Name: Expresión de transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprende a expresar transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados. Este método simplificado ofrece una alternativa eficiente y económica para la transducción celular en terapia génica.

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Agradecemos a Robert Tjian y Xavier Darzacq por su apoyo y uso de equipos de laboratorio. Agradecemos a Mark Kay por su regalo de los plásmidos KP1 y LK03 rep/cap, y a Luk Vandenberghe por el plásmido rep/cap AAV4. Los fondos fueron proporcionados por el Instituto Médico Howard Hughes (34430, R. T.) y el Programa de Capacitación del Instituto de Medicina Regenerativa de California EDUC4-12790. N.W. agradece la financiación del Centro de Células Madre de Berkeley a través de una beca postdoctoral Siebel y de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a través de una beca Walter Benjamin.

Producción de vectores crudos y entrega eficiente de ADN en cultivos celulares

<ol><li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corrigendum%3A+An+essential+receptor+for+adeno-associated+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection.</a> Nature. 539 (7629), 456(2016).</li>
<li>Nicolson, S. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+utilizes+host+cell+nuclear+import+machinery+to+enter+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus.</a> Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vectors+in+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases%22%5BJournal%5D)">Viral Vectors in Gene Therapy.</a> Diseases. 6 (2), 42(2018).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li>
<li>Ling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Adeno-Associated+Virus+Genome+Packaging+Puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Genetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle.</a> Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175(2015).</li>
<li>Maurer, A. C., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+Genome+Interactions+Important+for+Vector+Production+and+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction.</a> Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+the+adeno-associated+virus+DNA+termini+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro.</a> Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).</li>
<li>Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+and+replication+of+adeno-associated+virus+type+2+as+well+as+vector+DNA+sequences+from+recombinant+plasmids+containing+deletions+in+the+viral+inverted+terminal+repeats%3A+selective+encapsidation+of+viral+genomes+in+progeny+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions.</a> Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+Serotype-Specific+Inverted+Terminal+Repeat+Sequence+Role+in+Vector+Transgene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concatamerization+of+adeno-associated+virus+circular+genomes+occurs+through+intermolecular+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination.</a> Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).</li>
<li>Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Advances%3A+A+Meta-Analysis+of+AAV+Usage+in+Clinical+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings.</a> Frontiers in Medicine. 8, 809118(2021).</li>
<li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+ex+vivo%2Fin+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+%28AAV1-9%29+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Associated+Defective+Virus+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Associated Defective Virus Particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li>
<li>Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interplay+between+Adeno-Associated+Virus+and+its+Helper+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses.</a> Viruses. 12 (6), 662(2020).</li>
<li>Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+nonviral+transfection+and+adeno-associated+viral+transduction+on+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+due+to+electroporation+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell death due to electroporation - A review.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).</li>
<li>McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+and+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).</li>
<li>Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).</li>
<li>Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+assay+and+growth+cycle+studies+of+a+defective+adeno-satellite+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus.</a> Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).</li>
<li>Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+DNA+of+a+defective+human+parvovirus+isolated+from+a+genital+site%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site.</a> Virology. 134 (1), 52-63 (1984).</li>
<li>Gao, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+viruses+from+rhesus+monkeys+as+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clades+of+Adeno-associated+viruses+are+widely+disseminated+in+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).</li>
<li>Lisowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+evaluation+of+clinically+relevant+AAV+variants+in+a+xenograft+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model.</a> Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).</li>
<li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).</li>
<li>Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+AAV+vectors+to+target+persistent+viral+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs.</a> Virology Journal. 18 (1), 85(2021).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+high-resolution+imaging+of+Ku+foci+to+decipher+mechanisms+of+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair.</a> The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).</li>
<li>Bi, X., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+rearrangement+mediated+by+inverted+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA rearrangement mediated by inverted repeats.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).</li>
<li>Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+adeno-associated+virus+into+pBR322%3A+rescue+of+intact+virus+from+the+recombinant+plasmid+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).</li>
<li>Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TLR9-MyD88+pathway+is+critical+for+adaptive+immune+responses+to+adeno-associated+virus+gene+therapy+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).</li>
<li>Wagner, H., Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+is+not+Toll%3A+new+pathways+in+DNA+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">All is not Toll: new pathways in DNA recognition.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).</li>
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<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
<li>Summerford, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-associated+heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+receptor+for+adeno-associated+virus+type+2+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions.</a> Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).</li>
<li>Bell, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV9+receptor+and+its+modification+to+improve+in+vivo+lung+gene+transfer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).</li>
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<li>Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+integrate+at+chromosome+breakage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites.</a> Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).</li>
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</ol>

A.C.M. es consultor de Janssen Pharmaceuticals y forma parte del SAB de NewBiologix. Todos los demás autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Clonación El protocolo de clonación no se limita al plásmido pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 utilizado anteriormente y puede modificarse fácilmente en función de las necesidades experimentales del investigador. Muchos plásmidos que contienen ITR están disponibles en línea para su compra. Por ejemplo, los plásmidos que contienen Cas9 y un sitio de clonación de sgRNA están disponibles, pero requieren pocos pasos adicionales, como el recocido de oligonucleótidos y el tratamiento con PNK30. Además, se pueden encontrar plásmidos que contienen un sitio de clonación múltiple (MCS) con solo ITRs y sin elementos reguladores internos31. Si se van a utilizar plásmidos diferentes, las enzimas de restricción (ER) utilizadas para la digestión suelen ser los únicos elementos que pueden necesitar ser cambiados en este protocolo. Sin embargo, una limitación de rAAV es su limitada capacidad de carga. Debido a las limitaciones físicas de la cápside, el genoma del vector no debe exceder los 4,9 kb, incluidos los RTI.
Al aislar plásmidos de bacterias, es fundamental utilizar un kit midiprep o maxiprep con bajo o libre de endotoxinas para mitigar el daño a las células durante la transfección o transducción de plásmidos triples. El plásmido de los kits de minipreparación a menudo contiene impurezas más altas, concentraciones reducidas y menos ADN superenrollado, todo lo cual puede afectar la producción posterior de rAAV y, por lo tanto, no se recomienda.
Es fundamental comprender la estructura y las propiedades de los RTI durante la clonación. En primer lugar, es extremadamente difícil utilizar la PCR a través del ITR. Deben evitarse los diseños de clonación que requieran amplificación por PCR a través de ITR y, además, limitar el uso de la técnica de clonación de ensamblaje de Gibson. Como tal, la clonación con enzimas de restricción es el método preferido para clonar en plásmidos que contienen ITR. Además, ciertos cebadores para la secuenciación de Sanger pueden no ser compatibles si la región secuenciada contiene el ITR. En su lugar, se recomienda utilizar cebadores que se alejen de los RTI y se introduzcan en el cuerpo del genoma del vector para obtener resultados de secuenciación más precisos. En segundo lugar, los ITR son propensos a deleciones, reordenamientos y mutaciones cuando se transforman en bacterias para la amplificación de plásmidos32,33. Para mitigar estos eventos, se recomienda utilizar cepas bacterianas competentes deficientes en recombinación, como Stbl3, e incubarlas a 30 °C para ralentizar las divisiones celulares. Por último, se ha observado que las colonias más pequeñas pueden corresponder a clones sin reordenamientos o deleciones, ya que las que no tienen RTI pueden conferir una ventaja de crecimiento y ser más grandes. Por lo tanto, se recomienda elegir colonias que sean pequeñas.
Producción de vectores La producción exitosa del vector rAAV puede verse afectada por múltiples elementos. Un factor crítico es la salud de las células HEK293 o 293T utilizadas para la transfección. En general, lo ideal es un número de pasos bajo, ya que las células con muchos pasajes pueden presentar variaciones genotípicas y fenotípicas que pueden reducir los títulos de rAAV. Además, la densidad de las células sembradas debe tener una confluencia del 75% al 90% para una producción efectiva. Las células dispersas generan bajos rendimientos de vectores porque hay menos células disponibles para producir vectores, mientras que las células demasiado crecidas no se transfectarán de manera eficiente.
Las variaciones entre los lotes de reactivos, las existencias de células y la variabilidad general de un laboratorio a otro contribuyen a las diferencias en la eficiencia de la transfección y el título de producción. Un factor optimizable que puede conducir a mejoras en los títulos es la relación plásmido:PEI en las reacciones de transfección. Es fundamental utilizar PEI Max fresco (&lt;1 mes de antigüedad). Se recomienda utilizar una relación plásmido:PEI de 1:1 como punto de partida, y si la transfección o la eficiencia de la transducción parecen deficientes, probar varias proporciones diferentes. La optimización de la titulación es más fácil si se utiliza un transgén con una lectura visual, como el transgén reportero CMV.Luc.IRES.EGFP utilizado en este documento como material de partida para la clonación. Para realizar la optimización, siga el paso 3 del protocolo utilizando una placa de 12 pocillos y reduciendo las masas de plásmidos y los volúmenes de reactivos en dos (la masa final del plásmido es de 2,6 μg). Ajuste el volumen de PEI en consecuencia para que corresponda a proporciones que van de 1:0,75 a 1:3, con incrementos crecientes de 0,25 (Figura 6). Diluir cada reacción con 950 μL de medio SF después de 15 min. Para mayor comodidad, se puede hacer una mezcla maestra que contenga los plásmidos triples y pipetear individualmente en tubos de 1,5 ml antes de agregar PEI. Recolecta el vector, transduce las células de interés y toma una imagen. El pocillo con la mayor eficiencia de transducción (proporción de células GFP+) corresponde al título más alto y a la relación más óptima de PEI:ADN.
<img alt="Diagrama del proceso de transfección de plásmidos: preparar la mezcla maestra, variar las proporciones de PEI, transducir células, cosechar vector." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: Flujo de trabajo de optimización de PEI. Esquema de los pasos necesarios para la optimización del PEI. Se prueban múltiples proporciones de plásmido: PEI para determinar la proporción óptima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Consideraciones sobre la cosecha y el título La técnica de congelación/descongelación utilizada para recolectar el vector rAAV lisa eficazmente las células HEK293 de una manera compatible con el uso directo del lisado clarificado para transducir células cultivadas. Ciertos serotipos de rAAV, como AAV1, AAV8 y AAV9, se liberan de las células durante la producción del vector y pueden cosecharse del medio celular cultivado sin ciclos de congelación/descongelación34. El método descrito aquí suele producir títulos del orden de 1 x 10 10 VG/mL cuando se utilizan cápsidas de AAV2, y 1 x10 11 VG/mL para AAV8. Si bien se pueden lograr títulos más altos mediante detergente u otra lisis química, estos son dañinos para las células en uso posterior y requieren que los rAAV se purifiquen aún más a partir del lisado. Un título más bajo es una compensación que un investigador debe considerar al determinar si las preparaciones crudas son apropiadas para sus necesidades de investigación, sin embargo, los títulos marginalmente más bajos producidos por los métodos descritos aquí pueden transducir muy bien muchos tipos de células (ver resultados representativos). Además de la eficiencia de la transfección y la salud celular, los títulos de vectores varían dependiendo de la cápside utilizada durante la producción de rAAV y del tamaño y secuencia del transgén dentro del VG35.
Al cosechar preparaciones de vectores crudos, el ADN plasmídico que se utilizó durante la transfección de plásmidos triples puede estar presente y, aunque es raro, dar lugar a una transfección posterior durante la transducción. Además, las VG no empaquetadas pueden unirse al exterior de las cápsidas e invocar una respuesta inmune innata al ADN monocatenario desnudo y extraño36,37. Por lo tanto, los tipos celulares sensibles pueden requerir que las preparaciones de vectores se digieran y purifiquen con DNasa para eliminar las VG y el plásmido no empaquetados.
Si se desea calcular el título de una preparación cruda, se puede realizar qPCR para cuantificar el número de VG empaquetadas dentro de partículas resistentes a la DNasa (DRP). Brevemente, una pequeña cantidad de preparación cruda se digiere con DNasa para eliminar el ADN plasmídico, los ácidos nucleicos contaminantes o los VG parcialmente envasados. A continuación, la muestra se somete a qPCR y se cuantifica el VG protegido en el interior de los DRP, lo que da como resultado un título con unidades de genoma del vector por mL de preparación cruda38. No se recomienda realizar la valoración de vectores mediante ensayos basados en ELISA que cuantifiquen los títulos de la cápside. En comparación con el virus AAV de tipo salvaje, el rAAV sufre de una proporción de cápsidas vacías y parcialmente empaquetadas39. ELISA cuantificará todas las cápsidas independientemente de su contenido genómico y sobreestimará las unidades transducibles presentes en una preparación, lo que requiere un VG empaquetado.
Consideraciones sobre la transducción Son muchos los factores que influyen en las transducciones de rAAV y se deben tener en cuenta las consideraciones adecuadas para cualquier nuevo experimento. Dependiendo del promotor que impulsa la expresión transgénica, el inicio de la expresión puede ocurrir tan pronto como 4 h después de la transducción (hpt), y la expresión máxima generalmente se alcanza a los 48 hpt. Es importante tener en cuenta la duración del tiempo desde la siembra inicial de las células hasta el punto final experimental. Esto es para estimar la confluencia inicial de las células y asegurarse de que no crezcan demasiado al final del experimento. Si las células se vuelven demasiado confluentes, el comportamiento celular puede verse alterado debido a una respuesta de estrés y puede confundir los resultados experimentales. Algunos tipos de células, como U2-OS, pueden tolerar bastante bien el crecimiento excesivo o la inhibición del contacto. Además, pueden soportar largos períodos (48 h+) en medio acondicionado sin suero, producto de este protocolo de producción. Sin embargo, los tipos de células sensibles pueden requerir la adición de suero o la dilución de la preparación cruda con un medio de crecimiento especial para mantener la salud durante la transducción. Una eficiencia de transducción ligeramente reducida por el uso de medios que contienen suero es una compensación potencial para la salud celular y debe ser considerada por el investigador.
Normalmente, para células que se dividen rápidamente, una confluencia inicial de alrededor del 50% es óptima para aplicaciones que terminarán a 48 hpt. Sin embargo, la confluencia se puede ajustar en consecuencia en función de las necesidades del experimento. No se recomienda transducir líneas celulares inmortalizadas de tipo monocapa con más del 75% de confluencia debido a la disminución de las eficiencias de transducción. La mayoría de los tipos de células cultivadas se transducen con éxito y se sanan después de la incubación durante la noche con preparaciones crudas de rAAV, seguidas de un cambio a medios frescos que contienen suero por la mañana.
El serotipo de la cápside es un factor importante a tener en cuenta a la hora de producir rAAV para transducir una célula diana, ya que la cápside es el principal determinante del tropismo celular y la posterior expresión del transgén13. AAV2 es un serotipo ampliamente utilizado debido a su capacidad para transducir eficazmente muchos tipos de células cultivadas12. Esta propiedad de AAV2 puede atribuirse a los proteoglicanos de sulfato de heparina (HSPG) que sirven como factor de unión primario para AAV2 y a los altos niveles de HSPG en las células cultivadas de la adaptación al crecimiento en una placa40. Otras cápsides, como AAV9, son menos efectivas en la transducción de tipos celulares amplios y pueden explicarse por sus factores de unión de dependencia que no se expresan en este entorno41. Por lo tanto, recomendamos AAV2 como cápside de primera elección en células cultivadas si una célula diana deseada no ha sido probada previamente con rAAV en la literatura.
Tenga en cuenta que una limitación importante de las preparaciones de vectores crudos es que son inapropiadas para la transducción de modelos animales. Los estudios in vivo requieren que los preparados se purifiquen y se sometan a una evaluación de calidad.
Consideraciones sobre la expresión de transgenes y la posible integración Los rAAV no dan lugar de forma fiable a la expresión permanente del transgén. Con el tiempo, las VG pueden silenciarse y la expresión transgénica puede ser cerrada después de varios pasajes42. Además, la mayoría de las VG siguen siendo episódicas, y las rAAV no contienen las proteínas Rep virales que mediarían la integración frecuente en el genoma del huésped como en una infección lisogénica viral de tipo salvaje o promoverían la replicación de las VG43. Como resultado, los episomas en las células transducidas eventualmente se diluirán entre las células hijas a través de divisiones.
La integración a nivel basal es una posibilidad para todo el material de ADN transgénico suministrado. Sin embargo, los VG que contienen ITR son propensos a la integración con una frecuencia más alta44. Por lo tanto, se puede observar la expresión permanente de un transgén en un pequeño subconjunto de células. Los usuarios deben considerar esta posibilidad, especialmente cuando utilizan rAAV para administrar enzimas que cortan el ADN, como Cas9, ya que las roturas de doble cadena pueden dar lugar a una frecuencia de integración y expresión permanente aún mayor45. Si bien esto hace que rAAV sea un buen candidato para entregar plantillas de reparación dirigidas por homología para el marcaje endógeno o la adición de genes, se debe considerar la posibilidad de inserción de Cas919,46.

La elucidación de las bases moleculares de las funciones celulares a menudo requiere la expresión de ADN transgénico en cultivos celulares. Para expresarse, los transgenes deben penetrar a través de la membrana selectiva de una célula y llegar al núcleo 1,2. Por lo tanto, la capacidad de eludir eficazmente las barreras físicas de la célula y manipular sus procesos centrales es una necesidad para aplicar la transgénesis para descubrir nuevos fenómenos biológicos. Un enfoque aprovecha la capacidad intrínseca de los virus para entregar y expresar ADN extraño 3,4.
El virus adenoasociado (AAV) es uno de los virus de mamíferos más pequeños: su genoma de ADN monocatenario de 4,7 kilobases (kb) contiene dos genes, rep (para replicasa) y cap (para cápside), empaquetados dentro de una cápside icosaédrica de 60 meros que mide 25 nm. Los genes rep/cap tienen múltiples promotores, marcos de lectura y productos de empalme que codifican al menos nueve proteínas únicas necesarias para la replicación, producción y empaquetamiento viral 5,6. Además, ambos extremos del genoma contienen estructuras secundarias llamadas repeticiones terminales invertidas (ITR) que son necesarias para la replicación del ADN, el empaquetamiento del genoma y el procesamiento posterior durante la transducción 7,8,9,10. Los RTI son los únicos elementos de ADN que se requieren para el empaquetamiento del genoma en la cápside y, por lo tanto, el AAV se puede clonar con fines de administración de transgenes reemplazando los genes rep/cap virales con la elección de un investigador de elementos reguladores y/o genes de interés6. El AAV recombinante (rAAV) resultante, con un genoma vectorial (VG) modificado, se utiliza ampliamente en la clínica para la terapia génica humana y ha acumulado éxitos11. Un uso subestimado del vector es en el laboratorio; Los rAAV pueden lograr de manera eficiente la expresión de transgenes en células cultivadas para satisfacer las necesidades experimentales de un investigador12.
El método más común para producir rAAV es mediante transfección de plásmidos triples en células HEK293 o 293T (Figura 1). El primer plásmido, comúnmente llamado plásmido cis, contiene el transgén deseado flanqueado por ITR (pAAV). Dependiendo de la aplicación, los plásmidos cis con elementos comunes, como promotores fuertes o herramientas basadas en CRISPR, están disponibles para su compra. El segundo es el plásmido pRep/Cap que contiene los genes rep y cap AAV de tipo salvaje proporcionados en trans, es decir, en un plásmido separado, que no contiene ITR que expresa elementos reguladores y estructurales que luego interactúan con el plásmido cis, y por lo tanto se denomina plásmido trans. Además de encerrar físicamente la VG, la cápside influye en el tropismo celular12,13. Al proporcionar el gen de la cápsula específico del serotipo en trans, los investigadores pueden maximizar fácilmente la eficiencia de la transducción eligiendo un serotipo de cápside optimizado para su célula diana dada. Por último, como Dependoparvovirus, el AAV requiere de un virus auxiliar para activar la expresión rep/cap de sus promotores virales, lograda por genes auxiliares adenovirales, proporcionados en un tercer plásmido como pAdΔF614,15. Después de 72 h de transfección de plásmido triple, el vector puede liberarse de las células productoras en el medio de cultivo mediante ciclos repetidos de congelación/descongelación. A continuación, se recoge todo el contenido de la placa y se eliminan los residuos celulares grandes mediante centrifugación; el sobrenadante de medios resultante es una preparación cruda de rAAV lista para transducciones posteriores.
<img alt="Transfección de células HEK 293 (T), recolección de vectores, diagrama de proceso de transducción, análisis de expresión génica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Visión general de la producción cruda de vectores rAAV. La producción y transducción de crudo rAAV se puede lograr en 5 días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El rAAV puede ser más favorable para la administración de transgenes en comparación con otros métodos de transfección, que comúnmente se asocian con toxicidad celular, baja eficiencia y reactivos y equipos costosos, como la electroporación o la transfección a base de químicos/lípidos16,17. El rAAV evita estos obstáculos y, a menudo, proporciona una potente expresión de transgenes con una toxicidad mínima y un tiempo de manipulación mínimo. Es importante destacar que la producción de rAAV y su aplicación en cultivos celulares es sencilla y rara vez requiere la purificación del vector a partir de los medios de cultivo (Figura 1). Además, rAAV no integra su VG en el genoma del huésped, a diferencia de la administración de transgenes lentivirales, y por lo tanto reduce el riesgo de mutagénesis insercional18. A pesar de los beneficios potenciales del uso de rAAV para la administración de transgenes, se deben considerar las limitaciones. Es importante destacar que el tamaño del transgén, incluidos los RTI, no debe exceder los 4,9 kb debido a las limitaciones físicas de la cápside, lo que limita la capacidad de un investigador para administrar eficazmente grandes elementos reguladores y transgenes. Además, dado que el rAAV es un virus no integrador, la transducción da lugar a una expresión transitoria del transgén en las células en división y puede no ser práctica para una expresión estable. Sin embargo, los métodos que utilizan plantillas duales de Cas9 administradas por rAAV y de reparación dirigida por homología (HDR) pueden utilizarse para insertar secuencias de forma estable en loci genómicos específicos si un investigador lo desea19.

<table><tbody><tr><td>Snapgene DNA viewing sofrware</td><td>Snapgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40</td><td>AddGene</td><td>105533</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/2 (Rep/Cap)</td><td>AddGene</td><td>104963</td><td></td></tr><tr><td>pAd&Delta; F6</td><td>AddGene</td><td>112867</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0418</td><td></td></tr><tr><td>Boekel Scientific Economy Incubadora digital</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000</td><td></td></tr><tr><td>LB medio, polvo</td><td>MP Biomedicals</td><td>113002042</td><td></td></tr><tr><td>Carbencilina (disódica)</td><td>GoldBio</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick I26 Shaker</td><td>Eppendorf</td><td>M1324-0000</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50</td><td>mL Centrífuga</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Corning 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22627040</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>PCR TIRAS DE 8 TUBOS EXTRAÍBLES</td><td>USA Scientific</td><td>1402-3900</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf</td><td>6333000022</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific 18427013</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Buffer</td><td>NEB</td><td>B0518S</td><td>Provisto con la compra de Phusion Polymerase</td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; Colorante de</td> carga de gel <td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td>ADN polimerasa de alta fidelidad</tr><tr><td>, naranja (6X)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean & Concentrador-100</td><td>Zymo</td><td>D4029</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel Kit de Recuperación de ADN</td><td>Zymo</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer (10x)</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Provisto con la compra de la enzima de restricción</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 T4 Tampón de reacción de ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>Provisto con la compra de T4 Ligasa</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos Safe-Lock (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Precision Microprocessor Water Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221046</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de plástico estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>149566B</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Tubo de microcentrífuga</td><td>Thomas Scientific</td><td>1149Y01</td><td></td></tr><tr><td>ZR Miniprep de plásmido - Classic</td><td>Zymo</td><td>D4015</td><td></td></tr><tr><td>Xma1</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>Sma1</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Celdas HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr>Falcon <td>Corning</td> <td>de 6 pozos</td><td></td> 353046 <td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Sanyo MCO-18AIC(UV) Incubadora de CO2</td><td>Marshall Scientific</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX (Clorhidrato de polietilenimina)</td><td>Polysciences</td><td>24765-100</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador Vortex Genie 2</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>102091-234</td><td></td></tr><tr><td>Sanyo Congelador Ultrabajo Sanyo</td><td></td><td>14656-15267-16219</td><td></td></tr><tr><td>INCU-Line IL 10 con ventana transparente</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífugas Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96-well</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>ratones C57BL/6J</td><td>Cepa JAX</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>medio de crecimiento de organoides</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>6005</td><td></td></tr><tr><td>L Células Wnt-3A</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647 nicotinamida</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ROCK</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td></td></tr><tr><td>Membrana basal Corning Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR)</td><td>Fisher</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 pocillos</td><td>Fisher</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 con 15 mM HEPES</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>polibreno</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 48 pocillos</td><td>Fisher</td><td>08-772-3D</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara</td><td>Fisher</td><td>12-565-470</td><td></td></tr><tr><td>Células BeWo</td><td>ATCC</td><td>CCL-98</td><td></td></tr><tr><td>F-12K Medio</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Hepa1-6</td><td>ATCC</td><td>CRL-1830</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>UC Berkeley BSD Instalación de cultivo celular</td><td>HUH-7</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>HSkMC</td><td>ATCC</td><td>PCS-950-010</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células musculares esqueléticas</td><td>Sigma</td><td>C-23060</td><td></td></tr><tr><td>Medio de diferenciación de músculo esquelético</td><td>Sigma</td><td>C-23061</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Microscopio digital de fluorescencia en color EVOS</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-340</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Opera Phenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14001000</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate de 96 pocillos</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, sin glutamina, sin rojo de fenol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo-Fisher 35050079</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/5 (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/8 (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>130878</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/9n (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td></td></tr><tr><td>pAnc80L65AAP</td><td>Addgene</td><td>92307</td><td></td></tr><tr><td>KP1 (rep/cap)</td><td></td><td></td><td>regalado por el profesor Mark Kay (Universidad de Stanford)</td></tr><tr><td>LK03 (rep/cap)</td><td></td><td></td><td>regalado por el profesor Mark Kay (Universidad de Stanford)</td></tr><tr><td>pAAV4 (rep/cap)</td><td></td><td></td><td>regalado por el profesor Luk Vandenberghe (Facultad de Medicina de Harvard)</td></tr><tr><td>pAAV.Cas9.sgRNA</td><td>Addgene</td><td>61591</td><td></td></tr><tr><td>pAAV.MCS</td><td>Addgene</td><td>46954</td><td></td></tr><tr><td>gBlock (fragmentación de ADN sintético)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expresión de transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados

Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors

Los vectores virales adenoasociados recombinantes (rAAV) pueden lograr una expresión transgénica potente y duradera sin integrarse en una amplia gama de tipos de tejidos, lo que los convierte en una opción popular para la administración de genes en modelos animales y en entornos clínicos. Además de las aplicaciones terapéuticas, los rAAV son una herramienta de laboratorio útil para administrar transgenes adaptados a las necesidades experimentales y los objetivos científicos del investigador en células cultivadas. Algunos ejemplos son los genes reporteros exógenos, los casetes de sobreexpresión, la interferencia de ARN y las herramientas basadas en CRISPR, incluidas las de las pantallas de todo el genoma. Las transducciones rAAV son menos dañinas para las células que la electroporación o la transfección química y no requieren ningún equipo especial ni reactivos costosos para producirse. Los lisados crudos o los medios acondicionados que contienen rAAV se pueden agregar directamente a las células cultivadas sin purificación adicional para transducir muchos tipos de células, una característica subestimada de los rAAV. Aquí, proporcionamos protocolos para la clonación básica de casetes de transgenes y demostramos cómo producir y aplicar preparaciones crudas de rAAV a células cultivadas. Como prueba de principio, demostramos la transducción de tres tipos de células que aún no se han reportado en aplicaciones de rAAV: células placentarias, mioblastos y organoides del intestino delgado. Discutimos los usos apropiados de las preparaciones crudas de rAAV, las limitaciones de los rAAV para la administración de genes y las consideraciones para la elección de la cápside. Este protocolo describe un método simple, de bajo costo y efectivo para que los investigadores logren una entrega productiva de ADN en cultivos celulares utilizando rAAV sin la necesidad de laboriosos pasos de titulación y purificación.

Encontrar la cápside óptima para la transducción de células cultivadas de interés Se transducieron una variedad de tipos celulares para determinar el tropismo de varios serotipos de cápside (Figura 5). Los serotipos naturales AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 y las variantes de cápside modificadas Anc80 25, DJ 26, LK0327 yKP1 28 se empaquetaron con un genoma vectorial que expresaba mScarlet bajo un promotor de CMV, clonado utilizando los métodos proporcionados en este protocolo. Las preparaciones de vectores crudos sin ititrar se diluyeron en los medios de cultivo apropiados y las células se transducieron durante 24+ h y se obtuvieron imágenes (Figura 5B). La eficiencia de la transducción se calculó por la proporción de células totales que eran mScarlet+, o la proporción de células en un solo plano z que eran mScarlet+ (para organoides del intestino delgado de ratón; Figura 5C). No se proporcionan eficiencias de transducción (células mScarlet+) para los miotubos C2C12 y HSkMC diferenciados, sino más bien para los mioblastos C2C12 y HSkMC indiferenciados (Figura 5A).
AAV2 y KP1 fueron los serotipos más potentes en todas las líneas celulares probadas (Figura 5A). También se observó que tipos de células similares procedentes de diferentes especies se transducen con diferentes eficiencias. Por ejemplo, Hepa1-6 (una línea celular hepática derivada de murina) exhibe una marcada disminución en la transducción en comparación con Huh7 (una línea celular hepática derivada de humanos) cuando se usa AAV2 (Figura 5B). Además, las diferentes condiciones de los medios juegan un papel importante durante la transducción. Los organoides del intestino delgado de ratón (mSIO) cultivados en medios de pretransducción se transducen con menos eficacia en comparación con los cultivados en medios de crecimiento de organoides (Figura 5C). Además, AAV2 transduce eficientemente mioblastos HSkMC indiferenciados y miotubos HSkMC diferenciados (Figura 5B), aunque el análisis cuantitativo de los miotubos es difícil y, por lo tanto, no se proporciona.
Las altas eficiencias de transducción observadas para varios tipos de células en la Figura 5 muestran que las preparaciones de vectores crudos se pueden usar de manera efectiva para transducir una variedad de tipos de células sin pasos adicionales como la purificación y la valoración. Sin embargo, se debe prestar especial atención a la hora de elegir una cápside para maximizar la administración de transgenes. Muchas otras líneas celulares y cápsidas han sido probadas previamente y se han publicado, aunque con preparaciones de vectores purificados12.
Un efecto independiente de las partículas vectoriales de las condiciones del medio puede afectar la eficiencia de la transducción. Sin embargo, generalmente se acepta que el tropismo (es decir, la absorción específica del tipo de célula y la expresión del vector) es una propiedad específica de la cápside29. Todavía no se ha observado que una comparación entre las preparaciones crudas y purificadas de dosis igualadas afecte al tropismo celular. Por lo tanto, las preparaciones de vectores crudos se pueden utilizar de manera similar a los vectores purificados en cultivos celulares.
<img alt="eficiencia de transducción de vectores AAV en líneas celulares; Tabla de datos, imágenes de microscopía de fluorescencia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Transducción de vectores crudos de varios tipos de células . (A) Porcentaje de mScarlet+ después de la adición de varios vectores AAV que contienen un transgén mScarlet . (B) Células que expresan mScarlet liberadas del serotipo 2 de AAV. Barras de escala: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 y HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Abreviaturas: hpt = horas después de la transducción. (C) Los organoides del intestino delgado (mSIO) de ratón fueron tratados con rAAV en medios de pre-transducción o en medios de crecimiento de organoides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla complementaria 1: Hoja de trabajo de transfección de plásmidos triples. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/TriplePlasmidTransfection_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 2: Hoja de trabajo de optimización de PEI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/PEIoptimization_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El virus adenoasociado recombinante (rAAV) se usa ampliamente para la administración clínica y preclínica de genes. Un uso poco apreciado de los rAAV es la transducción robusta de células cultivadas sin necesidad de purificación. Para los investigadores nuevos en rAAV, proporcionamos un protocolo para la clonación de casetes transgénicos, la producción de vectores crudos y la transducción de cultivos celulares.

Expresión de transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue ...

La terapia génica utiliza una cápside viral para introducir ADN en las células, y luego las células procesan ese ADN a través de mecanismos que no se comprenden completamente. Al estudiar cómo la célula procesa el ADN entregado por AAV, esperamos mejorar la seguridad, la eficacia y la longevidad de las terapias génicas AAV. Estudiar el procesamiento del ADN AAV a nivel de tejido u organismo fue bastante difícil.Y mientras desarrollábamos protocolos de transducción de cultivos celulares para la visualización de AAV a través de microscopía de superresolución, descubrimos que la simplicidad de producir y usar preparaciones de AAV no purificadas en cultivos celulares no es bien conocida. Este método sencillo para la expresión transitoria puede ser ventajoso para los investigadores en numerosos campos. La creación de preparaciones crudas de AAV es bastante simple y tienen una larga vida útil F4C, lo que les permite usarse en numerosos experimentos.Su aplicación es sencilla, lo que los convierte en una alternativa rentable y rápida a los reactivos de transfección estándar. A menudo, las preparaciones crudas de AAV son más eficientes y menos tóxicas que la transfección. La vectrología tiene dos brazos, la producción y la transducción, y ambos dependen completamente de la maquinaria celular huésped.Nuestra investigación futura tiene como objetivo identificar la maquinaria celular involucrada en estos procesos y las formas de manipularlos para que podamos mejorar la eficiencia de la producción y la transducción. Comprender la biología básica que sustenta ambas ramas de la vectrología es vital para el éxito de las terapias génicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe la identificación del serotipo del virus adeno-asociado 3 (AAV3) como el vector más eficiente para orientar las células humanas del cáncer de hígado.

De alta eficiencia de transducción de las células de cáncer de hígado por recombinante serotipo del virus adeno-asociado 3 Vectores

Recombinante virus adeno-asociado (rAAVs) vectores son cada vez más valioso...

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

Se demuestra la técnica básica para diseñar y evolucionar molecularmente sintéticos virales adeno-asociados (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia de ADN arrastrando los pies. Por otra parte, nos proporcionan las pautas generales y ejemplos representativos para la selección y el análisis de cada uno de cápsidas quiméricas con propiedades mejoradas en las células diana en la cultura o en ratones.

Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN

Adenoviral la transferencia génica en células T con la expresión transgénica del receptor de adenovirus Coxsackie ingenuo CD4 permite el análisis molecular de la diferenciación de células T...

La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

Inyección intraspinal del recombinase dependiente recombinante virus adeno-asociado (rAAV) puede utilizarse para manipular cualquier tipo de célula genéticamente marcadas en la médula espinal. Aquí describimos cómo transduce las neuronas en el asta dorsal de la médula espinal lumbar. Esta técnica permite interrogatorio funcional del subtipo neurona manipulada.

Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

Aquí, describimos una estrategia eficiente y reproducible para producir, título y lotes de control de calidad de vectores de virus adeno-asociado. Permite al usuario obtener una preparación de vector con alto título (≥1 x 1013 vector genomas/mL) y una alta pureza, para uso en vitro o en vivo .

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Aquí, presentamos un protocolo para la producción de adenovirus utilizando el sistema pAdEasy. La tecnología incluye la recombinación de los plásmidos pAdTrack y pAdEasy-1, el empaquetado y la amplificación del adenovirus, la purificación de las partículas adenovirales del lisato celular y el medio de cultivo, la titulación viral y las pruebas funcionales del adenovirus.

Un método eficiente para la producción de adenovirus

Se describen métodos para la generación de grandes cantidades de adenovirus recombinantes, que luego se pueden utilizar para transducir el urotelio nativo de roedores permitiendo la expresión de transgenes o la regulación a la baja de productos génicos endógenos.

Expresión de transgenes en urotelio de vejiga nativa mediante transducción mediada por adenovirus

El virus adenoasociado se produce en cultivo celular en suspensión y se purifica mediante centrifugación de doble gradiente de densidad de yodixanol. Se incluyen medidas para aumentar el rendimiento total del virus, disminuir el riesgo de precipitación del virus y concentrar aún más el producto final del virus. Los títulos finales esperados alcanzan las 1012 partículas virales/ml y son adecuados para el uso preclínico in vivo .

Producción de cultivos en suspensión y purificación de virus adenoasociados mediante centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol para aplicaciones in vivo

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la generación y purificación de vectores virales adenoasociados utilizando un método optimizado de cromatografía de afinidad basado en heparina. Presenta un enfoque simple, escalable y rentable, que elimina la necesidad de ultracentrifugación. Los vectores resultantes exhiben una alta pureza y actividad biológica, lo que demuestra su valor en estudios preclínicos.

Aislamiento de vectores virales adenoasociados mediante un protocolo de cromatografía de afinidad con heparina semiautomatizado y de un solo paso

Aprende a expresar transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados. Este método simplificado ofrece una alternativa eficiente y económica para la transducción celular en terapia génica.

Expresión de transgenes en células cultivadas utilizando vectores virales adenoasociados recombinantes no purificados

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