Preparación de muestras para criotomografía in situ de células de mamíferos
15 de diciembre de 2023
Este método proporciona un protocolo accesible y flexible para la preparación de rejillas de microscopía electrónica (EM) para criotomografía celular in situ y microscopía óptica y electrónica correlativa (CLEM).
El objetivo de esta investigación es desarrollar una metodología para la preparación de muestras que sea accesible y reproducible de forma fiable. Al lograr esto, el poder de la criotomografía celular directa se puede utilizar para responder a una amplia variedad de preguntas biológicas. Los desafíos de la preparación de la red son extensos.
Las celdas no se adhieren fácilmente a las cuadrículas, y la manipulación puede provocar daños en la capa de carbono, lo que resulta en la pérdida de áreas de cuadrícula que se pueden fotografiar. Además, la prevalencia de protuberancias celulares delgadas se reduce si no se presta atención a las condiciones adecuadas de preparación de la muestra. Los protocolos actuales suelen requerir equipos especializados para resolver los principales cuellos de botella de la siembra, como los micropatrones y los soportes impresos en 3D para la fijación y manipulación de las células, respectivamente.
Este protocolo proporciona soluciones con mayor accesibilidad, al tiempo que mantiene la flexibilidad para que estas herramientas especializadas se utilicen en aplicaciones posteriores.
Visión general
Este método proporciona un protocolo accesible y flexible para la preparación de rejillas de microscopía electrónica (ME) para criotomenografía celular in situ y microscopía electrónica y óptica correlativa (CLEM). El protocolo aborda los desafíos en la preparación de la rejilla, asegurando la adhesión celular y minimizando el daño a la capa de carbono.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Microscopía electrónica
Antecedentes
- La criotomenografía electrónica celular directa es una herramienta poderosa para la investigación biológica.
- La preparación de la rejilla es crítica para la obtención de imágenes y análisis exitosos.
- Los métodos actuales a menudo requieren equipo especializado, limitando la accesibilidad.
- Este protocolo tiene como objetivo simplificar el proceso mientras mantiene la flexibilidad.
Propósito del estudio
- Desarrollar una metodología reproducible y accesible para la preparación de rejillas de ME.
- Mejorar la usabilidad de la criotomenografía electrónica en estudios biológicos.
- Abordar los desafíos comunes en la adhesión celular y la integridad de la rejilla.
Métodos utilizados
- Tratamiento de descarga en glow de las rejillas para mejorar la adhesión celular.
- Aplicación de fibronectina bovina para promover la adhesión celular.
- Procedimientos de siembra celular y transfección para clones moleculares del VIH.
- Congelación por inmersión de las rejillas para imágenes de criotomenografía electrónica.
Principales resultados
- Adhesión exitosa de células a las rejillas de ME con daño mínimo.
- Observación de células productoras de VIH mediante microscopía correlativa criogénica.
- Preservación efectiva de la integridad de la rejilla durante el proceso de preparación.
- Demostración de la reproducibilidad del protocolo en múltiples ensayos.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado mejora la accesibilidad para la preparación de rejillas de ME.
- Permite el estudio efectivo de procesos celulares mediante criotomenografía electrónica.
- Las aplicaciones futuras pueden aprovechar este método para varias investigaciones biológicas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Robust sample preparation for in situ cryotomography of mammalian cells is critical for enabling high-resolution structural studies in native cellular contexts. This protocol addresses key bottlenecks in grid handling, cell attachment, and reproducibility, directly impacting the reliability of downstream imaging and integrative analyses. Improved accessibility and standardization in sample preparation enhance predictive confidence and portfolio decision-making in early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cellular ultrastructure for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by preserving native cell environments.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of molecular assemblies in situ.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for correlative imaging workflows.
- Standardizes grid preparation to ensure reproducibility and quantitative imaging outputs.
- Improves readiness for high-content screening and integrative microscopy platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular models for translational continuity.
- Enables structural assessment of viral and cellular interactions in preclinical systems.
- Supports risk-adjusted advancement by providing high-fidelity morphological data.
Pipeline & Workflow Integration
This sample preparation protocol integrates at the interface of discovery biology and advanced imaging, supporting workflows from early mechanistic studies to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Provides reproducible sample preparation for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers standardized, high-quality grids for quantitative imaging and assay development.
- Analytics: Enables acquisition of robust structural data for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by maintaining cellular context in imaging outputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a flexible, accessible protocol adaptable to diverse cell types and imaging modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in structural target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of sample preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing imaging failures.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, grid handling, and microscopy techniques.
- Needs access to glow discharge devices, biosafety cabinets, and plunge-freezing instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducible grid preparation and imaging quality.
- Adaptable to various adherent mammalian cell types with protocol modifications as needed.
- Grid fragility and manipulation remain practical limitations requiring careful handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Preparing Electron Microscopy (EM) Grids for Cellular Cryotomography
3:34
Cell Seeding and Transfection on Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
5:34
Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography
