Name: Uso de explantes de piel de ave para estudiar el patrón de tejidos y la organogénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a establecer cultivos de explantes de piel embrionaria aviar para estudiar interacciones tisulares y mecanismos moleculares en la organogénesis. Este método permite analizar procesos morfogenéticos aplicables a la medicina regenerativa.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de las subvenciones R37 AR 060306, R01 AR 047364 y RO1 AR078050 de los NIAMS. El trabajo también está respaldado por un contrato de investigación colaborativa entre la USC y la Universidad Médica de China en Taiwán. Agradecemos a la clase USC BISC 480 Developmental Biology 2023 por probar con éxito este protocolo de cultivo de piel aviar durante varios módulos de laboratorio.

1. Cultivo de explantes de piel de pollo (Figura 1)
<ol><li>Incubar los huevos de gallina fertilizados en una incubadora humidificada a 38 °C y escalonarlos de acuerdo con Hamburger y Hamilton14.<ol><li>En la etapa 28 (~E5.5), el segundo dedo y el tercer dedo de la extremidad son más largos que los demás; Tres dedos y cuatro dedos son distintos.</li>
		<li>En la etapa 29 (~E6), el ala se dobla a la altura del codo; El segundo dígito es claramente más largo que los demás.</li>
		<li>En la etapa 30 (~E6.5), dos filas de yemas de plumas dorsales a cada lado de la médula espinal son visibles a nivel braquial y tres filas se ven a nivel de las piernas.</li>
		<li>En la etapa 31 (~E7), hay ~7 filas de plumas en los niveles jumbo-sacros.</li>
		<li>En la etapa 32, once o más filas de yemas de plumas están presentes a nivel de las patas.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque un embrión de pollo de etapa 28-32 en una placa de Petri de 60 mm que contenga solución salina tamponada de Hanks (HBSS) o solución salina tamponada con fosfato (PBS).<ol><li>Disecciona la piel dorsal del embrión entre la parte inferior del cuello y la región de la cola. Usa unas tijeras para separar la cabeza del cuello. Tire suavemente de las yemas de las extremidades para colocar el lado ventral del cuerpo hacia abajo con los apéndices extendidos hacia afuera.</li>
		<li>Haga una incisión anterior a posterior en la piel a lo largo de los dos lados flanqueantes del cuerpo del embrión con pinzas de relojero o tijeras de resorte afiladas. Asegúrese de estabilizar el cuerpo con un par de pinzas pellizcando las yemas de las extremidades longitudinalmente. Pele suavemente la piel desde el cuello hasta la región de la cola o desde la cola hasta el cuello con pinzas de relojero.</li>
	</ol></li>
	<li>Retire suavemente los tejidos subcutáneos que permanecen adheridos a la piel pelada y alise los bordes de la piel con las tijeras de resorte afiladas.</li>
	<li>Agregue 2 mL/pocillo del medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% y solución de penicilina/estreptomicina (diluida 1:100) a un pocillo en un plato de 6 pocillos. Una vez que se hayan agregado el medio y los antibióticos, coloque un inserto de cultivo de tejido estéril dentro del pocillo, de modo que el medio quede en el exterior del inserto de cultivo.</li>
	<li>Transfiera la piel con una espátula al inserto de cultivo con la epidermis hacia arriba y el mesénquima hacia abajo en la membrana del inserto. Para asegurarse de que la piel quede plana sin arrugas, tire de la piel sobre la espátula en HBSS. Deslice la piel de la espátula con el líquido para facilitar la transferencia de la piel sin pliegues.</li>
	<li>Elimine el exceso de HBSS del inserto de cultivo con una pipeta de 200 μL. Deje una capa delgada de HBSS dentro del inserto de cultivo para mantener el explante semihúmedo para proporcionar una interfaz aire-líquido.</li>
	<li>Incubar los cultivos de explantes cutáneos a 37 °C utilizando 5% de CO2 y 95% de aire. Cambie el medio cada 2 días. NOTA: Este procedimiento ha sido publicado4. Este sistema de cultivo también se puede utilizar con la piel de otras aves como cultivos de explantes de piel de codorniz o pinzón.</li>
</ol>2. Recombinación epitelio-mesenquimal de la piel de pollo (Figura 2)
<ol><li>Incubar los huevos de gallina fertilizados en una incubadora humidificada a 38 °C y organizar los embriones de acuerdo con Hamburger y Hamilton14 (sección 1.1).</li>
	<li>Prepare 2 soluciones salinas sin calcio y magnesio (CMF) con tampón de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25%.<ol><li>Prepare 10 tampones CMF (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH2PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH2PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO3 (0,12 M) 10 g, glucosa (0,1 M) 20 g en 1.000 mL de agua destilada. Ajuste el pH a 7.3. Para hacer 100 mL de 2x CMF con tampón EDTA al 0,25%, el EDTA debe disolverse primero en 80 mL de agua destilada, luego agregar 20 mL de tampón CMF 10x para hacer 2x CMF con una solución de trabajo de EDTA al 0,25%.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseccionar las pieles dorsales de los embriones de pollo en la etapa 30-32 en HBSS como se ha descrito anteriormente (sección 1.2) e incubarlas en solución salina 2x CMF con EDTA al 0,25% en hielo durante 15-20 min.</li>
	<li>Separe cuidadosamente el epitelio y el mesénquima con pinzas de relojero. Transfiera el epitelio y el mesénquima separados a un plato limpio que contenga HBSS.</li>
	<li>Vuelva a combinar el epitelio con el mesénquima colocando primero el mesénquima en una placa de Petri que contenga HBSS, luego coloque el epitelio encima del mesénquima. Coloque el epitelio a lo largo del mismo eje antero-posterior que el mesénquima o gire el epitelio a90º del eje antero-posterior del mesénquima para determinar qué componente regula diferentes aspectos de la morfogénesis de la piel.</li>
	<li>Transfiera las pieles recombinadas a insertos de cultivo en placas de cultivo de 6 pocillos para su crecimiento y elimine el exceso de HBSS alrededor de la piel recombinada.</li>
	<li>Coloque 2 mL de medio de cultivo DMEM con 10% de FBS en el pocillo fuera del inserto. Coloque una capa delgada de DMEM dentro de la cámara del inserto para mantener el explante semihúmedo para proporcionar una interfaz aire-líquido.</li>
	<li>Incubar los recombinantes cutáneos a 37 °C en una mezcla de 5% de CO2 y 95% de aire. Cambie el medio cada 2 días. Documente los cambios fenotípicos en las fases iniciales del desarrollo de la piel utilizando fotografía de lapso de tiempo con una cámara montada en un microscopio de disección. NOTA: Este procedimiento ha sido publicado11.</li>
</ol>3. Reconstitución de la piel de pollo (Figura 3)
<ol><li>Incubar los huevos de gallina fertilizados en una incubadora humidificada a 38 °C y organizar los embriones de acuerdo con Hamburger y Hamilton14 (sección 1.1).</li>
	<li>Diseccionar las pieles dorsales de los embriones de pollo en estadio 30-33 en HBSS. Incubar las pieles en solución salina CMF 2x con 0,25% de EDTA en hielo durante 15-20 min como se ha descrito anteriormente (sección 2.3).</li>
	<li>Separe cuidadosamente el epitelio y el mesénquima con pinzas de relojero. Transfiera el epitelio y el mesénquima separados a HBSS en hielo. NOTA: Tenga cuidado de no dañar la capa basal del epitelio al separar el epitelio del mesénquima.</li>
	<li>Recoja el mesénquima separado en un tubo de centrífuga de 15 ml e incube con una solución de colagenasa/tripsina al 0,1% hecha en PBS en un baño de agua a 37 °C durante 10-15 minutos.</li>
	<li>Disocie el mesénquima de la piel con una pipeta Pasteur para hacer una suspensión unicelular. Agregue DMEM con 10% de FBS para detener la digestión.</li>
	<li>Pellet y centrifugar las células a 233 × g durante 5 min. Resuspendió las células con medio de cultivo a una concentración de 2 × 107 células/mL. NOTA: En este paso, las células mesenquimales también se pueden resuspender en un medio que contiene virus durante 2-3 horas en hielo para la transducción de genes.</li>
	<li>Coloque un inserto de cultivo celular en un pocillo de un plato de 6 pocillos. Deje caer 10 μL de 2 × 107 células/mL de células mesenquimales en el inserto de cultivo de tejidos. Coloque 2 ml de medio de cultivo DMEM con 10% de FBS en el pocillo exterior del inserto. Incubar las células mesenquimales en placa a 37 °C utilizando una incubadora de 5% de CO2 y 95% de aire durante 1 h para permitir que las células se asienten en la membrana del inserto.</li>
	<li>Transfiera el epitelio intacto sobre la gota mesenquimal plateada con la capa de células basales del epitelio frente a las células mesenquimales utilizando una pipeta de 1 mL. NOTA: Al transferir el epitelio a la gota mesenquimatosa, las células mesenquimales no deben ser alteradas.</li>
	<li>Aplana el epitelio intacto sobre el mesénquima para hacer el explante de la piel reconstituida. Deje una capa delgada del medio en el inserto para mantener el explante de piel reconstituido semihúmedo para proporcionar una interfaz aire-líquido. Incubar el explante de piel reconstituida a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 y 95% de aire. Cambie el medio cada 2 días. NOTA: Este procedimiento ha sido publicado13.</li>
</ol>

Una revisión exhaustiva de los protocolos de cultivo de explantes de piel embrionaria aviar

<ol><li>Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLucas%2C+AM+%22Agriculture+Handbook%22">Agriculture Handbook</a>. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).</li>
<li>Sengel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSengel%2C+P+%22In+Morphogenesis+of+Skin%2C+l-277%22">In Morphogenesis of Skin, l-277</a>. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).</li>
<li>Dhouailly, D., Wilehm Roux, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+cutaneous+appendages+in+dermo-epidermal+recombinations+between+reptiles%2C+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals.</a> Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).</li>
<li>Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+feather+morphogenesis%3A+I.+Analyses+with+antibodies+to+Adhesion+Molecules+Tenascin%2C+N-CAM+and+Integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin.</a> Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+organs+by+a+Wnt+%2F+Notch+%2F+non-muscle+myosin+module+which+orients+feather+bud+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+coordinate+feather+mesenchymal+cell+movement+by+SHH+dependent+modulation+of+gap+junction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks.</a> Nature Communications. 9 (1), 5377(2018).</li>
<li>Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+delivery+of+TGF+beta2+can+restore+epithelium+dependent+organization+of+mesenchymal+condensation+during+skin+appendage+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis.</a> Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).</li>
<li>Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+induces+new+feather+buds+from+developing+avian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigation+Dermatology%22%5BJournal%5D)">FGF induces new feather buds from developing avian skin.</a> Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).</li>
<li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+in+scale+and+feather+development+as+studies+in+dermal-epidermal+recombinations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).</li>
<li>McAleese, S. R., Sawyer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+the+phenotype+of+the+epidermis+from+chick+embryos+homozygous+for+the+gene+scaleless+%28sc%2Fsc%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc).</a> Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).</li>
<li>Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+during+avian+skin+appendage+regeneration%3A+dependence+on+epithelial-mesenchymal+interaction+and+order+of+molecular+reappearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance.</a> J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).</li>
<li>Jiang, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+feather+orientations+changed+by+electric+current%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Global feather orientations changed by electric current.</a> iScience. 24 (6), 102671(2021).</li>
<li>Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+periodic+patterns+by+dissociated+feather+mesenchymal+cells+and+the+regulation+of+size%2C+number+and+spacing+of+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia.</a> Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).</li>
<li>Chen, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+early+odontogenic+signaling+pathway+in+Aves%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).</li>
<li>Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Skin+Morphogenesis%3A+II.+Retinoic+acid+gradient+modulates+axis+orientation+and+phenotypes+of+skin+appendages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages.</a> Development. 115 (3), 839-852 (1992).</li>
<li>Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+A+and+protein+kinase+C+modulators+have+reciprocal+effects+on+mesenchymal+condensation+during+skin+appendage+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis.</a> Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+biological+networks+via+adaptive+patterning+revealed+by+avian+intradermal+muscle+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

La recombinación de tejidos proporciona un ensayo para explorar las contribuciones únicas del epitelio y el mesénquima. En los pollos, las plumas comienzan a desarrollarse en el día embrionario 7 (E7), mientras que las escamas comienzan en E9. Cuando el mesénquima de escamas E9 se recombina con el epitelio de las plumas E7, el tejido recombinado forma escamas, y cuando el mesénquima de las plumas E7 se recombina con el epitelio de las escamas E9, se forman plumas11. Estos estudios han demostrado q...

El desarrollo de la piel del embrión aviar es un excelente modelo para estudiar los mecanismos de morfogénesis debido a los distintos patrones y la accesibilidad a la microcirugía y la manipulación 1,2. Sin embargo, la evaluación de eventos celulares y moleculares en tejidos intactos puede ser difícil porque la presencia de tejidos extraños puede complicar las observaciones microscópicas. Además, la capacidad de manipular la expresión génica para probar su papel en la morfogénesis de la piel no siempre es una tarea sencilla. Descubrimos que podemos probar las funciones de los genes mediante la transducción retroviral con una mayor tasa de éxito utilizando modelos de explantes de piel. Aquí discutimos las ventajas de tres modelos de explantes de piel que se han desarrollado.
El cultivo de piel embrionaria aviar es un poderoso sistema para evaluar el comportamiento celular, la regulación génica y la función durante el desarrollo de las yemas de las plumas de la piel 3,4,5,6. Permite la evaluación de los mecanismos moleculares del desarrollo de las yemas de las plumas a través de la adición global de factores de crecimiento colocados en los medios de cultivo o su liberación local a partir de perlas recubiertas de factores de crecimiento. Los genes reguladores del desarrollo también pueden manipularse utilizando la transducción de genes virales de formas negativas intactas o dominantes para estudios funcionales que evalúan su papel en eventos morfogenéticos específicos 7,8.
El cultivo de recombinación epitelio-mesenquimal aviar permite a los investigadores determinar las contribuciones de cada componente de la piel durante las primeras etapas de la morfogénesis de la piel. El uso de este enfoque por parte de Rawles reveló que las interacciones entre el mesénquima y el epitelio son esenciales para la formación de apéndicescutáneos 9. El mesénquima puede formar condensaciones y el epitelio es necesario para inducir y mantener las formaciones de condensación mesenquimal2. Más tarde, este enfoque se utilizó para evaluar por qué los pollos sin escamas no logran formar plumas. Se descubrió que el defecto estaba en el mesénquima10. Dhouailly realizó estudios de recombinación epitelio-mesenquimal tisular en embriones de diferentes especies. Estos estudios proporcionaron información sobre el desarrollo y la evolución de las comunicaciones epitelio-mesenquimales que promueven la morfogénesis de la piel3.
Este estudio se utilizó para comprender mejor los factores que controlan el crecimiento de las plumas. El método también mejora la visualización de los eventos celulares y moleculares involucrados en el modelado de la piel que tienen lugar durante la iniciación, el desarrollo y el alargamiento de las plumas a lo largo del eje antero-posterior. Cuando el epitelio se separa del mesénquima y los dos componentes se recombinan, las nuevas interacciones restablecen el patrón de la piel. Este enfoque nos permite evaluar las señales inductoras mesenquimales y las moléculas de competencia epitelial que permiten a la epidermis responder a las señales mesenquimales11. También se puede examinar la expresión molecular posterior que se requiere para el desarrollo de las yemas de las plumas y la formación de patrones. Estos estudios han establecido que la ubicación de las yemas está controlada por el mesénquima. La rotación del epitelio 90o antes de la recombinación con el mesénquima demuestra que la dirección de la elongación de la yema de la pluma está controlada por el epitelio. Este método fue esencial para estudiar el mecanismo molecular que regula la orientación de las yemas de las plumas12.
El cultivo de reconstitución de la piel aviar, en el que el mesénquima de la piel se disocia en células individuales antes de la siembra a alta densidad celular y se superpone con epitelio intacto, restablece las células dérmicas a un estado primordial. A continuación, el explante se autoorganiza para formar un nuevo patrón periódico independiente de las señales anteriores13. Este modelo de reconstitución de la piel se puede utilizar para estudiar los procesos iniciales del patrón periódico de las plumas. Utilizamos este enfoque para explorar cómo la modulación de la proporción de células mesenquimales por una sola pieza de epitelio puede influir en el tamaño o el número de yemas de plumas. Se encontró que el número de yemas aumentaba, pero no el tamaño de las yemas, ya que aumentaba la proporción de células mesenquimales. Otra ventaja de este enfoque es que la transducción viral de células mesenquimales muestra una mayor eficiencia que en las otras dos condiciones de cultivo y puede producir fenotipos más obvios.

<table><tbody><tr><td>plato de cultivo de 6 pocillos&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>REF 353502</td><td>Cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) &nbsp;</td></tr><tr><td>Recuadro de cultivo celular&nbsp;</td><td>Halcón</td><td>REF 353090.</td><td>0,4 y micro; m Membrana PET</td></tr><tr><td>transparente colagenasa tipo 1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4,5 g/L</td></tr><tr><td>glucosa Ácido etilendiaminotetraacético sal disódica dihidratada (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ThermoFisher</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Solución salina tamponada</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>Sin calcio, sin magnesio</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de pogasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (Nacl)</td><td>EMD&nbsp;</td><td>CAS 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>27250-042</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de explantes de piel de ave para estudiar el patrón de tejidos y la organogénesis

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

El desarrollo de la piel aviar durante la embriogénesis es un modelo único que puede proporcionar información valiosa sobre el patrón de los tejidos. Aquí se describen tres variaciones de los cultivos de explantes cutáneos para examinar diferentes aspectos del desarrollo de la piel. En primer lugar, los cultivos y manipulaciones de órganos ex vivo ofrecen a los investigadores la oportunidad de observar y estudiar directamente el desarrollo de las yemas de las plumas. El cultivo de explantes de piel puede crecer durante 7 días, lo que permite el análisis directo del comportamiento celular y la obtención de imágenes 4D a intervalos durante este período de crecimiento. Esto también permite manipulaciones físicas y moleculares de las condiciones de cultivo para visualizar la respuesta de los tejidos. Por ejemplo, las cuentas recubiertas con factor de crecimiento se pueden aplicar localmente para inducir cambios en el patrón de las plumas en un área limitada. Alternativamente, la transducción viral puede administrarse globalmente en los medios de cultivo para aumentar o disminuir la expresión génica. En segundo lugar, el protocolo de recombinación de piel permite a los investigadores investigar las interacciones de los tejidos entre la epidermis y el mesénquima que se derivan de diferentes regiones de la piel, diferentes etapas de la vida o diferentes especies. Esto brinda la oportunidad de probar la ventana de tiempo en la que el epitelio es competente para responder a las señales y su capacidad para formar diferentes apéndices de la piel en respuesta a señales de diferentes fuentes mesenquimales. En tercer lugar, la reconstitución de la piel mediante el uso de células dérmicas disociadas superpuestas con epitelio intacto restablece el desarrollo de la piel y permite el estudio de los procesos iniciales de patrones periódicos. Este enfoque también mejora nuestra capacidad para manipular la expresión génica entre las células disociadas antes de crear el explante de piel reconstituido. Este artículo proporciona los tres protocolos de cultivo y experimentos ejemplares para demostrar su utilidad.

Cultivos de explantes cutáneos El desarrollo de las yemas de las plumas a partir de cultivos de órganos cutáneos ex vivo puede observarse directamente bajo el microscopio. Utilizando el modelo de cultivo de explante de piel dorsal de pollo en estadio 30, las placodas son visibles a lo largo de la línea media. Luego, el frente morfogenético se propaga gradualmente lateralmente hacia la periferia de la piel con la formación de nuevos primordios plumosos. Estos primordios de plumas se desarrolla...

Aquí describimos los protocolos para tres tipos de cultivos de explantes de piel embrionaria aviar que se pueden utilizar para examinar las interacciones de los tejidos, la película de lapso de tiempo de imágenes 4D (3D más tiempo), la perturbación global o local de la función molecular y la caracterización de la biología de sistemas.

Uso de explantes de piel de ave para estudiar el patrón de tejidos y la organogénesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

El objetivo de investigación de mi equipo de investigación es comprender el desarrollo de los tejidos y la regeneración. Este objetivo es particularmente importante en la investigación con células madre en la actualidad. Esperamos comprender los principios de cómo se forma un órgano.Y este conocimiento no solo nos ayuda a entender la naturaleza, sino que también se puede aplicar para ayudar a la medicina regenerativa. El reto al que nos enfrentamos es entender el proceso molecular y celular implicado en estos procesos morfogenéticos. Por lo tanto, necesitamos tener un sistema de cultivo de explantes para analizar cuidadosamente los procesos moleculares y celulares, porque no es posible hacer esto in vivo.Para llenar este vacío de conocimiento, los científicos han desarrollado diferentes formas de cultivos de organoides. En el cultivo de organoides, podremos tomar el movimiento celular colectivo para ver cómo las células interactúan entre sí. También podemos manipular las células para que expresen diferentes moléculas y probar la función de las moléculas.El enfoque único que utilizamos es el cultivo de explantes de piel de pollo. La piel de pollo se usa porque son fácilmente accesibles desde el huevo y forman yemas de plumas distintas, dispuestas en un patrón hexagonal como una lectura de los patrones de tejido. Hay tres maneras de hacer la cultura, como verás.Una es sostener el cultivo de explantes, permitirnos tomar las películas o entregar moléculas para perturbar el sistema. En segundo lugar, para estudiar la contribución de los epicilios o mesenzimas, podemos desmontarlos y volver a ponerlos. En tercer lugar, para desafiar aún más la capacidad de cada célula, las disociamos en las células individuales y probamos cómo vuelven a reorganizarse en los patrones de tejido.A través de estos enfoques, hemos podido obtener una nueva comprensión hacia el patrón de tejidos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se presenta una metodología sencilla para que a largo...

Un Ex-ovo</emPollo> Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía

En este artículo se describe una técnica de trasplante de tejido que se diseñó para probar la señalización y las propiedades de los patrones de la superficie del ectodermo cefálico durante el desarrollo craneofacial.

La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

Este artículo proporciona un acercamiento actualizado al sistema clásico de codorniz-gallina de quimera para estudiar la formación del órgano, mediante la combinación de nuevos procedimientos experimentales in vitro e in ovo .

Enfoque de dos pasos para explorar y finales-inicios de la formación de órganos en el modelo aviar: el timo y glándulas paratiroides organogénesis paradigma

Aquí, presentamos un organotypic cultivo protocolo para crecer órganos embrionarios de pollo en vitro. Usando este método, el desarrollo de tejidos de embrión de pollo puede ser estudiado, manteniendo un alto grado de control sobre el ambiente de cultivo.

Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

Este artículo proporciona un método para aislar puros tejidos embrionarios de embriones de codorniz y pollo que pueden combinarse para formar ex vivo quimérica órganos.

Aislamiento de los tejidos embrionarios y formación de órganos quiméricas pollo codorniz utilizando el ejemplo de timo

Este artículo describe una técnica de trasplante de tejido que fue diseñada para probar las propiedades de señalización y patrones del prosencéfalo basal durante el desarrollo craneofacial.

Creación de quimeras del cerebro anterior aviar para evaluar el desarrollo facial

El pollito es un organismo modelo rentable, accesible y ampliamente disponible para una variedad de estudios. Aquí, se detalla una serie de protocolos para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la regeneración del oído interno aviar.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

El embrión de Xenopus laevis sigue siendo excepcionalmente útil en el estudio del desarrollo temprano debido a su gran tamaño y facilidad de manipulación.   Se proporciona un protocolo simplificado para el protocolo de hibridación in situ de montaje completo que se puede utilizar en la identificación de órganos específicos en este sistema modelo.

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Queratocitos de pez cebra migran en láminas de células a partir de explantes y proporcionan un modelo in vitro para el estudio de los mecanismos de migración celular colectiva en el contexto de la cicatrización de la herida epitelial. Estos protocolos detalle una forma efectiva para establecer cultivos de explantes primarios para su uso en ensayos de migración celular colectivos.

Pez cebra queratocitos explantes para estudiar la migración celular colectiva y reepitelización en Curación de Heridas cutáneas

El cultivo de gotas verticales ex vivo es una alternativa a las técnicas experimentales actuales in vitro e in vivo. Este protocolo es fácil de realizar y requiere cantidades más pequeñas de reactivo, a la vez que permite la capacidad de manipular y estudiar la vascularización, morfogénesis y organogénesis fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Aprenda a establecer cultivos de explantes de piel embrionaria aviar para estudiar interacciones tisulares y mecanismos moleculares en la organogénesis. Este método permite analizar procesos morfogenéticos aplicables a la medicina regenerativa.

Uso de explantes de piel de ave para estudiar el patrón de tejidos y la organogénesis

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