Name: Producción y optimización de LTE, un sistema de expresión de proteínas libres de células derivadas de Leishmania tarentolae para la producción de proteínas recombinantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:10:00.000+00:00
Duration: 3 min 59 s
Description: Aprende a producir proteínas recombinantes con el sistema LTE libre de células derivado de Leishmania tarentolae. Este método liofilizado estable a temperatura ambiente facilita el transporte y optimiza la expresión de proteínas eucariotas complejas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo optimizado para la producción de extracto traslacional de Leishmania (LTE)

<ol><li>Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+cell-free+protein+synthesis+in+E.coli+upon+naturally+occurring+or+synthetic+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The dependence of cell-free protein synthesis in E.coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 47 (10), 1588-1602 (1961).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metab Eng. 38, 370-381 (2016).</li>
<li>Ezure, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+system+prepared+from+insect+cells+by+freeze-thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis system prepared from insect cells by freeze-thawing.</a> Biotechnol Prog. 22 (6), 1570-1577 (2006).</li>
<li>Harbers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+germ+systems+for+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Wheat germ systems for cell-free protein expression.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2762-2773 (2014).</li>
<li>Kobs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+the+cell-free+protein+expression+system+that+meets+your+experimental+goals%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Corporation%22%5BJournal%5D)">Selecting the cell-free protein expression system that meets your experimental goals.</a> Promega Corporation. 21, 6-9 (2008).</li>
<li>Kovtun, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+cell-free+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Leishmania cell-free protein expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li>
<li>Basile, G., Peticca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Leishmania+tarentolae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Leishmania tarentolae.</a> Mol Biotechnol. 43 (3), 273-278 (2009).</li>
<li>Mureev, S., Kovtun, O., Nguyen, U. T., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-independent+translational+leaders+facilitate+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Species-independent translational leaders facilitate cell-free expression.</a> Nat Biotechnol. 27 (8), 747-752 (2009).</li>
<li>Gambin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+reveals+the+oligomerization+and+folding+steps+driving+the+prion-like+behavior+of+ASC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence reveals the oligomerization and folding steps driving the prion-like behavior of ASC.</a> J Mol Biol. 430 (4), 491-508 (2018).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mapping+of+interactions+between+human+SNX-BAR+proteins+measured+in+vitro+by+AlphaScreen+and+single-molecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid mapping of interactions between human SNX-BAR proteins measured in vitro by AlphaScreen and single-molecule spectroscopy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2233-2245 (2014).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomolar+oligomerization+and+selective+co-aggregation+of+alpha-synuclein+pathogenic+mutants+revealed+by+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nanomolar oligomerization and selective co-aggregation of alpha-synuclein pathogenic mutants revealed by single-molecule fluorescence.</a> Sci Rep. 6, 37630(2016).</li>
<li>Leitao, A., Bhumkar, A., Hunter, D. J. B., Gambin, Y., Sierecki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+a+selective+mechanism+for+the+inhibition+of+alpha-synuclein+aggregation+by+beta-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Unveiling a selective mechanism for the inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein.</a> Int J Mol Sci. 19 (2), 334(2018).</li>
<li>Gambin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+self+assembly+and+nanoscale+segregation+of+two+distinct+cavin+subcomplexes+on+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals self assembly and nanoscale segregation of two distinct cavin subcomplexes on caveolae.</a> Elife. 3, e01434(2013).</li>
<li>Ve, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+TIR-domain-assembly+formation+in+MAL-+and+MyD88-dependent+TLR4+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis of TIR-domain-assembly formation in MAL- and MyD88-dependent TLR4 signaling.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 743-751 (2017).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organisation+of+in+vitro+reconstituted+HOPS+and+CORVET+multisubunit+membrane+tethering+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Subunit organisation of in vitro reconstituted HOPS and CORVET multisubunit membrane tethering complexes.</a> PLoS One. 8 (12), e81534(2013).</li>
<li>Ruehrer, S., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+Leishmania+tarentolae+cell-free+extracts+for+the+synthesis+of+human+solute+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploiting Leishmania tarentolae cell-free extracts for the synthesis of human solute carriers.</a> Mol Membr Biol. 30 (4), 288-302 (2013).</li>
<li>Varasteh Moradi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Interactions+among+cell-free+expressed+Zika+virus+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping Interactions among cell-free expressed Zika virus proteins.</a> J Proteome Res. 19 (4), 1522-1532 (2020).</li>
<li>Gagoski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+pipeline+for+discovery+of+thermotolerant+xylanases+and+endo-1%2C4-beta-glucanases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free pipeline for discovery of thermotolerant xylanases and endo-1,4-beta-glucanases.</a> J Biotechnol. 259, 191-198 (2017).</li>
<li>Ergun Ayva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+performance+parameters+of+artificial+allosteric+protein+switches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring performance parameters of artificial allosteric protein switches.</a> J Mol Biol. 434 (17), 167678(2022).</li>
<li>Lau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+biosensor+for+real-time+interaction+dynamics+of+host+proteins+with+HIV-1+capsid+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Fluorescence biosensor for real-time interaction dynamics of host proteins with HIV-1 capsid tubes.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 11 (38), 34586-34594 (2019).</li>
<li>Ryan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antiinflammatory+biologics+shaped+by+parasite-host+coevolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Novel antiinflammatory biologics shaped by parasite-host coevolution.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119 (36), e2202795119(2022).</li>
<li>McMahon, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intracellular+cavin+target+proteins+reveals+cavin-PP1alpha+interactions+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of intracellular cavin target proteins reveals cavin-PP1alpha interactions regulate apoptosis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3279(2019).</li>
<li>Sierecki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+approach+to+accelerate+the+study+of+protein-protein+interactions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">A cell-free approach to accelerate the study of protein-protein interactions in vitro.</a> Interface Focus. 3 (5), 20230018(2013).</li>
<li>Johnston, W. A., Moradi, S. V., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaption+of+the+Leishmania+cell-free+expression+system+to+high-throughput+analysis+of+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaption of the Leishmania cell-free expression system to high-throughput analysis of protein interactions.</a> Methods Mol Biol. 2025, 403-421 (2019).</li>
<li>Jung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+and+interactome+analysis+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation and interactome analysis of caveolae.</a> J Cell Biol. 217 (6), 2141-2165 (2018).</li>
<li>Fontaine, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+domain+analysis+of+SOX18+transcription+factor+using+a+single-chain+variable+fragment-based+approach%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Functional domain analysis of SOX18 transcription factor using a single-chain variable fragment-based approach.</a> MAbs. 10 (4), 596-606 (2018).</li>
<li>Overman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+the+transcription+factor+SOX18+delays+breast+cancer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of the transcription factor SOX18 delays breast cancer in mice.</a> Elife. 6, e21221(2017).</li>
<li>Kubala, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+farnesyltransferase+alpha+subunit+regulates+vacuolar+protein+sorting-associated+protein+4A+%28Vps4A%29--dependent+intracellular+trafficking+through+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mammalian farnesyltransferase alpha subunit regulates vacuolar protein sorting-associated protein 4A (Vps4A)--dependent intracellular trafficking through recycling endosomes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 580-586 (2015).</li>
<li>Han, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+scaffolds+Arp2%2F3+and+WAVE2+at+the+epithelial+zonula+adherens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cortactin scaffolds Arp2/3 and WAVE2 at the epithelial zonula adherens.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7764-7775 (2014).</li>
<li>Das Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+IIa+histone+deacetylases+drive+toll-like+receptor-inducible+glycolysis+and+macrophage+inflammatory+responses+via+pyruvate+kinase+M2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Class IIa histone deacetylases drive toll-like receptor-inducible glycolysis and macrophage inflammatory responses via pyruvate kinase M2.</a> Cell Rep. 30 (8), 2712-2728.e8 (2020).</li>
<li>Leitão, A. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+protein+interactions+along+the+aggregation+pathway+of+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Selectivity of protein interactions along the aggregation pathway of α-synuclein.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Gagoski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+benchmarking+of+four+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems.</a> Biotechnol Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).</li>
<li>Johnston, W. A., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+eukaryotic+cell-free+lysate+from+Leishmania+tarentolae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of eukaryotic cell-free lysate from Leishmania tarentolae.</a> Methods Mol Biol. 1118, 1-15 (2014).</li>
<li>Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+instabilities+explain+batch-to-batch+variability+in+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems.</a> Biotechnol Bioeng. 115 (8), 1904-1914 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PD-10 SuperDex 25 columnas</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td>Columnas de filtración de gel</td></tr><tr><td>Disruptor celular de cavitación de nitrógeno Disruptor celular</td> Parr <td>Industries</td><td>4635 o 4639</td><td>Disruptor celular</td></tr><tr><td>derivado de bovinos Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5533</td><td>Aditivo de cultivo</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 10000U/ml</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>Mezcla</td></tr> <tr><td>de antibióticosOptiplate 384</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007290</td><td>Placa multipocillo para expresiones de 10ul</td></tr><tr><td>Síntesis</td><td></td><td></td> de oligonucleótidos <td>IDT&nbsp; Oligo con secuencia CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT</td></tr><tr><td>Creatina Fosfoquinasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-15-4</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>Tecan</td> Spark <td>Tecan</td><td></td><td>o similar Lector de placas multimodo</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Imager</td><td>Biorad</td><td></td><td>o similar SDS-PAGE gel Imager</td></tr><tr><td>4-12% Bis-Tris Geles</td><td>Invitrogen</td><td>NW04125</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Biofotómetro</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>o similar Cuvette Specrofotómetro</td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>Espectrofotómetro Nanodrop</td></tr><tr><td>Avanti Centrífuga JXN-26 Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>o similar, con rotores/tubos de 10K y 50K g</td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5424R Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>o similar, con tubos de microcentrífuga de</td></tr> <tr><td>1,5 mlIncubadora de matraces Inova S44i</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>o similar Agitador de incubadora de matraces adecuado para matraces de 5L Matraces</td></tr> de <tr><td>cultivo de vidrio</td><td></td><td></td> de 5L <td>Matraces de vidrio deflectores para el crecimiento del cultivo</td></tr><tr><td>Bactotriptona</td><td>BD</td><td>211705</td><td>Medio</td></tr><tr><td>de crecimiento Extracto de levadura</td><td>Merck</td><td>VM930053</td><td>Medio</td></tr><tr><td>de crecimiento Glicerol</td><td></td><td></td><td>Cualquier grado analítico</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td></td><td></td><td>Cualquier grado analítico</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>Cualquier grado analítico</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td></td><td></td><td>Cualquier grado analítico</td></tr><tr><td>UltraPure</td><td>water Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>O salida de cualquier dispensador de agua tipo MilliQ</td></tr></tbody></table>

producción y optimización de lte, un sistema de expresión de proteínas libres de células derivadas de leishmania tarentolae para la producción de proteínas recombinantes

Production and Optimization of LTE, a Leishmania tarentolae Derived Cell-Free Protein Expression System for Recombinant Protein Production

El propósito de la expresión de proteínas libres de células es producir proteínas de longitud completa en una forma activa plegada adecuada para una amplia gama de aplicaciones. El LTE (extracto de Leishmania tarentoleae ) se ha comparado previamente con otros sistemas de expresión libre de células procariotas y eucariotas, demostrando una alta capacidad para evitar el truncamiento y la agregación cuando funciona de manera óptima, particularmente en comparación con la expresión libre de células basada en E. coli 33. Sin embargo, esto iba acompañado anteriormente de una variación significativa de la calidad de la producción de un lote a otro. El método actual incorpora mejoras adicionales para garantizar una calidad de salida constante, principalmente a través de la suplementación parcial de la solución de alimentación necesaria antes de la congelación inicial del LTE en alícuotas. A continuación, se optimiza el rNTP.Mg de entrada transcripcional en una solución de recarga que puede añadirse a cada reacción posterior o utilizarse para completar directamente las alícuotas congeladas. Cabe destacar que las reacciones de optimización también representan el uso típico de LTE para expresar proteínas de manera práctica, con reacciones realizadas a 25 °C durante 2 h.
Los datos de la optimización de la concentración de rNTP.Mg en reacciones libres de células proporcionan un conjunto de datos representativo. Los niveles de expresión suelen aumentar a medida que aumenta la entrada transcripcional (rNTP.Mg), lo que indica una expresión exitosa. Sin embargo, se alcanza un umbral en el que el sistema tiende a la expresión no productiva de productos truncados, particularmente en el caso de proteínas más grandes (&gt;50 kDa). Esta expresión subóptima conduce a una pérdida de la señal de fluorescencia con el aumento de la rNTP.Mg, particularmente evidente con las fusiones de fluoróforos C-terminales, donde la traducción del polipéptido no llega al fluoróforo en sí. En el caso de las fusiones N-terminales, si bien no se produce necesariamente una reducción en las RFU (unidades de fluorescencia relativa) generales con un exceso de rNTP.Mg, la expresión fallida es visiblemente evidente en los geles SDS-PAGE como múltiples productos fluorescentes de tamaños decrecientes. Este enfoque aprovecha la capacidad de GFP (proteína fluorescente verde) para mantener la fluorescencia incluso cuando se visualiza en un gel SDS-PAGE convencional, siempre que las muestras no se calienten después de la mezcla. En su lugar, se mezclan con el tampón de carga de gel y se cargan directamente sobre el gel. Si bien los materiales y equipos de gel SDS-PAGE son generalmente intercambiables, el generador de imágenes en gel debe ser capaz de visualizar la fluorescencia de GFP. Una configuración típica para la visualización de GFP se proporciona con excitación a 485 nm (ancho de banda de 5 nm), emisión a 516 nm (ancho de banda de 5 nm) y un intervalo de lectura de 1 minuto durante 2 h.
Es posible optimizar el sistema utilizando solo la expresión de eGFP. La Figura 2A,B (recuadro) muestra los resultados de expresión típicos de las reacciones de optimización para dos lotes LTE, con RFU eGFP aumentando con el aumento de las concentraciones de rNTP.Mg, alcanzando un nivel óptimo de +0,6 veces rNTP.Mg (Figura 2A) y +0,3 veces rNTP.Mg (Figura 2B) para la RFU máxima. La solución de alimentación rNTP reducida incluye 0,6 veces rNTP.Mg, lo que da como resultado niveles de rNTP.Mg totales de 1,2 veces y 0,9 veces la cantidad predeterminada para estos lotes LTE. La Figura 2C ilustra la cinética del aumento de RFU durante la reacción para el lote LTE en la Figura 2B, demostrando una reacción bifásica con dos fases discretas a lo largo de la duración de la reacción.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig02.jpg"> Figura 2: Optimización de rNTP.Mg adición de recarga en LTE con rNTP 5x FS. (A) Niveles de expresión de eGFP después de 140 min de expresión de un plásmido de control a niveles de recarga de rNTP.Mg variables en la reacción de expresión libre de células (n = 3, media ± SD graficada). (B) Optimización de un lote de producción LTE diferente, que muestra una expresión reducida más allá de un cierto umbral de rNTP.Mg. (C) Cinética de acumulación de eGFP en las mismas reacciones que (B), con aumento de rNTP.Mg recarga. Estos datos también representan la cinética típica de la acumulación de proteínas en la expresión de lotes LTE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Sin embargo, hay que tener en cuenta que la eGFP, al ser una proteína pequeña (27 kDa) fácil de plegar, es probable que se exprese, pliegue y madure independientemente del sistema de expresión libre de células utilizado. El fallo del sistema es más probable cuando se expresan proteínas de interés más grandes, con productos truncados que se hacen más evidentes a tamaños de proteína de entrada superiores a 70 kDa33. Por lo tanto, es superior optimizar el sistema con la(s) proteína(s) destinada(s) al uso real, con eGFP aún presente para la cuantificación, pero como una fusión N-terminal con la proteína de interés.
La Figura 3 representa una optimización típica del nivel de recarga de rNTP.Mg cuando se utiliza una plantilla de proteína más grande propensa a entregar productos truncados (eGFP-Sox18). Utilizando un formato SDS-PAGE de gel seminativo (es decir, sin muestras de calentamiento), es posible visualizar el fallo progresivo de la expresión. La adición óptima de rNTP.Mg a +0,1x (combinada con el rNTP.Mg de 0,6x en la solución de alimentación parcial, que totaliza 0,7x) reduce claramente la fracción de la banda de proteínas de longitud completa como parte de los productos de expresión fluorescente total, lo que significa una falla del sistema con un exceso de adición de rNTP.Mg.
Como se menciona en el protocolo, es posible omitir el paso de optimización del rNTP.Mg y agregar directamente la cantidad total de rNTP.Mg en la solución de alimentación "predeterminada" durante la suplementación inmediatamente después de la filtración en gel en el paso 6.2. Al hacer esto, el protocolo esencialmente vuelve a los métodos originales publicados para crear LTE34. Sin embargo, los autores creen que adaptar el sistema para un rendimiento óptimo, como se demuestra en la Figura 3 (Carril D a Carril E), supera la complejidad adicional del protocolo y aumenta el valor de LTE como herramienta de expresión de proteínas.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65592/65592fig03.jpg"> Figura 3: Efecto del aumento de la recarga de rNTP.Mg en la expresión de eGFP-Sox18 en LTE parcialmente suplementado. Gel SDS-PAGE seminativo que representa el impacto del aumento de la recarga de rNTP.Mg en la expresión de eGFP-Sox18. Carril A: +0,1x (rNTP.Mg) de recarga, Carril B: +0,2x (rNTP.Mg), Carril C: +0,3x (rNTP.Mg), Carril D: +0,4x (rNTP.Mg). La fusión de eGFP N-terminal se visualiza mediante el escaneo de fluorescencia del gel. La banda principal en el carril A representa eGFP-Sox18 de longitud completa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65592/65592fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Componente</td>
			<td rowspan="2">Concentración de existencias</td>
			<td>5x Solución de alimentación</td>
			<td>μL de stock/mL 5x Solución de alimentación</td>
		</tr><tr><td>Predeterminado (rNTP reducido)</td>
			<td>Predeterminado (rNTP reducido)</td>
		</tr><tr><td>Espermidina</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>TDT</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>Fosfato de creatina</td>
			<td>1000 mM</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>HEPES-KOH pH7.6</td>
			<td>2500 mM</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>40</td>
		</tr><tr><td>PEG3000</td>
			<td>0,5 V/V</td>
			<td>0,05 V/V</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td>
			<td>120 veces</td>
			<td>5 veces</td>
			<td>43</td>
		</tr><tr><td>Aminoácidos</td>
			<td>3,6 mM (c/u)</td>
			<td>0,68 mM (ea)</td>
			<td>190</td>
		</tr><tr><td>ATP</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>8,5 (5,1) mM</td>
			<td>85 (51)</td>
		</tr><tr><td>GTP</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>3,2 (1,9) mM</td>
			<td>32 (19)</td>
		</tr><tr><td>UTP</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>2,5 (1,5) mM</td>
			<td>25 (15)</td>
		</tr><tr><td>Hoja de acción del cliente</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>2,5 (1,5) mM</td>
			<td>25 (15)</td>
		</tr><tr><td>Mg(OAc)2</td>
			<td>1M</td>
			<td>16,7 (10) mM</td>
			<td>16.7 (10)</td>
		</tr><tr><td>Oligo líder anti-empalme</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>0.05 mM</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>ARN polimerasa T7</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>Creatina Fosfoquinasa</td>
			<td>5 unidades/μL</td>
			<td>0,2 unidades/μL</td>
			<td>42</td>
		</tr><tr><td>Agua ultrapura</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>19 (93)</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Composición de 5x Solución de Alimentación (5x FS) para LTE. Se requiere 1 mL de 5x FS por cada 2,5 mL de lisado no suplementado después de la filtración en gel. La complementación con el FS 5x predeterminado crea un LTE listo para la expresión para su uso en reacciones de expresión en una proporción de 7 μL/10 μL. La receta de rNTP.Mg reducida (cantidades en cursiva) se recomienda para la optimización de la expresión LTE y contiene 0,6 veces los niveles predeterminados de rNTP y magnesio. Estos se pueden ajustar a niveles variables (de 0,6 a 1,1 veces) en el experimento de optimización posterior utilizando las adiciones descritas en la Tabla 2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Recarga rNTP</td>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>MgOAc (1 M)</td>
			<td rowspan="2">Agua ultrapura</td>
		</tr><tr><td>(1 μL/10 μL rxn)</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
			<td>μL/200 μL</td>
		</tr><tr><td>+0x</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>+0,1 veces</td>
			<td>3.4</td>
			<td>1.3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.7</td>
			<td>193</td>
		</tr><tr><td>+0,2 veces</td>
			<td>6.8</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>1.3</td>
			<td>185</td>
		</tr><tr><td>+0,3 veces</td>
			<td>10.2</td>
			<td>3.8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>178</td>
		</tr><tr><td>+0,4 veces</td>
			<td>13.6</td>
			<td>5.1</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>2.7</td>
			<td>171</td>
		</tr><tr><td>+0,5 veces</td>
			<td>17</td>
			<td>6.4</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>3.3</td>
			<td>163</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Composición de (rNTP.Mg) soluciones de recarga para la optimización de LTE. Estas soluciones se utilizan para optimizar el LTE mediante la adición de 1 μL de solución de reposición por cada 10 μL de reacción de expresión de proteínas. Una vez que se determina un nivel de recarga en el experimento de optimización, se puede agregar de manera consistente a todas las reacciones de expresión de proteínas posteriores utilizando las mismas alícuotas de lote LTE. Alternativamente, se puede añadir directamente a las propias alícuotas a una adición de 1 μL por cada 7 μL (sin descongelar). Después de la descongelación y la mezcla, estos lisados se utilizan a 8 μL LTE por cada 10 μL de expresión de proteína, manteniendo el nivel de recarga rNTP.Mg establecido durante la optimización.

Producción y optimización de LTE, un sistema de expresión de proteínas libres de células derivadas de Leishmania tarentolae para la producción de proteínas recombinantes

This protocol outlines the production and optimization of a eukaryotic Cell-Free Protein Expression System (CFPS) derived from the unicellular flagellate ...

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Producción y optimización de LTE, un sistema de expresión de proteínas libres de células derivadas de Leishmania tarentolae para la producción de proteínas recombinantes

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