-mesenchymal-stromal-cells-co-cultured-with-primary

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Investigación

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Neurociencia

Aquí les ofrecemos un protocolo para el cultivo de neuronas de rata cortical en presencia de una capa alimentadora glial. Los cultivos de neuronas de establecer la polaridad y la creación de sinapsis, y se puede separar de la glía para su uso en diversas aplicaciones, tales como la electrofisiología, imágenes de calcio, los ensayos de supervivencia de las células, inmunocitoquímica, y ADN / ARN / aislamiento de las proteínas.

Bilaminar Co-cultivo de neuronas de rata primaria cortical y la glía

Aislamiento de la microglía primaria a partir de la heterogeneidad celular del cerebro es esencial para investigar su papel en las dos condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo describe un aislamiento mecánico y técnica mixta de cultivo celular que proporciona un alto rendimiento y alta pureza, viables células primarias microgliales...

El aislamiento de la microglía Primaria cultivos mixtos de células gliales del tejido neonatal cerebro de rata

Las células globoides son una característica patológica definitoria de la enfermedad de Krabbe, una leucodistrofia que actualmente carece de una terapia efectiva a largo plazo. Hemos desarrollado un modelo de cultivo celular para estudiar la biología innata y el potencial patogénico de la microglía activada y su transformación en células globoides.

Un In Vitro Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

Ganglios de la raíz dorsal (DRG) son estructuras que contienen las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. Cuando disociado, pueden ser co-cultivadas con células madre-SC como derivadas de tejido adiposo (ASC), que proporciona un valioso modelo para estudiar la regeneración in vitro en los nervios y la mielinización, imitando el entorno en vivo en el sitio de la lesión.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

En organismos multicelulares, los factores solubles secretados provocan respuestas de diferentes tipos de células como resultado de la señalización paracrina. Los sistemas de cocultivo de insertos ofrecen una forma sencilla de evaluar los cambios mediados por los factores solubles secretados en ausencia de contacto célula-célula.

Desarrollo de un Sistema de inserción Co-cultivo de dos tipos celulares en ausencia de la célula-célula Contacto

El desarrollo del dolor neuropático implica cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal. Se carece de un sistema de cultivo glial fiable derivada de tejido de la médula espinal adulta y diseñado para el estudio de estas células in vitro. Por lo tanto, se muestra aquí cómo establecer cultivos mixtos gliales primarios a partir de tejido de médula espinal de ratón adulto.

Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón

Adjunto, presentamos un protocolo para el cultivo 3D de rata células glia derivado del cerebro, incluyendo astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Demostramos cultivo celular primario, síntesis de hidrogel desarrolla el ácido hialurónico (HAMA), encapsulación HAMAphoto-polimerización y de la célula y muestra de procesamiento para la proyección de imagen microscópica electrónica de barrido y confocal.

Mejora 3D hidrogel culturas de células Glial primarias para In Vitro modelado de neuroinflamación

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

Este protocolo describe un cocultivo microglía-neuronal establecido a partir de células neuronales primarias aisladas de embriones de ratón en los días embrionarios 15-16 y microglía primaria generada a partir de los cerebros de ratones neonatos en los días postnatales 1-2.

Generación y cocultivo de microglía primaria murina y neuronas corticales

Aprende a utilizar células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo en cocultivo con glía mixta primaria para reducir la inflamación inducida por priones. Este método demuestra el potencial terapéutico de la terapia celular en enfermedades neurodegenerativas.

Células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo cocultivadas con glía mixta primaria para reducir la inflamación inducida por priones (Video) | JoVE Journal

Células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo cocultivadas con glía mixta primaria para reducir la inflamación inducida por priones

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