Un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para el aislamiento de núcleos individuales de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación de núcleos únicos
28 de julio de 2023
El estudio describe un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para aislar núcleos de alta calidad de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación posterior de ARN de núcleos individuales.
Esta investigación se centra en apoyar los estudios de descubrimiento de fármacos que utilizan la secuenciación de ARN de un solo núcleo para investigar la eficacia y la seguridad de posibles tratamientos. Por lo tanto, estamos desarrollando protocolos estandarizados de extracción de núcleos para muestras frescas de tejido congelado de varios órganos. Nuestro objetivo era automatizar y estandarizar la extracción de núcleos para lograr resultados consistentes y confiables mediante la reducción de la variabilidad no biológica.
La ventaja es la automatización parcial mediante el uso de un disociador robótico y el flujo de trabajo simple y corto que se puede aplicar en varias muestras de tejido de diferentes especies. Tener protocolos estandarizados puede ayudarnos a responder preguntas sobre la biodistribución de medicamentos, así como a explorar los mecanismos subyacentes a cualquier señal de seguridad que podamos observar. En el futuro, probaremos la aplicabilidad de nuestro protocolo para otras aplicaciones posteriores, como ATAC-seq o multiómica.
También trataremos de establecer protocolos para detectar transgenes virales expresados en núcleos individuales.
Descripción general
Este estudio presenta un protocolo estandarizado y parcialmente automatizado para la extracción de núcleos de alta calidad a partir de tejidos de mamíferos congelados, con el objetivo de mejorar la eficacia y fiabilidad del secuenciamiento de ARN a nivel de núcleo individual. El protocolo contribuye a optimizar los estudios de descubrimiento de fármacos al reducir la variabilidad no biológica.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Secuenciación de ARN de núcleos individuales
- Estudios de descubrimiento de fármacos
- Aislamiento de núcleos de alta calidad
Antecedentes
- Desarrollo de protocolos estandarizados para la extracción de núcleos
- Enfoque en muestras de tejido congelado fresco de diversos órganos
- Objetivo de abordar la biodistribución de fármacos y las señales de seguridad
Métodos Utilizados
- Extracción parcialmente automatizada de núcleos mediante un disociador robótico
- Tejidos de mamíferos de diversas especies
- Implementación de la purificación mediante gradiente de sacarosa
Resultados principales
- Núcleos de alta calidad obtenidos sin signos de restos celulares o agregación
- Resultados consistentes en diferentes tipos de tejido
- Baja variabilidad técnica y proporciones celulares similares entre muestras
Conclusiones
- El estudio automatiza y estandariza con éxito la extracción de núcleos.
- Este protocolo puede ayudar significativamente a responder preguntas biológicas en el descubrimiento de fármacos y evaluaciones de seguridad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento estandarizado de núcleos individuales a partir de tejidos congelados permite un perfilado transcriptómico robusto en el descubrimiento de fármacos, apoyando investigaciones tanto de eficacia como de seguridad. Al minimizar la variabilidad no biológica mediante una automatización parcial, este protocolo mejora la confianza predictiva en el secuenciamiento de ARN de núcleo individual posterior. Su adaptabilidad a diversos tipos de tejidos lo posiciona como una capacidad reutilizable para la desviación mecanicista y la validación de dianas en toda la cartera.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación del mecanismo de acción de fármacos y la expresión génica específica de tejidos en muestras difíciles de disociar o muestras archivadas.
- Reduce la variabilidad técnica, apoyando la validación funcional de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas.
- Facilita la generación de datos reproducibles para la selección de carteras basada en hipótesis.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara suspensiones de núcleos de alta calidad adecuadas para protocolos estandarizados de secuenciación de ARN de un solo núcleo.
- Apoya la reproducibilidad del ensayo y la consistencia de los resultados cuantitativos en múltiples tipos de tejidos y especies.
- Permite un procesamiento de muestras escalable y parcialmente automatizado para la evaluación confiable de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con el análisis de tejidos relevantes para la enfermedad en la búsqueda traslacional de biomarcadores al utilizar muestras congeladas o archivadas.
- Mantiene la continuidad desde el descubrimiento inicial hasta la validación preclínica al permitir estudios con múltiples tejidos y múltiples especies.
- Proporciona una base para futuras aplicaciones de multiómica y ATAC-seq, como se menciona en las perspectivas del protocolo.
Integración de la Secuencia y el Flujo de Trabajo
Este protocolo se integra en la interfaz entre el descubrimiento inicial y la investigación preclínica, permitiendo un análisis transcriptómico de alta fidelidad a partir de tejidos congelados para la identificación de compuestos prometedores y estudios mecanicistas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la transcriptómica de núcleo individual en diversos tejidos.
- Selección: Proporciona preparaciones cuantitativas y reproducibles de núcleos para ensayos de secuenciación posteriores.
- Análisis: Ofrece resultados estandarizados, como conteos de genes, conteos de UMI y contenido mitocondrial, para la comparación entre muestras.
- Investigación Traducional: Facilita el análisis de la biodistribución de fármacos y las señales de seguridad en tejidos relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo ampliamente adaptable para múltiples tipos de tejidos y especies, apoyando estudios a nivel de cartera.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios transcriptómicos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, la reproducibilidad y la automatización parcial de los protocolos de aislamiento de núcleos.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al reducir la variabilidad técnica.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos a fármacos basados en datos moleculares robustos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejidos, aislamiento de núcleos y protocolos de secuenciación posteriores.
- Necesita acceso a un disociador robótico, un contador celular fluorescente automatizado y una infraestructura estándar de biología molecular.
- Exige una estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad entre estudios y sitios.
- Adaptable a diversos tejidos de mamíferos con mínima optimización, tal como se ha demostrado en múltiples especies.
- Las limitaciones potenciales incluyen la necesidad de ajustes en el protocolo para tejidos no estándar o aplicaciones futuras de multiómica.
