Name: Preparación de semillas de palma dura para el análisis de espectrometría de masas por imágenes de desorción/ionización por láser asistida por matriz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprende a preparar semillas de palma duras para análisis MALDI-IMS manteniendo bajo contenido de agua y preservando la distribución de analitos. Este método permite obtener imágenes de alta calidad y resolución espacial.

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Este trabajo fue financiado por el Instituto Serrapilheira (Serra-1708-15009) y la Fundación Carlos Chagas Filho de Apoyo a la Investigación en el Estado de Río de Janeiro (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021). El Instituto Serrapilheira y el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) otorgaron becas para el Dr. Felipe Lopes Brum y el Dr. Gabriel R. Martins (Programa de Fortalecimiento de Capacidades Institucionales/INT/MCTI). La Coordinación de Perfeccionamiento del Personal de Nivel Superior (CAPES) es reconocida por otorgar una beca de maestría para el Sr. Davi, M. M. C. da Silva. El Centro de Espectrometría de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) es reconocido por los servicios prestados con los análisis MALDI-IMS, y se agradece al Sr. Alan Menezes do Nascimento y al Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), financiado por la beca MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ nº 442604/2019, por el análisis de composición elemental.

Las semillas de Euterpe precatoria fueron amablemente donadas por el Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brasil), y las semillas de Euterpe edulis fueron amablemente donadas por el Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brasil) después del proceso de despulpado industrial. Las semillas se mantuvieron en cajas de plástico selladas a temperatura ambiente.
1. Espectroscopía de masas de imágenes de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-IMS)
<ol><li>Protocolo de seccionamiento de semillas<ol><li>Deje reposar tres semillas de cada especie en agua desionizada durante 24 h.</li>
		<li>Al día siguiente, encienda el criostato (ver Tabla de Materiales) y déjelo alcanzar los -20 °C.</li>
		<li>Saca las semillas húmedas del agua. Corta las semillas por la mitad con una cuchilla de micrótomo (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Prepare una solución de gelatina fresca y tibia (10%) (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Coloca la mitad de la semilla en un molde y rellénalo con gelatina recién hecha. Congelar a -80 °C durante 2 h antes de llevarlo al criostato.</li>
		<li>Fije la semilla incrustada al soporte del criostato utilizando un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT, consulte la Tabla de materiales) y déjela durante 10 minutos dentro del criostato para el endurecimiento OCT.</li>
		<li>Agregue cinta adhesiva de cobre de doble cara (consulte la Tabla de materiales) a un portaobjetos de vidrio recubierto de óxido de indio y estaño (portaobjetos ITO; consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Producir secciones de 20 μm de espesor de cada especie y colocarlas en la cinta adhesiva de cobre de doble cara adherida al portaobjetos de vidrio ITO. NOTA: En este punto, las lonchas recogidas en los portaobjetos se pueden almacenar en un congelador a -80 °C; Alternativamente, proceda a la deposición de la matriz. Los portaobjetos deben colocarse en una caja portaobjetos, enjuagarse con N2 gaseoso y sellarse con una película para evitar la oxidación de la muestra (véase la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Deposición de matrices<ol><li>Coloque el portaobjetos que contiene las rodajas en un desecador al vacío hasta que alcance la temperatura ambiente.</li>
		<li>Haga marcas didácticas con un bolígrafo corrector en cada esquina de la diapositiva. Escanee la diapositiva con un escáner de mesa. Ajustado a la resolución de 4.800 ppi.</li>
		<li>Utilice una balanza analítica para pesar 30 mg de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB; ver Tabla de materiales) y prepare 1 ml de metanol:ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) 1:1 %. Tabla de Materiales) solución para disolver el DHB.</li>
		<li>Llene una jeringa de vidrio de 1 ml (consulte la tabla de materiales) con solución de DHB y colóquela en una bomba de jeringa (consulte la tabla de materiales) ajustada a un caudal de 0,8 ml/h.</li>
		<li>Con un tubo de PEEK, conecte la jeringa a una aguja de ionización química a presión atmosférica (APCI) (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Conecte N2 a la aguja APCI y ajústela a un caudal de 12,5 psi .</li>
		<li>Coloque la aguja APCI en la plataforma de movimiento xy (consulte la tabla de materiales). Asegúrese de que la punta de la aguja APCI esté a 4 cm por encima del portaobjetos.</li>
		<li>Utilizando el software de dibujo (véase la Tabla de Materiales y la Figura 1 Complementaria), configure la plataforma de movimiento xy para que siga la plantilla. La plantilla consta de líneas paralelas horizontales espaciadas por 1 mm.</li>
		<li>Para lograr la deposición de la matriz, espere a que la plataforma de movimiento xy repita la plantilla 20 veces. PRECAUCIÓN: La deposición de la matriz debe llevarse a cabo en una campana de extracción química.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquisición de imágenes<ol><li>Coloque el portaobjetos en el espectrómetro de masas (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Utilice marcas de rotulador corrector para establecer puntos de enseñanza en el software al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Ajuste la potencia del láser (60%), el enfoque del láser (medio), el número de disparos (100) y la polaridad en el software (consulte la Tabla de materiales). Establezca un factor de reducción de datos del 99% y guarde el archivo FID para la calibración posterior de los datos. Guarde el método.</li>
		<li>Delimite el área que se va a analizar con la herramienta agregar región de medición de polígonos del software del espectrómetro de masas. Edite los parámetros de la región de medición indicando el método guardado en el paso anterior y el ancho del ráster a 100 μm (Figura complementaria S4A).</li>
		<li>Inicie la adquisición de imágenes.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de datos<ol><li>Utilice el grupo de matrices y los contaminantes conocidos para crear una lista de masas en el software de referencia (consulte la Tabla de materiales) en la pestaña de calibrantes (Figura complementaria S4B).<ol><li>Abra los datos que se van a calibrar en el software de referencia (consulte Tabla de materiales). En la pestaña de calibración , abra la lista de masas creada y abra un cuadro de diálogo haciendo clic con el botón derecho y elija la opción establecer masas de bloqueo (Figura complementaria S4C).</li>
			<li>Seleccione el modo de ventana gaussiana con ensanchamiento gaussiano de 0,5 y ensanchamiento de línea de 3,5. Deje la calibración en línea sin marcar. Seleccione el modo (simple), el umbral (1.000) y la tolerancia de masa (5 ppm). Calibrar los datos con el proceso y guardar la herramienta de datos 2D (Figura complementaria S4C).</li>
		</ol></li>
		<li>Después de la calibración, exporte los datos al laboratorio SCiLS u otro software compatible y establezca el umbral de valor m/z deseado (rango elegido: 150 a 2.500). NOTA: Dependiendo del tamaño del archivo o de las características del ordenador, esto puede llevar algún tiempo.</li>
		<li>Elija un método de normalización entre el recuento total de iones (TIC) o la raíz cuadrática media (RMS). NOTA: Para este análisis se optó por el TIC.</li>
		<li>Si se conocen los analitos que se van a cartografiar, represente gráficamente cada valor m/z para cada analito y guarde las imágenes generadas y la gráfica de la media espectral. NOTA: En este trabajo, los valores m/z de los oligómeros de hexosa se eligieron considerando el aducto de potasio.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Espectroscopía de dispersión de energía (EDS)
<ol><li>Protocolo de seccionamiento de semillas<ol><li>Adquiera una rodaja delgada de semillas en una sierra seccionadora (consulte la tabla de materiales).</li>
		<li>Corte las semillas con los siguientes parámetros: velocidad de corte de 500 RPM, carga de carga de 100 N y hoja de oblea de diamante de 15 HC (consulte la tabla de materiales). NOTA: Manejar la extracción manual de fibras de las semillas debido a la necesaria adherencia a la sujeción en las prensas de precisión unidas al goniómetro. Limpie la cuchilla antes de usarla, cortando una sección de la semilla para evitar agregar minerales indeseables durante el análisis.</li>
		<li>Limpie las muestras con aire comprimido para eliminar todos los residuos de partículas del corte (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Fije una sección de semillas en cinta conductora de carbono de doble cara (ver Tabla de materiales) en el soporte.</li>
	</ol></li>
	<li>Condiciones de análisis<ol><li>Fije el soporte con una sección de semillas dentro de la cámara de vacío de un microscopio electrónico de barrido (SEM) acoplado con EDS (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Adquirir micrografías electrónicas en un modelo de microscopio con una aceleración de 20 kV y un tamaño de punto de 4.0, utilizando señales de electrones secundarios (ver Tabla de Materiales), electrones retrodispersados (detector de estado sólido fijado en la pieza polar) y mezclas de estos dos tipos de señales (MIX), construyendo imágenes coloreadas artificialmente.</li>
		<li>Para la adquisición de espectros EDS, utilice un espectrómetro (ver Tabla de Materiales) acoplado con el SEM antes mencionado. La configuración de la condición de la adquisición de imágenes de EDS es la misma que la del SEM.</li>
		<li>Establezca los grados de inclinación, la elevación y el acimut en 0,0, 35,0 y 0,0, respectivamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquisición de datos<ol><li>Establezca tres áreas diferentes con un aumento de 91x de la sección semilla para adquirir datos.</li>
		<li>Identifique los picos en el espectro al finalizar la adquisición o durante la adquisición. Utilice el botón de paso Confirmar elementos para identificar los picos manualmente.</li>
		<li>Establezca el tiempo de adquisición en 60 s para cada área seleccionada. Establezca el tiempo de proceso en cinco; Los parámetros están disponibles para un tiempo de proceso de uno a seis. NOTA: Los signos de los elementos son constantes y se suman, mientras que los ruidos son aleatorios y deletéreos. Cuanto mayor sea el tiempo de procesamiento, menor será el ruido.</li>
		<li>La configuración predeterminada para mostrar resultados cuantitativos significativos está por encima de dos sigmas (desviación estándar). Ponga dos sigmas a cero para reducir los resultados no deseados.</li>
		<li>Normalizar cada intensidad de los elementos; este es un parámetro estandarizado en el software (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Para analizar los datos, expórtelos en un archivo DOC.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de datos<ol><li>Garantice la medición precisa de las intensidades máximas para el análisis elemental cuantitativo.</li>
		<li>Los picos superpuestos requieren deconvolución para una mejor separación de picos; Reste un fondo ruidoso cuando sea necesario.</li>
		<li>Cuando no haya superposición, aumente la ganancia para amplificar las señales y mejorar la calidad del espectro.</li>
	</ol></li>
</ol>

Una guía detallada para preparar semillas de palma dura para el análisis MALDI-IMS

<ol><li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%3A+a+review+of+emerging+advancements+and+future+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights.</a> Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).</li>
<li>Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeeren%2C+RMA+%22Encyclopedia+of+Spectroscopy+and+Spectrometry%22">Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry</a>. , Elsevier Ltd. (2017).</li>
<li>Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+an+emerging+technology+in+neuropsychopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology.</a> Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).</li>
<li>Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).</li>
<li>Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+mass+spectrometry+imaging+%28MALDI-MSI%29+for+in+Situ+analysis+of+endogenous+molecules+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants.</a> Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).</li>
<li>Bhandari, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+mass+spectrometry+imaging+of+plant+tissues%3A+Towards+a+plant+metabolite+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas.</a> Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).</li>
<li>Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+for+plant+biology%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging for plant biology: a review.</a> Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).</li>
<li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+mass+spectrometry+imaging+of+plant+tissues%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 60(2016).</li>
<li>Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+and+effective+sample+preparation+protocol+of+MALDI-TOF-MSI+for+lipids+imaging+analysis+in+hard+and+dry+cereals%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals.</a> Food Chemistry. 398, 133911(2023).</li>
<li>Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acquisition+of+thin+sections+of+a%C3%A7a%C3%AD+%28Euterpe+oleracea+Mart.%29+seed+with+elevated+potassium+content+for+molecular+mapping+by+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474(2023).</li>
<li>Martins, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+characterization%2C+antioxidant+and+antimicrobial+activities+of+a%C3%A7a%C3%AD+seed+%28Euterpe+oleracea+Mart.%29+extracts+containing+A-+and+B-type+procyanidins%5BTitle%5D)+AND+%22LWT%22%5BJournal%5D)">Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins.</a> LWT. 132, 109830(2020).</li>
<li>Martins, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+profile+and+antioxidant+properties+in+extracts+of+developing+a%C3%A7a%C3%AD+%28Euterpe+oleracea+Mart.%29+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).</li>
<li>Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A%C3%A7a%C3%AD+waste+valorization+via+mannose+and+polyphenols+production%3A+techno-economic+and+environmental+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Conversion+and+Biorefinery%22%5BJournal%5D)">Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment.</a> Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).</li>
<li>Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jussa%C3%AD+%28Euterpe+edulis%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Jussaí (Euterpe edulis): a review.</a> Food Science and Technology. 42, (2022).</li>
<li>Yamaguchi, K. K. dL., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amazon+acai%3A+chemistry+and+biological+activities%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review.</a> Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).</li>
<li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+adhesive+tape+attached+to+the+reverse+side+of+a+non-conductive+glass+slide+to+achieve+protein+MALDI-imaging+in+FFPE-tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections.</a> Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).</li>
<li>Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+salt+doping+and+matrix+sublimation+for+high+spatial+resolution+MALDI+imaging+mass+spectrometry+of+neutral+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids.</a> Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).</li>
<li>Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morfo-anatomia+da+semente+de+Euterpe+precatoria+Mart+%28Palmae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Sementes%22%5BJournal%5D)">Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae).</a> Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).</li>
<li>Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+structure+and+histochemistry+in+the+palm+Euterpe+edulis%5BTitle%5D)+AND+%22Botanical+Journal+of+the+Linnean+Society%22%5BJournal%5D)">Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis.</a> Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).</li>
<li>Alves, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Provenient+residues+from+industrial+processing+of+a%C3%A7a%C3%AD+berries+%28Euterpe+precatoria+Mart%29%3A+nutritional+and+antinutritional+contents%2C+phenolic+profile%2C+and+pigments%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments.</a> Food Science and Technology. 42, (2022).</li>
<li>Inada, K. O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+the+chemical+composition+and+occurring+antioxidants+in+jabuticaba+%28Myrciaria+jaboticaba%29+and+jussara+%28Euterpe+edulis%29+fruits+and+their+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+FunctionalFoods%22%5BJournal%5D)">Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions.</a> Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).</li>
<li>Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concentration+and+yield+production+of+mannose+from+a%C3%A7a%C3%AD+%28Euterpe+oleracea+Mart.%29+seeds+via+mannanase-catalyzed+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10939(2019).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Las plantas están compuestas de tejidos especializados para funciones bioquímicas específicas. Por lo tanto, el protocolo de preparación de muestras para MALDI-IMS debe diseñarse de acuerdo con varios tejidos vegetales con propiedades fisicoquímicas específicas, ya que las muestras deben mantener su distribución y abundancia de analitos originales para una señal de alta calidad y resolución espacial8.
Antes del análisis MALDI-IMS, la consideración principal es recolecta...

La espectrometría de masas por imágenes de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-IMS) es un método potente que permite la asignación bidimensional de biomoléculas, proporciona una investigación no dirigida de compuestos ionizables y determina su distribución espacial, especialmente en muestras biológicas 1,2. Durante dos décadas, esta técnica ha permitido la detección e identificación simultánea de lípidos, péptidos, carbohidratos, proteínas, otros metabolitos y moléculas sintéticas como fármacos terapéuticos 3,4. MALDI-IMS facilita el análisis químico en la superficie de una muestra de tejido sin extracción, purificación, separación, etiquetado o tinción de muestras biológicas. Sin embargo, para el éxito del análisis, un paso fundamental en esta técnica es la preparación de la muestra, especialmente en los tejidos vegetales, que se especializan y modifican a órganos complejos generalizados debido a la aclimatación ambiental5.
Debido a las propiedades fisicoquímicas inherentes al tejido vegetal, existe la necesidad de un protocolo adaptado para satisfacer los requisitos del análisis MALDI-IMS y preservar la forma original del tejido durante la preparación del corte 6,7. En el caso de muestras no convencionales, como semillas, los protocolos establecidos8 no son aplicables porque estos tejidos tienen paredes celulares rígidas y bajo contenido de agua, lo que puede causar fácilmente la fragmentación de la sección y conducir a la deslocalización de compuestos9.
Nuestro grupo de investigación ha publicado datos experimentales sobre mapeo molecular y un protocolo adaptado para el análisis MALDI-IMS de la semilla de açaí (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, que es un subproducto generado en altas cantidades durante la producción de la pulpa de açaí13. La idea era desarrollar un protocolo para el mapeo in situ de diferentes metabolitos en semillas de açaí, ayudando a sugerir posibles usos para este residuo agrícola que actualmente no están siendo explorados comercialmente. Sin embargo, debido a la resistencia de la semilla de açaí, fue necesario realizar un protocolo a medida para obtener un corte adecuado de la muestra a partir del análisis MALDI-IMS.
En este contexto, la pulpa de açaí, de importancia económica, ha motivado la creciente comercialización de otros frutos de palmeras del género Euterpe con características sensoriales similares. Los dos frutos emergentes de las palmeras que se han producido a escala industrial como alternativa al açaí14,15 son E. precatoria (conocida como açaí-do-amazonas), que crece en la selva amazónica, y E. edulis (conocida como juçara), típica de la Mata Atlántica. Sin embargo, el consumo de açaí-do-amazonas y juçara conduce a la misma acumulación de semillas resistentes y no comestibles que no se aprovechan y no se han estudiado hasta ahora en cuanto a su composición química detallada.
De este modo, demostramos aquí que el protocolo previamente diseñado puede ser utilizado, con pocas adaptaciones, para analizar semillas de E. precatoria y E. edulis para su mapeo molecular por MALDI-IMS, demostrando ser una poderosa herramienta que puede ser utilizada para el análisis de la composición de estos recursos y puede ayudar a determinar sus potenciales usos biotecnológicos. Además, la descripción detallada que se proporciona aquí puede ayudar a otras personas con dificultades similares en la preparación de materiales resistentes para el análisis MALDI-IMS.

<table><tbody><tr><td>Jeringa hermética al gas de 1 mL modelo 1001 TLL, PTFE Luer Lock</td><td>Hamilton Company</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2,5-dihidroxibenzoico</td><td>Sigma Aldrich Co, MO, EE. UU</td><td>. 149357</td><td></td></tr><tr><td>aguja APCI</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemania</td><td>602193</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de movimiento AxiDraw V3 xy</td><td>Evil Mad Scientist, CA, EE. UU.</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>Cinta conductora de carbono de doble cara</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de datos Compass&nbsp;</td><td></td><td></td><td>creación de la lista de masas</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara de cobre</td> para aire <td></td><td></td> comprimido 3M, EE. UU. 1182-3/4"X18YD <td></td></tr><tr><td></td> Cryostat CM 1860 UV Leica&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Biosystems, Nussloch, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de oblea de diamante 15 HC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detector</td><td></td><td></td><td></td>Everhart-Thornley</tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemania</td><td></td> adquisición de <td>imágenes</td></tr><tr><td>FTMS Processing</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemania</td><td></td><td>calibración</td></tr><tr><td>de datos Gelatina de piel de bovino</td><td>Sigma Aldrich Co, MO, EE. UU</td>. <td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de micrótomo de alto perfil Leica 818</td><td>Leica&nbsp; Biosystems, Nussloch, Alemania</td><td>0358 38926</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de vidrio recubierto de óxido de indio y estaño</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemania</td><td>8237001</td><td></td></tr><tr><td>Inkscape Inkscape</td><td>Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, EE. UU</td><td></td><td></td></tr>. <tr><td>Cortador de precisión IsoMet 1000</td><td>Buehler, Illinois, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T.Baker</td><td>9093-03</td><td></td></tr><tr><td>Agua Mili-Q</td><td></td><td></td><td>18.2 M&Omega;. cm</td></tr><tr><td>Bomba</td><td></td><td></td><td></td>de vacío de aceite</tr><tr><td>Compuesto de temperatura de corte óptima</td><td>Fisher HealthCare, Texas, EE. UU</td>. <td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Película de sellado Parafilm "M"</td><td>Amcor</td><td>HS234526B</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 450 FEG FEI</td><td>Co, Hillsboro, OR, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>. SciLS Lab (soporte de múltiples proveedores) MS Software&nbsp;</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software INCA Suite 4.14 V</td><td>Oxford Instruments, Ableton, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solarix 7T</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Alemania</td> Bomba de jeringa kdScientific, MA, EE<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>. UU.</td><td>78-9100K</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma Aldrich Co, MO, EE. UU</td><td>. 302031</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro</td> <td>X-MaxOxford Instruments, Ableton, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de semillas de palma dura para el análisis de espectrometría de masas por imágenes de desorción/ionización por láser asistida por matriz

Preparation of Hard Palm Seeds for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Imaging Mass Spectrometry Analysis

La espectrometría de masas de imágenes de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI-IMS) se aplica para identificar compuestos en sus entornos nativos. En la actualidad, MALDI-IMS se utiliza con frecuencia en análisis clínicos. Aún así, existe una excelente perspectiva para aplicar mejor esta técnica para comprender la información fisiológica de los compuestos químicos en los tejidos vegetales. Sin embargo, la preparación puede ser un desafío para muestras específicas de materiales botánicos, ya que MALDI-IMS requiere cortes delgados (12-20 μm) para la adquisición adecuada de datos y el análisis exitoso. En este sentido, previamente, desarrollamos un protocolo de preparación de muestras para obtener secciones delgadas de semillas duras de Euterpe oleracea (palma de açaí), posibilitando su mapeo molecular mediante MALDI-IMS.
Aquí, mostramos que el protocolo desarrollado es adecuado para preparar otras semillas del mismo género. Brevemente, el protocolo se basó en sumergir las semillas en agua desionizada durante 24 h, incrustar las muestras con gelatina y seccionarlas en un criostato aclimatado. A continuación, para la deposición de la matriz, se acopló una plataforma de movimiento xy a una pulverización de aguja de ionización por electrospray (ESI) utilizando una solución de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) y metanol 1:1 (v/v) con ácido trifluoroacético al 0,1% a 30 mg/mL. Los datos de las semillas de E. precatoria y E. edulis se procesaron utilizando software para mapear sus patrones de metabolitos.
Los oligómeros de hexosa se mapearon dentro de las rebanadas de muestra para demostrar la idoneidad del protocolo para esas muestras, ya que se sabe que esas semillas contienen grandes cantidades de manano, un polímero de la manosa de hexosa. Como resultado, se identificaron picos de oligómeros de hexosa, representados por aductos [M + K]+ de (Δ = 162 Da). Por lo tanto, el protocolo de preparación de muestras, previamente desarrollado a medida para semillas de E. oleracea , también permitió el análisis MALDI-IMS de otras dos semillas de palma dura. En definitiva, el método podría constituir una herramienta valiosa para la investigación en morfoanatomía y fisiología de materiales botánicos, especialmente a partir de muestras resistentes a cortes.

El protocolo diseñado permitió el análisis MALDI-IMS de las semillas de E. precatoria y E. edulis . Como resultado, pudimos confirmar el peso molecular y el grado de polimerización (DP) de los carbohidratos como una elucidación estructural parcial. La información molecular proporcionada por el análisis MALDI-IMS (Figura 1 y Figura 2) mostró picos que representan aductos [M+K]+ de oligómeros de hexosa (Δ = 162 Da) sin...

Este protocolo tuvo como objetivo describir una guía detallada sobre la preparación de secciones de muestras de semillas duras con bajo contenido de agua para el análisis MALDI-IMS, manteniendo la distribución y abundancia originales de los analitos y proporcionando una señal de alta calidad y resolución espacial.

Preparación de semillas de palma dura para el análisis de espectrometría de masas por imágenes de desorción/ionización por láser asistida por matriz

Matrix-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) is applied to identify compounds in their native environments. ...

Nuestra investigación se centra en la valorización de la biomasa vegetal de la biodiversidad tropical. Para eso, es muy importante caracterizar bien esos materiales para poder darles el mejor valor y proponer los mejores destinos. Para ello, en este trabajo, empleamos el análisis de espectrometría de masas de imágenes MALDI como técnica de caracterización, ya que es un método muy preciso que nos puede dar una imagen molecular específica del tejido biológico.Con los resultados, podemos tener una visión general de los principales componentes de esta biomasa vegetal y también su localización, y esto puede guiar nuestra exploración de nuevos productos y procesos a partir de ese material. Sin embargo, para tener un muy buen análisis de espectrometría de masas de imágenes MALDI, es muy importante tener un buen método de preparación de muestras, y eso es exactamente lo que describimos en este trabajo. Los avances en la tecnología han llevado a muchos desafíos en el análisis de espectrometría de masas de imágenes.Los tejidos vegetales, en particular, plantean un desafío complejo debido a sus órganos especializados. Es crucial para esta técnica, esta preparación de muestras, si la preparación de la muestra se realiza de manera inadecuada, las señales no se detectarán o aparecerán artefactos, lo que dará lugar a resultados inexactos. Estos protocolos nos permiten la preparación de rodajas delgadas de semillas de palma resistentes al intestino, sirviendo como prueba de un concepto para el mapeo molecular dentro de un tejido de semilla viva.Por lo tanto, esta técnica ofrece información valiosa sobre los oligosacáridos presentes en estas semillas. Por lo tanto, esperamos que la técnica sea útil para los investigadores con obstáculos similares. Esta técnica puede ayudar en el estudio de otras semillas duras o cualquier otro material biológico que imponga un reto para ser cortado en rodajas de aleta.Por ejemplo, este protocolo puede ser una herramienta en el estudio del desarrollo y la germinación de semillas si se está estudiando una semilla dura.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

Medición de la masa exacta representa un paso importante en la investigación de las proteínas. Matrix asistida por láser de desorción / ionización (MALDI) espectrometría de masas (MS) se puede utilizar para tal determinación y su ventaja fundamental es la tolerancia a las sales, detergentes y los contaminantes. Aquí se ilustra un enfoque accesible para el análisis de proteínas más grandes de 100 kDa por MALDI-MS.

Matrix asistida por láser de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas Análisis de las proteínas intactas de más de 100 kDa

El ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) ha sido reportado anteriormente como una matriz de MALDI para obtener imágenes de tejido de pequeñas moléculas; protocolos para el uso de DT para la formación de imágenes de MALDI de los lípidos endógenos en la superficie de secciones de tejido por-ion positivo MALDI-MS en un instrumento cuadrupolar-FTICR ultra alta resolución se proporcionan aquí.

El ditranol como una matriz para láser asistida por matriz de desorción / ionización de imágenes en una transformada de Fourier de iones de resonancia de ciclotrón Espectrómetro de Masas

Líneas celulares de cáncer inmortalizadas pueden ser cultivadas como cultivos de células en 3D, un modelo valioso para la investigación biológica. Este protocolo describe imágenes espectrometría de masas de cultivos de células en 3D, incluyendo mejoras en la plataforma de preparación de la muestra. El objetivo de este protocolo es instruir a los usuarios preparar cultivos de células en 3D para el análisis de imágenes de espectrometría de masas.

Preparación de la muestra Estrategias para Espectrometría de Masas de imágenes de modelos de cultivo celular en 3D

Se desarrolló una fuente de imágenes de espectrometría de masas (MSI) operada a presión atmosférica mediante el acoplamiento de la desorción láser de infrarrojo medio y la postionización por electrospray. La matriz de hielo exógeno se utilizó como matriz absorbente de energía para facilitar la desorción resonante del material relacionado con los tejidos. Este manuscrito proporciona un protocolo paso a paso para realizar IR-MALDESI MSI en ratones neonatos de cuerpo entero.

Todo el cuerpo de Espectrometría de Masas de imágenes por infrarrojos asistida por matriz de desorción láser de ionización electrospray (IR-MALDESI)

Este protocolo describe un método reproducible y confiable para la preparación a base de la sublimación de formalina fijada destinado para el spectrometry total de la proyección de imagen del tejido.

Óptima preparación de formol fijada muestras para péptidos basados en matriz asistida por láser de desorción/ionización espectrometría de masas de flujos de trabajo

Un protocolo para el tiempo de ionización desorción láser asistida por matriz de caracterización de la espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) de los polímeros sintéticos se describe como la optimización de la preparación de muestras, adquisición espectral y análisis de datos de vuelo.

Caracterización de polímeros sintéticos vía matriz asistida por láser desorción de ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas

La proyección de imagen molecular con láser asistida por matriz basada en desorción/ionización de espectrometría de masas (MALDI-IMS) permite la asignación simultánea de múltiples analitos en muestras biológicas. Aquí, presentamos un protocolo para la detección y visualización de la proteína β amiloide en los tejidos cerebrales de la enfermedad de Alzheimer y las muestras de la Angiopatía amiloide cerebral usando MALDI-IMS.

Visualización de depósitos β amiloide en el cerebro humano con desorción láser asistida por matriz/ionización del Spectrometry total de la proyección de imagen

Se demuestra un protocolo para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas MALDI por reformar estructuras cristalinas durante los procesos de preparación de muestra.

Un método de preparación de muestra eficiente para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación de la muestra al planificar experimentos con MALDI MSI para maximizar la detección metabólica y molecular en muestras biológicas.

Preparación de muestras para perfiles metabólicos utilizando imágenes de espectrometría de masas MALDI

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación adecuada de la muestra para el análisis de lípidos y metabolitos en tejidos pequeños, como el cerebro de Drosophila , utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).

Preparación de muestras para el análisis rápido de lípidos en el cerebro de Drosophila utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción / ionización láser asistidas por matriz

Aprende a preparar semillas de palma duras para análisis MALDI-IMS manteniendo bajo contenido de agua y preservando la distribución de analitos. Este método permite obtener imágenes de alta calidad y resolución espacial.

Preparación de semillas de palma dura para el análisis de espectrometría de masas por imágenes de desorción/ionización por láser asistida por matriz (Video) | JoVE Journal

Preparación de semillas de palma dura para el análisis de espectrometría de masas por imágenes de desorción/ionización por láser asistida por matriz

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