Name: PCR de bloqueo de tipo salvaje combinada con secuenciación Sanger para la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprende a detectar mutaciones somáticas de baja frecuencia mediante secuenciación Sanger en linfoma angioinmunoblástico. Este método de alta sensibilidad y bajo costo ofrece flexibilidad para aplicaciones en oncología y enfermedades sanguíneas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Optimización de la detección de mutaciones de baja frecuencia con PCR de bloqueo de tipo salvaje

<ol><li>Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. 
 <a target="_blank" href="https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd">https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd</a> (2019).</li>
<li>Xie, Y., Elaine, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+I+diagnose+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).</li>
<li>Mariko, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).</li>
<li>Daniel, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute+lukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li>
<li>Rita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5th+edition+of+the+World+Health+Organization+Classification+of+Haematolymphoid+Tumours+%3A+Lymphoid+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms.</a> Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).</li>
<li>Hae, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+inactivating+mutation+in+RHOA+GTPase+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).</li>
<li>Lee, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHOA+G17V+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%3AA+potential+biomarker+for+cytological+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment.</a> Exp Mol Pathol. 110, 104294(2019).</li>
<li>Mamiko, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).</li>
<li>Palomero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+epigenetic+regulators%2C+RHOA+and+FYN+kinase+in+peripheral+T+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas.</a> Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).</li>
<li>Fujisawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RHOA-VAV1+signaling+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).</li>
<li>Voena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHO+family+GTPases+in+the+biology+of+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">RHO family GTPases in the biology of lymphoma.</a> Cells. 8 (7), 646(2019).</li>
<li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+an+40%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing an 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li>
<li>Athanasios, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Sanger+sequencing%2C+pyrosequencing%2C+and+melting+curve+analysis+for+the+detection+of+KRAS+mutations%3A+diagnostic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications.</a> J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).</li>
<li>Wu, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+enrichment+of+rare+DNA+variants+via+sequence-selective+and+temperature-robust+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification.</a> Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).</li>
<li>John, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Coren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li>
<li>Eliza, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+in+B-cell+lymphoma%3A+technical+advances%2C+clinical+applications%2C+and+perspectives+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research.</a> Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot-spot-specific+probe+%28HSSP%29+for+rapid+and+accurate+detection+of+KRAS+mutations+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer.</a> Biosensors. 12 (8), 597(2022).</li>
<li>Matsubara, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+G17V+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma+and+related+lymphomas+using+quantitative+allele-specific+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR.</a> PLoS One. 9 (10), e109714(2014).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li>
<li>Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%223730%2F3730xl+DNA+Analyzer%22">3730/3730xl DNA Analyzer</a>. , (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Extractor automático de ADN</td><td>9001301</td><td>Qiagen</td><td></td></tr><tr><td>Detector de ácidos nucleicos de ADN</td><td>Q32854</td><td>Thermo fisher</td><td></td></tr><tr><td>Kit de amplificación de PCR</td><td>P4600</td><td>merck</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de PCR</td><td>C1000 Touch</td><td>Biorad</td><td></td></tr><tr><td>solución de proteinasa K</td><td>D3001-2-A tampón de</td> almacenamiento de proteinasa K de <td>investigación</td><td></td>zymo</tr><tr><td></td><td>D3001-2-C</td><td>zymo research</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enzimas de amplificación de secuenciación</td><td>P7670-FIN</td><td>Qiagen</td><td></td></tr></tbody></table>

pcr de bloqueo de tipo salvaje combinada con secuenciación sanger para la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

Compare la secuencia de la muestra de prueba con la secuencia de referencia para obtener el estado de mutación de la muestra de prueba. La tecnología WBT-PCR basada en BDA puede detectar la conocida mutación RHOA G17V y otras mutaciones de baja frecuencia en el intervalo de amplificación de los cebadores aguas arriba y aguas abajo. Véase la figura 1. Dos genes adicionales, a saber, IDH2 y JAK1, también se analizaron utilizando este método, Figura 2 y Figura 3, respectivamente. Los resultados muestran que este método es bastante sensible en la detección de mutaciones de baja frecuencia.
<img alt="cromatograma de secuenciación de ADN; PCR tradicional vs. WBT-PCR que muestra comparación de detección de mutaciones en RHOA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Resultado de la secuenciación de RHOA. De arriba a abajo, la figura muestra la mutación base del sitio RHOA G17 amplificada por WBT-PCR y los resultados de la secuenciación después de la amplificación de PCR tradicional correspondiente a RHOA G17 de tipo salvaje. La imagen central muestra los resultados de secuenciación de la mutación c.50G&gt;T después de la amplificación con cebadores WBT-PCR cuando la sensibilidad de detección es del 0,5%. La imagen inferior muestra los resultados de la secuenciación de la mutación c.49-50delinsTT después de la amplificación con cebadores WBT-PCR cuando la sensibilidad de detección es del 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Comparación de WBT-PCR y cromatograma de PCR tradicional, detección de mutación c.515G&gt;A, gen IDH2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Resultado de la secuenciación de IDH2. De arriba a abajo, la figura anterior muestra la mutación base del sitio IDH2 R172 amplificada por WBT-PCR y los resultados de la secuenciación después de la amplificación de PCR tradicional correspondiente a IDH2 R172 de tipo salvaje. La imagen superior muestra los resultados de la secuenciación de la mutación c.515G&gt;A después de la amplificación con cebadores WBT-PCR cuando la sensibilidad de detección es del 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Comparación de secuenciación de ADN, WBT-PCR vs PCR tradicional para el gráfico de análisis de mutaciones JAK1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Resultado de la secuenciación para JAK1. De arriba a abajo, la figura anterior muestra la mutación base del sitio JAK1 S703 amplificada por WBT-PCR y los resultados de la secuenciación después de la amplificación de PCR tradicional correspondiente a JAK1 S703 de tipo salvaje. La imagen superior muestra los resultados de la secuenciación de la mutación c.2108G&gt;T después de la amplificación con cebadores WBT-PCR cuando la sensibilidad de detección es del 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cebador</td>
			<td colspan="2">Secuencia de cebadores</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VF</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTGTGGTGCCAGGT</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VR</td>
			<td colspan="2">GCTGAAGACTATGAGCAAGCA</td>
		</tr><tr><td>RHOA-WTB</td>
			<td colspan="2">AGCAAGCATGTCTTTCCACAGGCAAAA</td>
		</tr><tr><td>Imprimación secuencial</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTGTGGTGCCAGGT</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Lista final de cebadores diseñados de RHOA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Imprimación IDH2 R172</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Cebador</td>
			<td>Secuencia de cebadores</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VF</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VR</td>
			<td>TACCTGGTCGCCATGGGC</td>
		</tr><tr><td>IDH2-WTB</td>
			<td>GCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT</td>
		</tr><tr><td>Imprimación secuencial</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>Cebador del gen JAK1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Cebador</td>
			<td>Secuencia de cebadores</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VF</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VR</td>
			<td>CCATTATGGACATCAGGACATTC</td>
		</tr><tr><td>JAK1-WTB</td>
			<td>GGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA</td>
		</tr><tr><td>Imprimación secuencial</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: La lista final de cebadores diseñados de IDH2 y JAK1.

PCR de bloqueo de tipo salvaje combinada con secuenciación Sanger para la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-sanger-sequencing-for-detection

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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La detección de raras variantes genómicas de secuenciación agruparon mediante SPLINTER

Este video describe la reacción en cadena de la polimerasa bloqueadora de tipo salvaje, o WTB-PCR, que detecta mutaciones somáticas. La técnica basada en PCR utiliza un ácido nucleico bloqueado, o LNA, un oligonucleótido que se une a su alelo complementario de tipo salvaje y bloquea su elongación. El bloqueo permite selectivamente la amplificación de alelos mutantes de bajo nivel sobre sus variantes de tipo salvaje en la muestra.

PCR de bloqueo de tipo salvaje para detectar mutaciones somáticas de baja frecuencia

Se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y la posterior basada en la hibridación exón captura para la detección de mutaciones clave asociados con el cáncer en las muestras tumorales clínicos de secuenciación masiva en paralelo de "próxima generación". Targeted secuenciación exón ofrece los beneficios de alto rendimiento, bajo coste, y la cobertura de secuencia profunda, produciendo de este modo una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja...

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Siguiente Generación de secuenciación para la detección de mutaciones procesable en tumores sólidos y líquidos

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La PCR de bloqueo de tipo salvaje seguida de secuenciación directa ofrece un método altamente sensible de detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia en una variedad de tipos de muestras.

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