Name: Trazabilidad de lípidos de novo mediante el marcaje de isótopos estables LC-TIMS-TOF MS/MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a cuantificar lípidos mediante marcaje con isótopos estables y LC-TIMS-TOF MS/MS en muestras diversas. Este método mejora el análisis lipidómico y establece bases para estudios de epigenética y metabolómica.

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A los autores les gusta reconocer las contribuciones del Dr. César Ramírez durante el desarrollo inicial del método. Esta investigación fue financiada por las subvenciones del NIAID R21AI167849 a FGN, proyecto 22-21244S de la Fundación Checa de Ciencias, República Checa a MN.

1. Preparación de la muestra
<ol><li>Disección de insectos<ol><li>Diseccionar los ovarios del mosquito Aedes aegypti cuando tienen 7 días de edad en una solución salina tamponada con fosfato utilizando microagujas.</li>
		<li>Recoja ocho ovarios de la solución salina tamponada con fosfato utilizando microagujas y almacene en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a -80 °C.</li>
		<li>Recolectar ovarios en réplicas biológicas.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de lípidos<ol><li>Añadir 10 μL de patrón interno (ISTD) en los ocho ovarios recolectados en una concentración de 1 ppm. El ISTD es una mezcla lipídica marcada con siete deuterios de 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina-D7 (15:0-18:1 (D7) PC), lisofosfatidilcolina-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil-glicero-3-fosfoetanolamina-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glicerol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glicerol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-octadecenoyl-sn-glicerol-D7 (18:1 MAG (D7)), oleato de colesterol-D7 (18:1 (D7) Chol Ester).</li>
		<li>Espere hasta que se seque a temperatura ambiente. Añadir 100 μL de butanol/metanol y 3 μL de butilhidroxitolueno. Homogeneizar manualmente durante 10 s con morteros de polipropileno de 1,5 mL.</li>
		<li>Enjuagar el mortero con 200 μL de butanol/metanol y combinar con la solución homogeneizada.</li>
		<li>Sonicar el tubo de la microcentrífuga a temperatura ambiente y a potencia media durante 30 min.</li>
		<li>Tubos de centrífuga a 1600 x g durante 10 min a 20 °C. Transfiera el sobrenadante a un vial de muestreador automático con 300 μL de insertos de vidrio silanizado.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Configuración del instrumento
<ol><li>Preparación de la fase móvil<ol><li>Prepare la fase móvil con una composición de 30:40:30 (fase móvil A) y 10:5:85 (fase móvil B) utilizando acetonitrilo, agua e isopropanol como proporción respectiva. En ambas fases móviles, añadir 10 mmol/L de formiato de amonio en agua y 0,1% de ácido fórmico para crear una condición tampón.</li>
		<li>Pesar 3,15 g de formiato de amonio en 10 ml de agua. Añadir 500 μL de esta solución en 12,5 mL de agua. En secuencia, se coloca en un matraz aforado de 250 ml y se llena con isopropanol hasta aproximadamente 2/3 del matraz. Mezclar remolando.</li>
		<li>Agregue 250 μL de ácido fórmico (85%), llene con 25 mL de acetonitrilo e isopropanol a la línea de llenado de 250 mL y mezcle.</li>
	</ol></li>
	<li>En el sistema MS, en el lado izquierdo de la pantalla en la configuración de MS, determine el rango de masa seleccionando 50 como mínimo y 1850 como la configuración de escaneo máximo.<ol><li>Seleccione Polaridad como modo de iones positivos. Seleccione el modo de escaneo como DIA-PASEF. Para ello, seleccione Ajustar y abrir el método de análisis de un método DDA anterior con los siguientes parámetros LC.<ol><li>Para la separación de gradientes: Inyección de muestra: 0% B, tiempo de retención 1 min. Aumente a 55% B, mantenga presionado hasta 6.4 min. Aumentar a 65% B, mantener hasta 24 min. Aumente a 88% B, mantenga hasta 40.8 min. Aumente a 95% B, mantenga hasta 48.1 min. Disminuya a 35% B, mantenga hasta 56 min. Disminuya a 0% B, mantenga hasta 60 min.</li>
			<li>Para condiciones de HPLC: Volumen de inyección: 5 μL Tasa de disolvente: 0,25 mL/min Tiempo total de ejecución: 60 min, de los cuales 5 min son para preacondicionar la columna.</li>
			<li>Prepare el cromatógrafo de líquidos insertando la columna en el cromatógrafo de líquidos. Ejecute un espacio en blanco para limpiar la columna y probar si hay fugas. Esto se puede ver en que el instrumento no mantiene la presión o el flujo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Para crear un nuevo método, realice los pasos que se describen a continuación (Figura 1 y Figura 2).<ol><li>Abra el software y haga clic en Conectar todos los instrumentos. Si la conexión es exitosa, el sistema LC emitirá un pitido y la pantalla de control mostrará HyStar en el cuadro de estado sin ningún mensaje de error.</li>
		<li>Haga clic en la pestaña Adquisición . En el Navegador de tablas de muestra, busque el menú desplegable de etiquetas y seleccione un método anterior.</li>
		<li>Duplique la tabla de muestra más reciente. Haga clic en Guardar como... y guarde la nueva lista de muestra con el formato: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) donde (XXXX) es un breve descriptor del análisis.</li>
		<li>Haga clic derecho en el método de separación y haga clic en Editar método. Haga clic en Editar método de módulo.</li>
		<li>Haga clic en Descargar. Si se realiza correctamente, aparecerá la descarga correcta. Cierre la pantalla sin guardar el método.</li>
		<li>En la configuración de MS, vaya a la configuración de TIMS, seleccione el 1/k0 que comienza en 0.70 y el final de 1/k0 en 1.85. Establezca el tiempo de rampa en 150 ms. Con esto, el ciclo de trabajo y la velocidad de rampa se ajustan automáticamente.</li>
		<li>En la ventana inferior, seleccione la pestaña Origen . Seleccione el tipo de fuente como ESI y ajuste el desplazamiento de la placa final a 800 V y el capilar a 4500 V. Verifique la caja del nebulizador y ajuste la presión a 4.0 bar. Ajuste el gas seco a 4,0 L/min y la temperatura seca a 250 °C.</li>
		<li>A la derecha de la pestaña de origen, seleccione la pestaña Optimización. Haga clic en la pestaña Sub general y, en el encabezado de transferencia, asegúrese de que se cumplan los siguientes parámetros: Deflexión 1 delta: 70 V Embudo 1 RF: 250 vpp Energía isCID: 0 eV Embudo 2 RF: 250 vpp RF multipolar: 500 vpp.<ol><li>En el encabezado de la celda de colisión, asegúrese de los siguientes parámetros: Energía de colisión: 6,0 eV Colisión RF: 1200 vpp.</li>
			<li>En el encabezado de cuadrupolo, asegúrese de que se cumplan los siguientes parámetros: Energía iónica: 6 eV Masa baja: 250 m/z.</li>
			<li>En la pestaña pre-TOF de foco, asegúrese de los siguientes parámetros: Tiempo de transferencia: 45 μs Almacenamiento previo al pulso: 5,0 μs.</li>
		</ol></li>
		<li>Haga clic en la subpestaña Procesamiento . La detección de picos en espectros de masas garantiza los siguientes parámetros: Umbral absoluto: 667 Umbral absoluto (por 100 ms de AccuTime): 445.<ol><li>En la detección de picos de movilidad, asegúrese de que se cumplan los siguientes parámetros: Umbral absoluto: 30,00.</li>
		</ol></li>
		<li>Haga clic en la subpestaña TIMS . En la pestaña de desplazamientos, asegúrese de que se cumplan los siguientes parámetros: Δt1: -20 V Δt2: -150 V Δt3: 70 V Δt4: 150 V Δt5: 0 V Δt6: 150 V Célula de colisión: 300 V.</li>
		<li>A la derecha de la pestaña de ajuste, haga clic en la pestaña MS/MS . En la pestaña de iones precursores, asegúrese de que se cumplan los siguientes parámetros: Número de rampas PASEF: 8 Carga mínima: 1 Carga máxima:1.<ol><li>En la pestaña Programación, haga clic en Avanzado y asegúrese de que se cumplan los siguientes parámetros: Intensidades: 0,1500, 5000, 10000 Repetición: 1, 10, 5, 1 Umbral de intensidad: 1500.</li>
			<li>En la pestaña de exclusión activa, asegúrese de los siguientes parámetros: Marca de verificación de exclusión activa Liberación después: 0.4 min.</li>
			<li>En los ajustes de energía de colisión, asegúrese de que se cumplan los siguientes parámetros: K0 (V-s/cm3): 0,70, 1,60 Energía de colisión (eV): 20,00, 35,00.</li>
			<li>En la configuración de ancho de aislamiento, asegúrese de que se cumplan los siguientes parámetros: Masa (m/z): 622, 1222 Ancho (m/z): 1.00 2.50.</li>
		</ol></li>
		<li>Configuración de DIA -PASEF: Seleccione DIA-PASEF en el modo de escaneo de configuración de MS a la izquierda. En la pestaña MS/MS, seleccione Editor de ventanas. Aquí, asegúrese de los siguientes parámetros (Figura 3): Configuración de la ventana: Anchura de la masa: 50 Da; Superposición de masas: 0,0 Da; Calcular a partir del polígono: pasos de masa; Número de ventanas de movilidad: 1.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Calibración
<ol><li>Calibración del instrumento (Figura 4)<ol><li>En la subpestaña Calibración , haga clic en m/z, seleccione Mezcla de afinación en el cuadro desplegable y haga clic en Calibrar en la esquina inferior derecha.</li>
		<li>Continúe haciendo clic en Calibrar hasta que se alcance una puntuación del 100%.</li>
		<li>Ahora seleccione la pestaña Movilidad y siga los mismos pasos que los anteriores hasta alcanzar la puntuación de calibración del 100%.</li>
	</ol></li>
	<li>Curva de calibración<ol><li>Mezcla patrón interna de lípidos Spike con 10 μL de mezcla estándar interna deuterada. Utilice siete puntos de calibración de 0,1 a 500 ng/ml de mezcla patrón con 10 μL de la mezcla patrón interna deuterada.</li>
		<li>Anote manualmente las cadenas de ácidos grasos en función de los patrones PASEF MS/MS ya descritos en2.</li>
	</ol></li>
	<li>Eficiencia del etiquetado SIL<ol><li>Calcule la relación entre el área del SIL que contiene isótopos y el área de los isótopos que no contienen SIL.</li>
		<li>Calcule el patrón teórico determinando la probabilidad de encontrar un átomo marcado en cualquier sitio.</li>
		<li>Calcule el enriquecimiento de SIL ajustando los perfiles de isótopos experimentales con el patrón teórico simulado en el software de análisis de datos.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniciando la carrera<ol><li>Active el horno de columna haciendo clic en el botón Termómetro . Active las bombas haciendo clic en el botón Válvula .</li>
		<li>Establezca MS method en el método guardado anteriormente. Verifique que el volumen de inyección sea de 5 μL y que la línea 1 se dirija al vial 20:1.</li>
		<li>Asegúrese de que el vial 20:1 tenga un 50% de IPA/ACN. Guarde la lista de muestras.</li>
		<li>Inicie la secuencia y verifique que se haya realizado una inyección exitosa (confirmada por un mensaje que se muestra en el sistema que indica inyectado).</li>
		<li>Copie la línea 1 y péguela a continuación para generar una nueva línea. Rellene la línea 2 con muestras en función del experimento actual. Asegúrese de que se utiliza la posición correcta en el muestreador automático.</li>
		<li>Si la fase móvil es fresca, realice primero la prueba de forma máxima inyectando los estándares de mezcla de lípidos del fabricante. Comparar con los resultados anteriores. 2 Los patrones son una mezcla lipídica de 1-pentadecanoyl-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (15:0-18:1 PC), lisofosfatidilcolina (18:1 Lyso PC), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil-glicero-3-fosfoetanolamina (15:0-18:1 PE), 1-oleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18:1 Lyso PE), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoinositol (15:0-18:1 PI), 1-pentadecanoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (15:0-18:1 PS), 1,2- dipentadecanoil-3-octadecenoil-sn-glicerol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoil-2-octadecenoil)-sn-glicerol (15:0-18:1 DAG), 2-octadecenoil-sn-glicerol (18:1 MAG), oleato de colesterol (18:1 Chol Ester).</li>
		<li>Asegúrese de que las líneas nuevas tengan el método de separación correcto y no el método de preacondicionamiento utilizado en la línea 1. Asegúrese de que el método MS es correcto (método del día actual).</li>
		<li>Compruebe que se ha cargado el método de procesamiento correcto y que la opción Ejecutar proceso automatizado está habilitada.</li>
		<li>Guarde la lista de muestras para asegurarse de que las muestras se analizan una vez finalizada la ejecución actual.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Software de análisis de datos abiertos (Figura 5). En la esquina superior izquierda, haga clic en el botón Archivo y seleccione Abrir...</li>
	<li>Seleccione los archivos de su elección. Haga clic con el botón derecho en el nombre del archivo y seleccione Propiedades.<ol><li>Seleccione el estado de calibración (Figura 6). En el cuadro desplegable, seleccione Calibración inicial para el espectrómetro de masas. Asegúrese de que todos los errores sean inferiores a 1 ppm.</li>
		<li>A continuación, seleccione Calibración de movilidad inicial y confirme que el error es inferior a 1 ppm.</li>
		<li>Haga clic con el botón derecho en Cromatograma y seleccione Editar cromatograma (Figura 6C). En Tipo, haga clic en el cuadro desplegable y seleccione Cromatograma iónico extraído (Figura 6D). En filtro, seleccione Todos los MS y con el modo de escaneo seleccione Todos. Esto es para ver los picos de la molécula de interés en lugar de solo sus fragmentos.<ol><li>Debajo de esto, hay dos opciones de filtro para la selección de moléculas: Masas o Fórmula. Si se selecciona Masas , se puede elegir el m/z teórico de las moléculas de interés. Para este caso, seleccione 829.7985 m/z. Si se selecciona Fórmula , se puede elegir la fórmula para la molécula, así como las formas iónicas de interés para el cromatograma. En este caso, seleccione amonio [M+NH4]. Esto se debe al tampón de amonio en la fase móvil que favorecerá la ionización en esta forma iónica (Figura 7).</li>
			<li>Para el ancho, seleccione ±1. Para la polaridad, asegúrese de que mantenga el modo positivo. En Movilidad , seleccione 1.455-1.465. Esto se hace para filtrar cualquier molécula que no se encuentre dentro de estos valores y aislar la molécula de interés.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Una vez seleccionados los parámetros, haga clic en Agregar > en Aceptar en la parte superior derecha. Después de un corto período de tiempo, el software procesará las selecciones y generará un cromatograma.</li>
	<li>Haga clic con el botón derecho en la línea de base al comienzo del pico de interés y arrastre mientras lo mantiene presionado hasta el final del pico. Esta integración manual proporcionará un espectro de masa viva de fragmentos dentro de ese tiempo de retención.</li>
	<li>Mobilograma<ol><li>Haga clic con el botón derecho a la izquierda de la pantalla en Mobilogram y seleccione Editar Mobilograma (Figura 8). Aparecerá una ventana llamada Editar rastros de mobilograma. Siga los mismos pasos de C.e.i.1 a C.e.i.5 (Figura 9).</li>
		<li>En el tiempo de retención , introduzca el tiempo de retención del pico de interés. En este caso, 37.45-37.55 min.</li>
		<li>Una vez seleccionados los parámetros, haga clic en Agregar > en Aceptar en la parte superior derecha. Después de un corto período de tiempo, el software procesará las selecciones y generará un cromatograma.</li>
	</ol></li>
	<li>Para los iones extraídos, repita los pasos 4.2.3.1-4.3.2.2 hasta que se forme una lista de iones.</li>
	<li>En la parte inferior de la ventana de MS, seleccione Profile MS y Fragment MS. Esto permitirá una vista del espectro de iones a partir de un escaneo completo y PASEF.<ol><li>En la vista de espectro, haga clic con el botón derecho y seleccione Copiar espectros compuestos. Con los datos de espectro que aparecen a la derecha, uno puede encontrar más información sobre su compuesto, como la resolución, el poder de resolución, la intensidad y la relación señal/ruido (S/N; Figura 10).</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamiento<ol><li>Para procesar los datos, integre manualmente el cromatograma y los picos de movilidad para obtener información valiosa sobre la molécula de interés (Figura 10).</li>
		<li>Haga clic con el botón derecho en Buscar y seleccione Integrar solo cromatograma o mobilograma (Figura 11). Haga clic con el botón izquierdo y resalte el pico deseado. Esta información incluye el tiempo de retención, el área, la relación S/N y la movilidad.</li>
	</ol></li>
</ol>

Cribado de estructuras lipídicas mediante marcaje de isótopos estables

<ol><li>Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotopically+labeled+internal+standards+in+quantitative+bioanalysis+using+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%3A+Necessity+or+not%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).</li>
<li>Tose, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+stable+isotope+labeling+and+liquid+chromatography-trapped+ion+mobility+spectrometry-time-of-flight-tandem+mass+spectrometry+for+de+novo+mosquito+ovarian+lipid+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies.</a> Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).</li>
<li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).</li>
<li>Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+mobility+mass+spectrometry+enhances+low-abundance+species+detection+in+untargeted+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics.</a> Metabolomics. 12 (3), 50(2016).</li>
<li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+parallel+accumulation-serial+fragmentation+%28PASEF%29+with+a+novel+trapped+ion+mobility+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li>
<li>Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analyses+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometric+approaches%3A+DIA%2C+WiSIM-DIA%2C+and+untargeted+DIA%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA.</a> Proteomics. 18 (1), 1700304(2018).</li>
<li>Fernández-Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+identification+strategy+on+the+reproducibility+of+the+DDA+and+DIA+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results.</a> J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).</li>
<li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+data+acquisition+and+processing+strategies+with+increased+throughput+and+selectivity%3A+PSMART+analysis+for+global+qualitative+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).</li>
<li>Tsou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIA-umpire%3A+Comprehensive+computational+framework+for+data-independent+acquisition+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).</li>
<li>Triebl, A., Wenk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+considerations+of+stable+isotope+labelling+in+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics.</a> Biomolecules. 8 (4), 151(2018).</li>
</ol>

Matthew Willetts y Melvin A. Park son empleados de Bruker Daltonics Inc, el fabricante del instrumento comercial timsTOF. Los autores declaran que no hay interés financiero contrapuesto.

Al evaluar el uso de este protocolo, es esencial asegurarse de que los parámetros DIA-PASEF y MS/MS son aplicables a los triglicéridos en cuestión. Específicamente, las ventanas de movilidad y el ancho de la ventana deben seguir el patrón de los triglicéridos. Esto se puede determinar con una ejecución anterior utilizando el método DDA. Al realizar un seguimiento de los triglicéridos en el patrón interno, las ventanas para la configuración de DIA deben cubrir todas las moléculas de interés previamente identificadas. Toda...

Al analizar datos de lípidos, el marcaje de isótopos estables (SIL) es un método eficaz para evaluar las vías metabólicas en los organismos vivos. En este método, los átomos dentro de un analito son reemplazados por isótopos estables que contienen 13C o 2H. Estos isótopos se incorporan a los precursores, que luego se incrustan dentro de los ácidos grasos, marcando las áreas en las que residen. Con estos isótopos, se puede identificar la distribución y el metabolismo de los lípidos, ya que contrastarán con el fondo no marcado1. Las plataformas comunes de espectrometría de masas no son capaces de distinguir la señal procedente de las moléculas endógenas2. El éxito de SIL requiere el uso de herramientas analíticas de ultra alta resolución. La cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas en tándem de alta resolución, de alta resolución, de concentración paralela, de fragmentación secuencial, de tiempo de vuelo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) permite la separación de especies marcadas y no marcadas2. La ventaja del análisis LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS es que la señal de MS puede ser filtrada por el tiempo de retención (RT) y la movilidad, reduciendo así las posibles interferencias de las moléculas endógenas, así como la cuantificación y separación de todas las especies deseadas2. En TIMS, un ion se mantiene primero estacionario contra una fase móvil de gas y posteriormente se libera de acuerdo con su movilidad. Esto proporciona mobilogramas de alta resolución mientras funciona a un voltaje más bajo que la instrumentación IMS anterior3. Los mobilogramas son gráficos de masa a cargar frente a tiempo de deriva que se pueden utilizar para distinguir entre compuestos en función de su tiempo de deriva y la cantidad de superposición4.
Mediante el uso de una técnica PASEF adicional, la velocidad de secuenciación aumenta considerablemente sin sacrificar la sensibilidad5. La teoría PASEF implica la acumulación de iones seguida de su liberación secuencial en el orden de su movilidad. Esto se hace acumulando iones en alineación paralela a su movilidad. La acumulación de esta manera evita la pérdida de iones. Además, la selección de iones precursores se produce simultáneamente con la acumulación y liberación de los iones. Con este método, PASEF selecciona múltiples precursores en serie durante cada exploración TIMS, en lugar de los precursores individuales por exploración típicos de un instrumento TIMS que no utiliza PASEF. Cuando los iones precursores se acumulan simultáneamente y se liberan en picos de 2 ms dentro de un escaneo TIMS de aproximadamente 100 ms por trama, la señal se amplifica en más de un orden de magnitud, aumentando así la relación señal-ruido3. La adición de PASEF al TIMS aumenta la eficiencia del MS/MS. Dado que el TIMS-PASEF está acoplado con MS/MS, es posible una fragmentación más eficiente. A diferencia de la detección convencional de MS/MS, la señal precursora se comprime desde el TIMS-PASEF, y los iones fragmentados se detectan simultáneamente con el tiempo de elución de TIMS y la posición de movilidad iónica del precursor3.
Al adquirir datos de un espectrómetro de masas, hay opciones en el modo de escaneo deseado. La adquisición dependiente de datos (DDA) selecciona los iones precursores del escaneo MS1 en función de sus abundancias, antes de fragmentarlos y realizar el escaneo MS2. Este modo de escaneo fragmenta tantos precursores como sea posible. El enfoque DDA es específico y los resultados dependerán de la selección de iones3. Sin embargo, DDA-PASEF a menudo tiene problemas en la reproducibilidad entre réplicas. Si bien el DDA es una gran herramienta en un análisis enfocado, las mezclas complejas tienen mayor dificultad en su adquisición de datos6. Esto se debe a que solo se puede monitorear una pequeña cantidad de iones simultáneamente3. La adquisición independiente de datos (DIA) es un método en el que las ventanas preseleccionadas de m/z se fragmentan independientemente de su intensidad, y todas se escanean dentro del rango7. Con este modo de escaneo, se transmiten nubes iónicas completas desde el IMS al espectrómetro de masas3. En los estudios de proteómica, esto da como resultado que se cuantifiquen mayores cantidades de proteínas en un período de tiempo más corto en comparación con el DDA. Además, DIA omite menos valores m/z en comparación con DDA. Por lo tanto, esta alternativa ha mostrado grandes mejoras en la reproducibilidad de los datos en la relación señal/ruido y una mejor cuantificación que el DDA. En el presente trabajo, nuestro objetivo es implementar DIA al método reportado por Tose et al.2. Mejoramos la reproducibilidad y la intensidad de las señales, proporcionando información adicional y más concluyente sobre la movilización, distribución y metabolismo de los lípidos SIL en muestras biológicas aprovechando la adquisición de DDA y DIA.

<table><tbody><tr><td>Accucore C30 colum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27826-252130</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Compass Análisis de datos</td><td>Bruker Daltonics Inc</td><td>2363525870</td><td>versión 5.2</td></tr><tr><td>d-glucosa-13C6</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>389374</tr><tr><td>tubos eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-282-300</td><td></td></tr><tr><td>EquiSplash Lipidomix</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>330731-1EA</td><td></td></tr><tr><td>viales de vidrio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-417-236</td><td></td></tr><tr><td>agua pesada (2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>1.13366</td><td></td></tr><tr><td>morteros de polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>BAF199230001</td><td></td></tr><tr><td>Prominence LC-20 CE cromatógrafo de líquidos ultrarrápido</td><td>Shimadzu</td><td>L20234651907</td><td></td></tr><tr><td>insertos de vidrio silanizado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-251-826</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa-13C12</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>605417</tr><tr><td>timsTOF</td><td>Bruker Daltonics Inc</td><td>1.84443E+11</td><td></td></tr><tr><td>Patrón de calibración de mezcla de afinación</td><td>Agilent Technologies</td><td>36</td><td></td></tr></tbody></table>

trazabilidad de lípidos de novo mediante el marcaje de isótopos estables lc-tims-tof ms/ms

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

Los lípidos son muy diversos, y pequeños cambios en las estructuras y composición de los lípidos pueden tener efectos profundos en las funciones biológicas críticas. El marcaje de isótopos estables (SIL) ofrece varias ventajas para el estudio de la distribución, movilización y metabolismo de los lípidos, así como para la síntesis de lípidos de novo . La implementación exitosa de la técnica SIL requiere la eliminación de las interferencias de las moléculas endógenas. En el presente trabajo, describimos un protocolo analítico de alto rendimiento para el cribado de lípidos SIL a partir de muestras biológicas; Se mostrarán ejemplos de identificación de lípidos de novo durante el desarrollo del ovario del mosquito. El uso de cromatografía líquida complementaria, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas permite la separación y asignación de lípidos a partir de una sola muestra en un solo escaneo (<1 h). El enfoque descrito aprovecha los desarrollos recientes en la adquisición dependiente de datos y la adquisición independiente de datos, utilizando la acumulación paralela en la trampa de movilidad seguida de fragmentación secuencial y disociación inducida por colisiones. La medición del SIL a nivel de la cadena de ácidos grasos revela cambios en la dinámica lipídica durante el desarrollo ovárico de los mosquitos. Las estructuras de novo de lípidos se asignan con confianza en función de su tiempo de retención, movilidad y patrón de fragmentación.

El marcaje de isótopos estables facilita la visualización de los triglicéridos en los estudios de dinámica lipídica de los ovarios de las hembras de mosquito. En el dominio de movilidad 2D, el triglicérido 48:1 se muestra en una región con un tiempo de retención específico en relación con la movilidad 1/K0. La intensidad de los triglicéridos se puede visualizar mediante una línea azul más oscura. Otras manchas representan triglicéridos adicionales que se encuentran dentro del ovario. Los tiempos de retención y...

Aquí se presenta un método para el cribado de estructuras lipídicas mediante el marcaje de isótopos estables mediante el uso de su tiempo de retención, movilidad y fragmentación.

Trazabilidad de lípidos de novo mediante el marcaje de isótopos estables LC-TIMS-TOF MS/MS

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

Esta investigación pretende implementar una cuantificación más específica en muestras lipidómicas utilizando el marcaje de isótopos estables. Esto nos permite entender los paneles de lípidos y muestras muy diversas, desde insectos hasta humanos. Actualmente existe un vacío en este campo con respecto a la estandarización de LC, TIMS, Top, MS/MS en investigaciones lipidómicas.A continuación, proporcionamos un método para el seguimiento de los restos de biomasa para este fin. En el futuro, nuestra investigación implicará la investigación de la epigenética y la metabolómica presentes en el proceso biológico utilizando el personal del equipo de LC, MS/MS, involucrando métodos DDA y DIA.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Este protocolo demostrará la extracción y el análisis de ácidos grasos bioactivos libres y esterificados de las células. Los ácidos grasos se cuantifican con precisión mediante dilución de isótopos estables, cromatografía líquida quiral, captura de electrones, ionización química atmosférica, espectrometría de masas de monitoreo de reacciones múltiples (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

El ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) ha sido reportado anteriormente como una matriz de MALDI para obtener imágenes de tejido de pequeñas moléculas; protocolos para el uso de DT para la formación de imágenes de MALDI de los lípidos endógenos en la superficie de secciones de tejido por-ion positivo MALDI-MS en un instrumento cuadrupolar-FTICR ultra alta resolución se proporcionan aquí.

El ditranol como una matriz para láser asistida por matriz de desorción / ionización de imágenes en una transformada de Fourier de iones de resonancia de ciclotrón Espectrómetro de Masas

Tegumento de los mamíferos contiene lípidos extraíbles con disolventes que pueden proporcionar composiciones química característica de las especies individuales. Este trabajo presenta un método de rutina para separar grandes clases de lípidos aislados de tejidos tegumentarios utilizando cromatografía en capa fina y la determinación del perfil triacilglicérido por láser de desorción / ionización por espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistida por matriz.

Perfiles de los Contenidos triacilglicérido en Bat Tegumentario lípidos por cromatografía preparativa en capa fina y MALDI-TOF espectrometría de masas

Este protocolo describe un procedimiento experimental cuantitativa y comprensivo investigar el metabolismo de múltiples fuentes de nutrientes. Este flujo de trabajo, basado en una combinación de experimentos de trazador isotópico y de un procedimiento analítico permite el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de moléculas sintetizado por microorganismos a determinar.

Flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes

El enfoque del marcador trófica ácidos grasos, es decir, la asimilación de ácidos grasos como toda molécula y transferencia en tejido consumidor leves o no modificación, se ve obstaculizada por las brechas de conocimiento en el metabolismo de ácidos grasos de invertebrados de suelo pequeño. Isotopologue perfilado se presenta como una valiosa herramienta para desentrañar las interacciones tróficas.

Perfiles de ácidos grasos 13C Isotopologue proporciona una idea de la transferencia trófica de carbono y metabolismo de los lípidos de los consumidores invertebrados

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar y calificar cada especie de esfingomielina mediante monitoreo de reacción múltiple y modo MS/MS/MS, respectivamente.

Método cuantitativo y cualitativo de la esfingomielina por LC-MS con dos estable isotópicamente etiquetada especies de esfingomielina

Este protocolo describe un rendimiento único para técnicas complementarias analíticas y ómicas que culmina en una caracterización totalmente emparejado de materia orgánica natural y proteómica microbiana en diferentes ecosistemas. Este enfoque permite comparaciones robustas para la identificación de rutas metabólicas y transformaciones importantes para describir la producción de gas de efecto invernadero y predecir las respuestas al cambio ambiental.

Técnicas analíticas de alta resolución complementarias solo rendimiento para caracterizar mezclas complejas de materia orgánica Natural

Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

La microscopia estimulada de la dispersión de Raman (SRS) permite la proyección de imagen selectiva, etiqueta-libre de mitades químicas específicas y se ha empleado con eficacia para las moléculas del lípido de la imagen in vivo. Aquí, proporcionamos una breve introducción al principio de la microscopía SRS y describimos métodos para su uso en el almacenamiento de lípidos por imágenes en Caenorhabditis elegans.

Imágenes Libres De Etiquetas De La Dinámica De Almacenamiento De Lípidos En Caenorhabditis elegans Usando Microscopía De Dispersión Raman Estimulada

Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido 14C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.

Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

La lipidómica basada en espectrometría de masas de escopeta ofrece una instantánea cuantitativa sensible de un amplio espectro de clases de lípidos simultáneamente en una sola medición de varios tejidos de roedores.

Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

Aprende a cuantificar lípidos mediante marcaje con isótopos estables y LC-TIMS-TOF MS/MS en muestras diversas. Este método mejora el análisis lipidómico y establece bases para estudios de epigenética y metabolómica.

Trazabilidad de lípidos de novo mediante el marcaje de isótopos estables LC-TIMS-TOF MS/MS

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