Name: Bioimpresión 3D de hidrogeles fotoajustables para estudiar la activación de fibroblastos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprende a bioimpresión 3D de hidrogeles fotoajustables para estudiar la activación de fibroblastos en modelos de tejido pulmonar. Este método permite controlar la rigidez de la matriz extracelular y comprender mejor las enfermedades pulmonares crónicas.

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Los autores desean agradecer al Dr. Adam Feinberg (Universidad Carnegie Mellon) y a quienes organizaron el Taller de código abierto de bioimpresión 3D. Estas personas permitieron aprender las técnicas de bioimpresión FRESH y construir la bioimpresora 3D utilizada para estos estudios. Además, los autores desean agradecer Biorender.com, que se utilizó para producir las figuras de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por múltiples grupos o fuentes de financiamiento, incluida la Fundación Comunitaria Rose (DDH y CMM), un Premio de Investigación de Enfermedades Vasculares Pulmonares de Colorado (DDH y CMM), la Fundación Nacional de Ciencias bajo el Premio 1941401 (CMM), el Departamento del Ejército bajo el Premio W81XWH-20-1-0037 (CMM), el Instituto Nacional del Cáncer de los NIH bajo el Premio R21 CA252172 (CMM), el Centro de la Familia Ludeman para la Investigación de la Salud de la Mujer en el Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado (DDH y CMM), el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo los premios R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) y T32 HL072738 (DDH y AT).

Hidrogeles bioimpresos fotoajustables para sondear las respuestas celulares al endurecimiento de la MEC

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<li>Grigoryan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivascular+networks+and+functional+intravascular+topologies+within+biocompatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels.</a> Science. 364 (6439), 458-464 (2019).</li>
<li>Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tumor+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tumor models for cancer research.</a> ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).</li>
<li>Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-bioprinted%2C+phototunable+hydrogel+models+for+studying+adventitial+fibroblast+activation+in+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension.</a> Biofabrication. 15 (1), (2022).</li>
<li>Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRESH+3D+bioprinting+of+a+full-size+model+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).</li>
<li>Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+FRESH+3D+printing+as+a+platform+for+advanced+tissue+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication.</a> APL Bioengineering. 5 (1), 010904(2021).</li>
<li>Petrou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+decellularized+extracellular+matrix+as+a+new+tool+for+building+hybrid+hydrogels+to+model+chronic+fibrotic+diseases+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro.</a> Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).</li>
<li>Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+human+decellularized+extracellular+matrix+for+incorporation+into+phototunable+hybrid+hydrogel+models+of+tissue+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).</li>
<li>Saleh, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+hydrogels+comprised+healthy+or+diseased+decellularized+extracellular+matrix+to+study+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).</li>
<li>Guvendiren, M., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening+hydrogels+to+probe+short-+and+long-term+cellular+responses+to+dynamic+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics.</a> Nature Communications. 3, 792(2012).</li>
<li>Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+reversible+mechanics+to+probe+dynamic+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).</li>
<li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fibrosis%3A+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).</li>
<li>Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+within+the+vascular+wall+in+pulmonary+arterial+hypertension%3A+more+than+a+spectator%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator.</a> Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).</li>
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<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li>
<li>Habiel, D. M., Hogaboam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+fibroblast+proliferation+and+survival+in+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 2(2014).</li>
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<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+fibroblasts+with+a+proinflammatory+epigenetically+altered+phenotype+in+severe+hypoxic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension.</a> The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform-reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), e1500758(2015).</li>
<li>Brown, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+photocrosslinking+of+click+hydrogels+to+probe+myoblast+mechanotransduction+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).</li>
<li>Ondeck, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamically+stiffened+matrix+promotes+malignant+transformation+of+mammary+epithelial+cells+via+collective+mechanical+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).</li>
<li>Caliari, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening+hydrogels+for+investigating+the+dynamics+of+hepatic+stellate+cell+mechanotransduction+during+myofibroblast+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation.</a> Scientific Reports. 6, 21387(2016).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+amplification+of+fibrosis+through+matrix+stiffening+and+COX-2+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression.</a> Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).</li>
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<li>Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension.</a> European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).</li>
<li>Caracena, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+cells+and+microenvironmental+stiffness+synergistically+drive+fibroblast+activation+in+three-dimensional+hydrogel+lung+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models.</a> Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).</li>
<li>Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+analysis+of+cellular+response+to+ultraviolet+light+for+biomaterial+synthesis+and+modification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).</li>
<li>Kruse, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+pH+on+cell+viability%2C+cell+migration%2C+cell+proliferation%2C+wound+closure%2C+and+wound+reepithelialization%3A+In+vitro+and+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study.</a> Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).</li>
<li>Filippi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusable+biohybrid+designs+for+bioprinted+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue.</a> Advanced Healthcare Materials. , e1500758(2023).</li>
<li>Matthiesen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+3D+culture+and+bioprinting+using+peptide-functionalized+hyaluronan+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871(2023).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+a+skin+patch+with+dual-crosslinked+gelatin+%28GelMA%29+and+silk+fibroin+%28SilMA%29%3A+An+approach+to+accelerating+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing.</a> Materials Today Bio. 18, 100550(2023).</li>
<li>Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-bioprinted+human+tissue+and+the+path+toward+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation.</a> Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047(2022).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar. Partes de este manuscrito se reproducen con permiso de © IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf. 5 Todos los derechos reservados.

Las reacciones de polimerización de doble etapa en respuesta a la exposición controlada a la luz pueden endurecer los biomateriales con control espacial y temporal. Varios estudios han aprovechado esta técnica para evaluar las interacciones célula-matriz en diversas plataformas 5,8,9,10,11,21,22,23.<sup class="xref...

La bioimpresión 3D es una tecnología transformadora que permite a los investigadores depositar con precisión células y biomateriales dentro de volúmenes 3D y recrear la compleja estructura jerárquica de los tejidos biológicos. Durante la última década, los avances en la bioimpresión 3D han creado tejidos cardíacos humanos1, modelos funcionales de tejidos renales2, modelos de intercambio de gases dentro del pulmón3 y modelos tumorales para la investigación del cáncer4. La invención de las técnicas de bioimpresión 3D integradas, como la bioimpresión de forma libre y reversible de hidrogel suspendido (FRESH), ha hecho posible reproducir estructuras complejas de tejidos blandos como los vasos sanguíneos pulmonares5 e incluso el corazón humano6 en 3D. La bioimpresión 3D FRESH facilita la impresión capa por capa de biotintas blandas y de baja viscosidad a través de la extrusión en un baño de soporte de adelgazamiento por cizallamiento. El baño de soporte consiste en un material, como micropartículas de gelatina compactas, que actúa como un plástico Bingham y mantiene la forma y estructura previstas de la biotinta después de la impresión. Una vez que la construcción impresa se ha solidificado, el baño de soporte se puede disolver aumentando la temperatura a 37 °C7.
Un reciente artículo de revisión resumió los materiales que han sido bioimpresos en 3D en diversas publicaciones utilizando la técnica FRESH. Estos materiales de origen natural van desde el colágeno tipo I hasta el ácido hialurónico metacrilato y representan varios mecanismos de gelificación diferentes7. La mayoría de los estudios de investigación realizados con esta técnica de bioimpresión 3D emplean biomateriales estáticos que no cambian en respuesta a estímulos externos. Los biomateriales dinámicos de hidrogel fotosintonizable han sido utilizados por nuestro laboratorio y otros 8,9,10,11,12 para modelar una variedad de enfermedades fibróticas. A diferencia de los biomateriales estáticos, las biotintas fotosintonizables permiten crear un modelo suavizado con un valor de módulo elástico más bajo y luego endurecerlo para explorar las respuestas celulares a los aumentos en el endurecimiento microambiental.
Las enfermedades fibróticas se caracterizan por un aumento en la producción de la matriz extracelular que puede causar cicatrices y endurecimiento13. El endurecimiento del tejido puede iniciar más lesiones y destrucción del tejido impactado, causando daño permanente a los órganos e incluso la muerte; Los trastornos fibróticos son responsables de un tercio de la mortalidad en todo el mundo. Los fibroblastos producen exceso y aberración de matriz extracelular en este estado de enfermedad14,15. El aumento de la proliferación de fibroblastos y el depósito de matriz extracelular endurecen aún más el tejido y activan un bucle de retroalimentación positiva profibrótica16,17,18,19. El estudio de la activación de los fibroblastos es vital para comprender las enfermedades fibróticas. Aquí presentamos la hipertensión arterial pulmonar humana (HAP) como ejemplo de un trastorno fibrótico en el que es importante imitar la geometría 3D del vaso sanguíneo mediante bioimpresión 3D e introducir las capacidades de refuerzo dinámico de los hidrogeles fotosintonizables. La HAP es una afección en la que la presión en las arterias pulmonares principales supera los niveles normales y ejerce presión sobre el corazón, lo que aumenta la activación de los fibroblastos adventiciales de la arteria pulmonar humana (HPAAF) y endurece los tejidos de los vasos sanguíneos16,17,18,19. Una formulación de biotinta de poli(etilenglicol)-alfa metacrilato (PEGαMA) fotoajustable permite la rigidez temporal en las construcciones y ayuda a modelar tanto el tejido sano como la progresión de la enfermedad 5,8,9,10. La explotación de esta característica única permite cuantificar la activación y proliferación de HPAAF en respuesta al endurecimiento microambiental en 3D y puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos celulares implicados en esta enfermedad. El protocolo descrito aquí permitirá a los investigadores crear modelos 3D que recapitulen los cambios en el microambiente extracelular durante la progresión de la enfermedad o la reparación de tejidos y estudien la activación de fibroblastos.

<table><tbody><tr><td>Kit de radiómetro/fotómetro AccuMax</td><td>Spectronics Corporation</td><td>XPR-3000</td><td>Para medir la intensidad de la luz, utilizado para fotoendurecer</td></tr><tr><td>el ácido acético&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401-500</td><td>Utilizado durante la síntesis de PEGaMA</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A184</td><td>Utilizado con las criosecciones</td></tr><tr><td>ActinGreen 488 ReadyProbes</td><td>Fisher Scientific</td><td>R37110</td><td>Utilizado para teñir</td></tr><tr><td>papel de aluminio</td><td>Reynolds</td><td>F28028</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano anhidro (THF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757-1L</td><td>Usado durante la síntesis de PEGaMA</td></tr><tr><td>Argón Gas comprimido</td><td></td><td>Airgas AR R300</td><td>Utilizado durante la síntesis de PEGaMA</td></tr> 8 <tr><td>Brazo Poli(etilenglicol)-hidroxilo (PEG-OH)</td><td>Tecnología JenKem</td><td>8ARM-PEG-10K</td><td>Utilizado durante la síntesis de PEGaMA</td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de 365 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>65-191</td><td>Utilizado para fotoendurecimiento</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700-100</td><td>Utilizado durante el proceso de tinción</td></tr><tr><td>Buchner Funnel</td><td>Quark Glass</td><td>QFN-8-14</td><td>Utilizado durante la síntesis de PEGaMA</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>65-0853-39</td><td>Utilizado durante el proceso de tinción</td></tr><tr><td>Celite 545 (coadyuvante de filtración)</td><td>EMD Millipore</td><td>CX0574-1</td><td>Utilizado durante la síntesis de PEGaMA</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio cargados</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo-d</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151823-10X0.75ML</td><td>Se utiliza para caracterizar PEGaMA</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10637</td><td>Se utiliza para la tinción</td></tr><tr><td>de tubos cónicos de 50 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>667050B</td><td></td></tr><tr><td>Kit de seguridad criogénica</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-25000-85</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850-3-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálisis</td><td>Repligen</td><td>132105</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phylindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>Utilizado para la tinción</td></tr><tr><td>de éter dietílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>E1384</td><td>Utilizado durante la síntesis de PEGaMA</td></tr><tr><td>1,4-Ditiotritol (DTT)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>componente de Bioink</td></tr><tr><td>, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Cytiva</td><td>SH30271. Papel de filtro FS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Utilizado durante la síntesis de PEGaMA</td></tr><tr><td>Freezone 2.5L Sistema de liofilización</td><td>Labconco</td><td>LA-2.5LR</td><td>Liofilizador</td></tr><tr><td>Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td>N/A</td><td>Descarga de software</td></tr><tr><td>Jeringa hermética al gas de 2,5 mL</td><td>Hamilton</td><td>81420</td><td>Utilizado para bioimpresión</td></tr><tr><td>Calibre 15 1.5" Punta de la serie IT Jensen</td><td>Global</td><td>JG15-1.5X</td><td>Se utiliza para la bioimpresión</td></tr><tr><td>Calibre 30 0.5" HP Series Tip</td><td>Jensen Global</td><td>JG30-0.5HPX</td><td>Se utiliza para la bioimpresión</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón Alexa Fluor 555 Anticuerpo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>Utilizado para la tinción</td></tr><tr><td>de glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>C2H5NO2</td><td>Utilizado durante el proceso de tinción</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>1461</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Utilizado durante el proceso de tinción</td></tr><tr><td>Fibroblastos adventiciales de la arteria pulmonar humana (HPAAF)</td><td>AcceGen</td><td>ABC-TC3773&nbsp;</td><td>De un paciente masculino de 2 años</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Se utiliza para ajustar el pH de las soluciones</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud (NIH)</td><td>N/A</td><td>Descarga gratuita del software</td></tr><tr><td>ImmEdge&reg; Pluma</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Utilizado durante el proceso de tinción</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>VWR</td><td>VWR51014991</td><td></td></tr><tr><td>LifeSupport Gelatina Suspensión de micropartículas (Suspensión de gelatina)</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5244-10GM</td><td>Utilizado para la bioimpresión</td></tr><tr><td>Microscopio</td> óptico <td>Olympus</td><td>CKX53</td><td>Microscopio óptico invertido</td></tr><tr><td>Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato ( LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889-5G</td><td>Fotoiniciador utilizado para fotoendurecimiento</td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LulzBot Mini 2&nbsp;</td><td>LulzBot</td><td>N/A</td><td>Bioprinter adaptado</td></tr><tr><td>Metacriloxietilo Tiocarbamoil Rodamina B&nbsp;</td><td>Policiencias, Inc.</td><td>669775-30-8</td><td></td></tr><tr><td>2-Metilbutano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631-4L</td><td></td></tr><tr><td>Microman Pistones Capilares CP1000</td><td>VWR</td><td>76178-166</td><td>Puntas de pipeta de desplazamiento positivo</td></tr><tr><td>MMP2 Reticulante degradable (KCGGPQGIWGQGCK)</td><td>GL Biochem</td><td>N/A Componente</td> de <td>biotinta</td></tr><tr><td>Anti-Ratón Anti-humano &alpha;SMA Anticuerpo monoclonal</td><td>Fisher Scientific</td><td>MA5-11547</td><td>Se utiliza para teñir</td></tr><tr><td>Serie OmniCure 2000</td><td>&nbsp; Fuente</td> de luz UV Lumen <td>Dynamics S2000-XLA</td><td>utilizada para fotorefuerzo</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)&nbsp;</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td>Utilizado para fijar muestras</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Mettler Toledo&nbsp;</td><td>FP20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de pH</td><td>Cytiva</td><td>10362010</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Hyclone Laboratories, Inc.</td><td>Cytiva SH30256. Juego de pipetas FS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Puntas de pipeta USA</td><td>Scientific</td><td>1120-3710</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L Puntas de pipeta</td><td>USA Scientific</td><td>1183-1510</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Puntas de pipeta USA</td><td>Scientific</td><td>1111-0700</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Puntas de pipeta USA</td><td>Scientific</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol)-alfa metacrilato (PEG y alfa; MA)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Consulte el manuscrito para conocer los pasos de síntesis</td></tr><tr><td>Poli(óxido de etileno) (PEO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372773-250G</td><td>Componente de biotinta</td></tr><tr><td>Pipeta de desplazamiento positivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>FD10004G</td><td>100-1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473-500G</td><td>Se utiliza para ajustar el pH de las soluciones</td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Utilizado durante el proceso de tinción</td></tr><tr><td>Pronterface</td><td>All3DP</td><td>N/A</td><td>Descarga</td></tr><tr><td>de software Yoduro de propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>Utilizado para la tinción</td></tr><tr><td>de péptido RGD (CGRGDS)</td><td>GL Biochem</td><td>N/A Componente</td><td>de biotinta</td></tr><tr><td>Balancín</td><td>VWR</td><td>10127-876</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo&nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td>11100V2022</td><td>Utilizado durante la síntesis de PEGaMA</td></tr><tr><td>Grapas de</td><td>banda elástica</td><td>808659</td><td></td></tr><tr><td>Schlenk Flask&nbsp;</td><td>Kemtech America</td><td>F902450</td><td>Utilizado durante la síntesis de PEGaMA</td></tr><tr><td>Slic3r</td><td>Slic3r</td><td>N/A</td><td>Descarga de software</td></tr><tr><td>Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3182</td><td>El kit contiene componentes CC-3181 y CC-4149</td></tr><tr><td>Hidruro de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223441-50G</td><td>Utilizado durante la síntesis de PEGaMA</td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall ST 40R Fisher</td><td>Scientific</td><td>75-004-525</td><td></td></tr><tr><td>Barra de agitación</td><td>VWR</td><td>58948-091 Filtro de</td> jeringa VWR 28145-483 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Se utiliza para soluciones de filtro estériles</td></tr><tr><td>T-75 Matraz tratado con cultivo de tejidos</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td>Se utiliza para trabajos</td></tr> <tr>de cultivo celular<td>Tissue-Tek Cyromold</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT)</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-Carboxyethyl) Fosfina (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Bioreactivos</td><td>C34H622O11</td><td>Utilizado durante el proceso de tinción</td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>Utilizado para el cultivo celular trabajo</td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-062</td><td>Se utiliza para el trabajo de cultivo celular</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>C58H114O26</td><td>Se utiliza durante el proceso de tinción</td></tr><tr><td>Microscopio vertical</td><td>Olympus</td><td>BX63F</td><td>Capacidades del microscopio fluorescente</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>PolyScience</td><td>WBE20A11B</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3527</td><td></td></tr></tbody></table>

bioimpresión 3d de hidrogeles fotoajustables para estudiar la activación de fibroblastos

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Los hidrogeles fotosintonizables pueden transformarse espacial y temporalmente en respuesta a la exposición a la luz. La incorporación de este tipo de biomateriales en plataformas de cultivo celular y el desencadenamiento dinámico de cambios, como el aumento de la rigidez microambiental, permite a los investigadores modelar los cambios en la matriz extracelular (MEC) que se producen durante la progresión de la enfermedad fibrótica. En este trabajo se presenta un método para la bioimpresión 3D de un biomaterial de hidrogel fotosintonizable capaz de dos reacciones secuenciales de polimerización dentro de un baño de soporte de gelatina. La técnica de bioimpresión de Incrustación Reversible de Hidrogeles Suspendidos (FRESH) de forma libre se adaptó ajustando el pH del baño de soporte para facilitar una reacción de adición de Michael. En primer lugar, la biotinta que contenía poli(etilenglicol)-alfa metacrilato (PEGαMA) se hizo reaccionar fuera de la estequiometría con un reticulante degradable por células para formar hidrogeles blandos. Estos hidrogeles blandos se expusieron posteriormente al fotoinitador y a la luz para inducir la homopolimerización de los grupos no reaccionados y endurecer el hidrogel. Este protocolo cubre la síntesis de hidrogeles, la bioimpresión 3D, el fotoendurecimiento y las caracterizaciones de puntos finales para evaluar la activación de fibroblastos dentro de estructuras 3D. El método presentado aquí permite a los investigadores bioimprimir en 3D una variedad de materiales que se someten a reacciones de polimerización catalizadas por pH y podrían implementarse para diseñar varios modelos de homeostasis, enfermedad y reparación de tejidos.

Este protocolo describe cómo bioimprimir en 3D hidrogeles fotosintonizables dentro de un baño de soporte para crear construcciones capaces de endurecerse dinámica y temporalmente para estudiar la activación de fibroblastos en geometrías que imitan tejidos humanos. En primer lugar, el protocolo explicaba cómo sintetizar PEGαMA, la columna vertebral de este sistema de polímeros fotosintonizables. Las mediciones de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) mostraron una funcionalización exitosa de PEGαMA al 96,5%...

Este artículo describe cómo bioimprimir hidrogeles fotoajustables en 3D para estudiar el endurecimiento de la matriz extracelular y la activación de fibroblastos.

Bioimpresión 3D de hidrogeles fotoajustables para estudiar la activación de fibroblastos

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...

Diseñamos modelos 3D de tejido pulmonar para ayudar al mundo a respirar mejor. Nuestra misión es utilizar biomateriales 3D y técnicas como la impresión 3D para construir plataformas que nos ayuden a comprender qué está causando las enfermedades pulmonares crónicas y cómo tratar mejor estas afecciones. Un desafío experimental en nuestra investigación es la dificultad de imprimir en 3D materiales blandos en formas complejas.Depositamos con precisión las células mediante la impresión de nuestra biotinta y el baño de soporte de adelgazamiento de tejidos que ayuda a mantener su forma durante el proceso de impresión. Nuestros biomateriales proporcionan control sobre las propiedades mecánicas de la muestra durante todo el curso del experimento. Esta formulación permite a los investigadores cultivar células en un hidrogel que coincide con la rigidez del tejido pulmonar sano y enfermo.Los usuarios pueden decidir cuándo endurecer las muestras y medir las respuestas celulares. Los biomateriales fotosintonizables utilizados en este protocolo permiten crear un modelo suavizado, que luego se puede endurecer para explorar las respuestas celulares al endurecimiento microambiental. Técnicas similares que utilizan un biomaterial estático en lugar de un biomaterial fotosintonizable dan como resultado un modelo que no se puede endurecer después de la impresión.Los resultados de otros estudios en nuestro laboratorio sugieren que el sexo y la edad juegan un papel fundamental en la progresión de la enfermedad pulmonar. Los modelos futuros estudiarán estas variables e incluirán más complejidad, como capas adicionales específicas de la célula. La combinación de estos esfuerzos dará como resultado biohuellas más realistas y conducirá a nuevas formas de tratar enfermedades fibróticas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un bioprinter se utilizó para crear hidrogeles modelado basado en un molde de sacrificio. El molde poloxámero se rellenó con un segundo hidrogel y luego se eluyó, dejando huecos que estaban llenos de una tercera hidrogel. Este método utiliza elución rápida y buena capacidad de impresión de poloxámero para generar arquitecturas complejas a partir de biopolímeros.

Impresión Moldes inversa termosensible para la Creación de modelado hidrogeles de dos componentes para el 3D de cultivo celular

Se describe un conjunto de protocolos que en conjunto proporcionan un bioink hidrogel imitando tejido con el que construcciones de tejido 3-D funcionales y viables se pueden bioprinted para su uso en aplicaciones de cribado in vitro.

Bioprinting Cellularized Construye El uso de un Tejidos específicos de hidrogel Bioink

formación de imágenes por resonancia Förster transferencia de energía (FRET) es una poderosa herramienta para estudios de biología celular en tiempo real. Aquí se presenta un método para las células de formación de imágenes de FRET en fisiológicos microambientes tridimensional (3D) de hidrogel utilizando microscopía de epifluorescencia convencional. Se describe un análisis de sondas FRET ratiometric que produce coeficientes lineal en el intervalo de activación.

FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales

Análogos de cartílago y piel fueron bioprinted utilizando un alginato de nanocellulose base de bioink. El bioinks se cellularized antes de la impresión a través de una unidad de mezcla pasiva solo paso. Las construcciones fueron demostradas ser uniformemente cellularized, alta viabilidad, y exhiben marcadores favorables de la diferenciación.

Bioprinting de cartílago y piel análogos de tejido utilizando un pasivo novela mezcla de unidad técnica de Bioink Precellularization

Hemos desarrollado un modelo de cáncer de mama heterogéneos consistiendo en las células fibroblastos y tumor inmortalizadas encajadas un bioink de alginato/gelatina de bioprintable. El modelo recoge el microambiente tumoral de en vivo y facilita la formación de esferoides multicelulares tumor, dando la penetración en los mecanismos de conducción tumorigenesis.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide

Aquí se presenta un método para la bioimpresión 3D de gelatina metacriloyl.

Protocolos de Bioimpresión 3D de Bioinks basados en Gelatin Methacryloyl Hydrogel

Aquí, desarrollamos una novedosa estrategia modificada multicapa para bioenergitis similares a líquidos (gelatina con baja viscosidad) para evitar la sedimentación de células encapsuladas.

Uso de Bioink de hidrogel multicapa en bioimpresión tridimensional para distribución celular homogénea

El método presentado implica el estiramiento uniaxial de hidrogeles blandos 3D incrustados en caucho de silicona mientras permite la microscopía confocal viva. Se demuestra la caracterización de las cepas de hidrogel externas e internas, así como la alineación de la fibra. El dispositivo y el protocolo desarrollados pueden evaluar la respuesta de las células a diversos regímenes de deformación.

Cepa controlada de hidrogeles 3D bajo imágenes de microscopía en vivo

El procesamiento por cizallamiento durante la formación de hidrogel da como resultado la producción de suspensiones de microgel que se adelgazan pero se reestructuran rápidamente después de la eliminación de las fuerzas de cizallamiento. Tales materiales se han utilizado como una matriz de soporte para bioimpresión compleja, estructuras cargadas de células. Aquí se describen los métodos utilizados para fabricar la cama de soporte y las biotintas compatibles.

Geles fluidos de agarosa formados por procesamiento de cizallamiento durante la gelificación para bioimpresión 3D suspendida

Este estudio presenta un nuevo baño de suspensión de submicrogel de κ-carragenina, que muestra notables propiedades de transición reversibles de atasco-desatasco. Estos atributos contribuyen a la construcción de tejidos y órganos biomiméticos en bioimpresión 3D integrada. La impresión exitosa de tejidos similares al corazón y al esófago con alta resolución y crecimiento celular demuestra aplicaciones de bioimpresión e ingeniería de tejidos de alta calidad.

Bioimpresión integrada de estructuras similares a tejidos utilizando medio sub-microgel de κ-carragenina

Aprende a bioimpresión 3D de hidrogeles fotoajustables para estudiar la activación de fibroblastos en modelos de tejido pulmonar. Este método permite controlar la rigidez de la matriz extracelular y comprender mejor las enfermedades pulmonares crónicas.

Bioimpresión 3D de hidrogeles fotoajustables para estudiar la activación de fibroblastos

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