Name: Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Descubre dos métodos para diferenciar células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales: monocapa y cuerpos embrionoides. El método de monocapa muestra mayor eficacia en diferenciación osteogénica.

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Estamos muy agradecidos a todos los miembros del Laboratorio Mao y Hu, pasados y presentes, por las interesantes discusiones y las grandes contribuciones al proyecto. Agradecemos al Centro Nacional de Investigación Clínica para la Salud Infantil por el gran apoyo. Este estudio contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang de China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu).

1. Mantenimiento de hiPSCs
<ol><li>Descongelación de hiPSC<ol><li>Saque las células del nitrógeno líquido y descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 °C. Transfiera las células de descongelación a un tubo de 15 mL preparado con 3 mL de medio de mantenimiento iPSC (Tabla de Materiales). Mezcle suavemente el medio.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las células en 1 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 (pipetear las células hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces).</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) y 2 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 agregados de antemano (aproximadamente 4 x 104 células/cm2).</li>
		<li>Cultivar las células durante 5-6 días (80%-90% de confluencia) a 37 °C, 5% de CO2 con cambio de medios de mantenimiento iPSC todos los días.</li>
	</ol></li>
	<li>Paso de hiPSC<ol><li>Retire el medio de mantenimiento iPSC de la placa de 6 pocillos. Lave los hiPSC una vez con DPBS.</li>
		<li>Añadir 700-800 μL de solución de EDTA 0,48 mM e incubar durante 1 min a temperatura ambiente (RT), luego retirar la solución de digestión. Continuar incubando a 37 °C de temperatura durante 3-5 min.</li>
		<li>Cuando las células se digieren en láminas (no digiera las células en células individuales), agregue 1 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 para finalizar la digestión. Pipetea con cuidado las células hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces.</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) y 2 ml de medio de mantenimiento iPSC con 10 μM Y-27632 agregados de antemano. NOTA: La relación de paso oscila entre 1:6 y 1:20 (aproximadamente 4 x 104 células/cm2), y el tamaño medio de agregación es de aproximadamente 50-200 μm.</li>
		<li>Cultivar las células hasta una confluencia del 80%-90% (5-6 días) a 37 °C, 5% de CO2 con cambio de medios de mantenimiento iPSC todos los días.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Diferenciación de las MSC de las hiPSC a través de la formación de EB
NOTA: El método se deriva de la literatura previa 21,22,23,24. En la Figura 1 se ilustra una descripción general del método. Las características del método se resumen en la Tabla 1.
<ol><li>Preparación del medio<ol><li>Prepare el medio de diferenciación de MSC suplementando α-MEM con 1% (v/v) de GlutaMAX, 10% (v/v) de FBS, 10 ng/mL de FGF2 y 5 ng/mL de TGFβ.</li>
		<li>Prepare el medio de mantenimiento MSC complementando α-MEM con 1% (v/v) de GlutMAX, 10% (v/v) de FBS y 1 ng/mL de FGF2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de hiPSCs<ol><li>Cultivo de líneas de hiPSCs (paso al menos 2-3 veces después de la descongelación) en medio de mantenimiento iPSC en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) a 37 °C, 5% de CO2 hasta 80%-90% de confluencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 0: Formación EB<ol><li>Retire el medio de mantenimiento iPSC de la placa de 6 pocillos. Lave los hiPSC una vez con DPBS.</li>
		<li>Añadir 700-800 μL de solución de EDTA 0,48 mM e incubar durante 1 min a RT, luego retirar la solución de digestión. Continuar incubando a 37 °C de temperatura durante 3-5 min.</li>
		<li>Cuando las células se digieren en láminas (no digiera las células en células individuales), agregue 2 ml de medio de mantenimiento de iPSC (que contiene 10 μM de inhibidor de roca y gel de matriz extracelular 1:100 GFR) para finalizar la digestión.</li>
		<li>Transfiera las celdas a una placa de fijación baja de 6 pocillos. Siembre las células en una proporción de 2 pocillos de placa de cultivo de tejidos por 1 pocillo de placa de fijación baja. Incubar las células en un agitador (60 rpm/min) a 37 °C, 5% CO2 durante 24 h para formar EBs esféricas.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 1-Día 7: Diferenciación EB<ol><li>Transfiera los EB al tubo de centrífuga con una pipeta Pasteur (sin destruir los EB) y deje que los EB se sedimenten naturalmente durante 5-10 minutos en RT. A continuación, retira el sobrenadante.</li>
		<li>Transfiera los EB a una placa de fijación baja de 6 pocillos con 2 ml de medio de diferenciación MSC. Cultivar los EB en el agitador a 37 °C, 5% CO2 durante 7 días con cambio medio una vez.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 8-Día 17: Inoculación de EB<ol><li>Transfiera los EB al tubo de centrífuga con una pipeta Pasteur (sin destruir los EB) y deje que los EB se sedimenten naturalmente durante 5-10 min. A continuación, retira el sobrenadante.</li>
		<li>Transfiera los EB a una placa de 6 pocillos recubierta de gel de matriz extracelular GFR con 2 mL de medio de mantenimiento MSC. Cultivo hasta un 90% de confluencia (~10 días) con cambio regular de medio después de la adhesión celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 18-Día 27: Maduración y expansión de las MSC<ol><li>Tratar el cultivo derivado de EB con una solución de disociación a 37 °C durante 5-10 min (el tiempo de digestión varía debido a la presencia de diferentes tipos de células).</li>
		<li>Cuando parte de las células se digieren en células individuales, agregue 2 ml del medio de mantenimiento MSC para terminar la digestión y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga. Lave las células restantes no digeridas una vez con DPBS y digiera nuevamente. Repita varias veces hasta que todas las células se digieran en células individuales. Centrifugar la suspensión celular a 250 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante.</li>
		<li>Siembre las células en una placa de cultivo recubierta de gelatina (aproximadamente 2 x 105 células/cm2). Cultivo hasta el 90% de confluencia en el medio de mantenimiento MSC con cambio regular del medio. Designe esta generación de celdas como pasaje 0 (P0) en este punto.</li>
		<li>Para que las MSC sean puras y maduras, continúe pasando las células dos veces en una proporción de división de 1:3 en aproximadamente 6 días. La mayoría de las células presentan una morfología similar a la de un fibroblasto (en forma de huso).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Diferenciación de las MSC de las hiPSC mediante cultivo monocapa
NOTA: El método se deriva de la literatura previa 25,26,27,28. En la Figura 1 se ilustra una descripción general de este método. Las características del método se resumen en la Tabla 1.
<ol><li>Preparación del medio<ol><li>Prepare el medio de mantenimiento MSC suplementando α-MEM con 1% (v/v) de GlutMAX, 10% (v/v) de FBS y 1 ng/mL de FGF2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de hiPSCs<ol><li>Cultivo de líneas de hiPSCs (paso al menos 2-3 veces después de la descongelación) en el medio de mantenimiento iPSC en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubierta con gel de matriz extracelular reducida en factor de crecimiento (TFG) (1:100) a 37 °C, 5% de CO2 hasta 50%-60% de confluencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 0-Día 13: Diferenciación por cultivos monocapa directos<ol><li>Retire el medio de mantenimiento iPSC de la placa de 6 pocillos.</li>
		<li>Añadir directamente 2 mL del medio de mantenimiento MSC y cultivar durante 14 días a 37 °C, 5% de CO2, con el medio cambiando todos los días.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 14-Día 35: Maduración de las MSCs por paso repetido<ol><li>Tratar los cultivos monocapa con una solución de disociación a 37 °C durante 5-10 min (el tiempo de digestión varía debido a la presencia de diferentes tipos de células).</li>
		<li>Cuando las células se digieren en células individuales, agregue 2 ml de medio de mantenimiento MSC para terminar la digestión y transfiera la suspensión celular al tubo de centrífuga. Lave las células restantes no digeridas una vez con DPBS y digiera nuevamente. Repita varias veces hasta que todas las células se digieran en células individuales. Centrifugar la suspensión celular a 250 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante.</li>
		<li>Siembre las células en una placa de cultivo recubierta de gelatina (aproximadamente 2 x 105 células/cm2). Cultivo hasta el 90% de confluencia en el medio de mantenimiento MSC con el medio cambia regularmente. Designe esta generación de celdas como pasaje 0 (P0) en este punto.</li>
		<li>Para que las MSC sean puras y maduras, continúe pasando las células 6 veces en una proporción de división de 1:3 en aproximadamente 18 días. La mayoría de las células presentan una morfología similar a la de un fibroblasto (en forma de huso).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análisis de antígenos de superficie de MSC impulsoras de hiPSC mediante citometría de flujo
NOTA: Al igual que los antígenos de superficie de las MSC derivadas de la médula ósea, las MSC que impulsan las hiPSC expresan CD105, CD73 y CD90, pero no expresan CD45, CD3429. Además, las hiPSC se pueden utilizar como células de control negativo. En la Figura 2 se muestra el análisis de antígenos de superficie de las MSC y las hiPSC impulsoras de hiPSC mediante citometría de flujo.
<ol><li>Tratar las MSC que impulsan hiPSC con una solución de disociación a 37 °C durante 2-3 min. Tratar las hiPSC con un reactivo de disociación EDTA de 0,48 mM e incubar durante 1 min a RT, luego retirar el reactivo de disociación. Continuar incubando a 37 °C de temperatura durante 3-5 min.</li>
	<li>Cuando las células se digieren en células individuales, agregue medio (medio de mantenimiento MSC a las MSC y medio de mantenimiento iPSC a las iPSC) para finalizar la digestión.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante.</li>
	<li>Lavar las celdas una vez con DPBS frío, centrifugar a 350 x g durante 5 min y luego retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Cuente y vuelva a suspender las células en una solución fría de FBS-DPBS al 10% (v/v) a 10 x 106 células/ml y distribuya 100 μl/tubo de suspensión celular (1 x 106 células/tubo) en tubos de centrífuga de 1,5 ml.</li>
	<li>Añadir 5 μL de solución bloqueadora del receptor Fc humano a 100 μL de suspensión celular. Incubar durante 5-10 min en RT para realizar un bloqueo inespecífico.</li>
	<li>Centrifugar a 350 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante. Lave las celdas dos veces con una solución fría de FBS-DPBS al 2% (v/v).</li>
	<li>Resuspender las células en 100 μL de solución fría de FBS-DPBS (v/v) al 2%.</li>
	<li>Agregue 5 μL (1 prueba) de anti-CD34-FITC y 5 μL (1 prueba) de anti-CD45-APC a la celda de 100 μL Suspensión. Agregue 5 μL (1 prueba) de anti-CD73-APC, 5 μL (1 prueba) de anti-CD90-FITC y 5 μL (1 prueba) de anti-CD105-PE a otro tubo de suspensión celular de 100 μL. Añadir 5 μL de FITC de control de isotipo de IgG1 humana, PE de control de isotipo de IgG1 humana y APC de control de isotipo de IgG1 humana al tercer tubo de suspensión celular de 100 μL. Incubar durante 15-20 minutos en hielo en la oscuridad. Mientras tanto, prepare cuentas de una sola mancha.</li>
	<li>Lave las celdas dos veces con una solución fría de FBS-DPBS al 2% (v/v).</li>
	<li>Añadir 300 μL de solución fría de FBS-DPBS (v/v) al 2% para resuspender las células, y filtrar a través de un filtro de malla de malla 200.</li>
	<li>Analice las muestras mediante citometría de flujo. Analizar la suspensión celular teñida con anticuerpos de control de isotipo y establecer la puerta. A continuación, analice la suspensión celular teñida con anticuerpos diana.</li>
</ol>5. Diferenciación osteogénica de las MSC que impulsan hiPSC
NOTA: Las MSC que impulsan hiPSC poseen un potencial de diferenciación osteogénica (Figura 3A, B). A continuación se presenta el protocolo para la diferenciación osteogénica.
<ol><li>Prepare el medio de inducción osteogénico suplementando α-MEM con 10% de FBS, 100 nM de dexametasona, 10 mM de beta-glicerofosfato y 100 μM de ácido ascórbico.</li>
	<li>Siembre 1 x 105 MSC en una placa de 48 pocillos recubierta de gelatina y cultive hasta que tenga una confluencia del 60%-70%.</li>
	<li>Retire el medio y agregue 0,3 ml de medio de inducción osteogénico. Cultivar las células en un medio de inducción osteogénico durante 14 días a 37 °C, 5% CO2, con cambio de medio cada 3 días.</li>
	<li>Retire el medio y lave con DPBS una vez.</li>
	<li>Añadir 0,3 mL de PFA al 4% e incubar a RT durante 30 min.</li>
	<li>Elimine el PFA. Enjuague las células con 0,3 ml de DPBS durante 10 min a RT y repita 3 veces.</li>
	<li>Retire el DPBS, agregue 0,2 ml de solución de tinción con rojo de alizarina e incube durante 30 minutos a RT.</li>
	<li>Retire la solución de tinción, enjuague las células con 0,3 ml de DPBS durante 10 min a RT y repita 3 veces.</li>
	<li>Observe la tinción de la deposición de calcio bajo un microscopio óptico.</li>
</ol>6. Diferenciación adipogénica de las MSC que impulsan hiPSC
NOTA: Las MSC que impulsan hiPSC poseen un potencial de diferenciación adipogénico (Figura 3C, D). A continuación se indica el protocolo para la diferenciación adipogénica.
<ol><li>Prepare un medio de inducción adipogénico suplementando α-MEM con 10% de FBS, 1 μM de dexametasona, 1 μM de IBMX, 10 μg/mL de insulina y 100 μM de indometacina. Prepare un medio de mantenimiento adipogénico suplementando α-MEM con 10% de FBS y 10 μg/mL de insulina.</li>
	<li>Siembre 1 x 105 MSC en una placa de 48 pocillos recubierta de gelatina y cultive hasta que la densidad celular alcance el 90%.</li>
	<li>Retire el medio y agregue 0,3 ml de medio de inducción adipogénico. Continuar cultivando las células en el medio de inducción adipogénico durante 4 días a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Retire el medio y agregue 0,3 ml de medio de mantenimiento adipogénico. Continuar cultivando las células en el medio de mantenimiento adipogénico durante 3 días a 37 °C, 5% de CO2.</li>
	<li>Repita los pasos 6.3 y 6.4 2-3 veces hasta la diferenciación y maduración de los adipocitos.</li>
	<li>Retire el medio y lave con DPBS una vez.</li>
	<li>Añadir 0,3 ml de PFA al 4% e incubar a RT durante 10 min. Retire el PFA y enjuague 2 veces con DPBS.</li>
	<li>Aplique la tinción Oli Red O según las instrucciones del fabricante y observe las gotas de lípidos bajo un microscopio óptico.</li>
</ol>7. Diferenciación condrogénica de las MSC que impulsan hiPSC
NOTA: Las MSC que impulsan hiPSC poseen un potencial de diferenciación condrogénica (Figura 3E, F). A continuación se presenta el protocolo para la diferenciación condrogénica.
<ol><li>Prepare el medio de inducción de condroblastos suplementando α-MEM con 10% de FBS, 100 nM de dexametasona, 1% de insulina-transferrina-selenio (ITS), 10 μM de ácido ascórbico, 1 mM de piruvato de sodio, 50 μg/mL de prolina, 0,02 nM de factor de crecimiento transformante β3 (TGFβ3) y 0,5 μg/mL de proteína morfogenética ósea 6 (BMP-6).</li>
	<li>Recoja 2,5 x 105 MSC impulsadoras de hiPSC y centrifugue las células a 150 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante. Suspender las células en 1 mL de α-MEM y luego centrifugar a 150 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante y suspender las células en 0,5 mL de medio de inducción condrogénico. Centrifugar las células a 150 x g durante 5 min.</li>
	<li>Desenroscar directamente la tapa y cultivar durante 21 días con inducción condrogénica, cambiar el medio cada 3 días a 37 °C, 5% CO2. Mueva suavemente el tubo de centrífuga para suspender los gránulos condrogénicos (sin destruir los gránulos condrogénicos) todos los días durante la diferenciación condrogénica.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y lave con 0,5 ml de PBS dos veces.</li>
	<li>Añadir 0,3 mL de PFA al 4% y fijar durante 24 h.</li>
	<li>La parafina incrusta los gránulos condrogénicos y luego los secciona (3 μm). Tiñe las secciones con azul de toluidina (1%) durante 30 min.</li>
	<li>Observar la matriz de condrocitos extracelulares bajo un microscopio óptico.</li>
</ol>

Caracterización de los antígenos de superficie y la capacidad de proliferación en las MSC que impulsan hiPSC

<ol><li>Weng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+senescence%3A+Hallmarks%2C+mechanisms%2C+and+combating+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stromal+cells%3A+One+name%2C+multiple+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multipotent stromal cells: One name, multiple identities.</a> Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).</li>
<li>Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+osteogenic+stem+cells%3A+in+vitro+cultivation+and+transplantation+in+diffusion+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Kinetics%22%5BJournal%5D)">Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers.</a> Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).</li>
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<li>Hua, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-intensity+pulsed+ultrasound+promotes+osteogenic+potential+of+iPSC-derived+MSCs+but+fails+to+simplify+the+iPSC-EB-MSC+differentiation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778(2022).</li>
<li>Dupuis, V., Oltra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+produce+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells%3A+Mesenchymal+stem+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+stem+cells.+A+Werner+syndrome+stem+cell+model+unveils+heterochromatin+alterations+as+a+driver+of+human+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging.</a> Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).</li>
<li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Fanconi+anemia+pathogenesis+and+therapeutics+using+integration-free+patient-derived+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4330(2014).</li>
<li>Kubben, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+the+antioxidant+NRF2+pathway+in+premature+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging.</a> Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).</li>
<li>Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+deficiency+reprogrammes+human+neural+stem+cells+towards+a+glioblastoma+stem+cell-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype.</a> Nature Communications. 6, 10068(2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+released+from+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+MSCs+facilitate+cutaneous+wound+healing+by+promoting+collagen+synthesis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 49(2015).</li>
<li>Hu, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+secreted+by+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells+attenuate+limb+ischemia+by+promoting+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10(2015).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+retain+adequate+osteogenicity+and+chondrogenicity+but+less+adipogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144(2015).</li>
<li>Wang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+results+in+downregulation+of+c-Myc+and+DNA+replication+pathways+with+immunomodulation+toward+CD4+and+CD8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells.</a> Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Kim, S., Kim, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem-like+cells+for+producing+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, se examinaron dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en MSC 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Ambos métodos fueron capaces de derivar MSCs a partir de hiPS...

Las células estromales mesenquimales (MSC) son células madre pluripotentes adultas derivadas delmesodermo 1. Las MSC están presentes en casi todos los tejidos conectivos2. Desde que las MSC fueron descubiertas por primera vez en la década de 1970 y aisladas con éxito de la médula ósea en 1987 por Friedenstein et al.3,4,5, se ha utilizado una variedad de tejidos somáticos humanos (incluidos fetales y adultos) para aislar MSC como hueso, cartílago, tendón, músculo, tejido adiposo y estroma de soporte hematopoyético 1,2,6,7. Las MSC demuestran una alta capacidad proliferativa y plasticidad para diferenciarse en muchos linajes de células somáticas y podrían migrar a tejidos lesionados e inflamados 2,8,9. Estas propiedades hacen de las MSC un candidato potencial para la medicina regenerativa10. Sin embargo, las MSC derivadas de tejido somático (st-MSC) están restringidas por la donación limitada, la capacidad proliferativa celular limitada, las variaciones de calidad y la preocupación por la bioseguridad para la posible transmisión de patógenos, si los hubiera, de los donantes11,12.
Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) se derivan de la reprogramación de células adultas con factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc), que tienen funciones similares a las de las células madre embrionarias13,14. Pueden autorrenovarse y poseer el potencial de diferenciarse en cualquier tipo de células somáticas, incluidas las MSC. En comparación con las st-MSC, las iPSC-MSC tienen la ventaja de un suministro ilimitado, menor costo, mayor pureza, conveniencia en el control de calidad, fácil producción a escala y modificación genética 15,16,17.
Debido a estas ventajas de las iPSC-MSC, se han reportado una variedad de métodos que impulsan las MSC a partir de iPSC. Estos métodos de diferenciación se han centrado en dos metodologías de cultivo: (1) la formación de cuerpos embrioides (EBs) y (2) el uso de cultivos monocapa 11,18,19,20. En este trabajo se caracterizó un enfoque representativo para cada una de las dos metodologías. Además, se accedió a comparaciones entre dos enfoques representativos basados en el tiempo, el costo, la capacidad proliferativa, la expresión de biomarcadores de MSC y la capacidad de diferenciación in vitro.

<table><tbody><tr><td>Kit de tinción rojo alizarina</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnología</td><td>C0148S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano-CD105 (PE)</td><td>Biolegend</td><td>323206</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano-CD34 (FITC)</td><td>Biolegend</td><td>343503</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano-CD45 (APC)</td><td>Biolegend</td><td>304011</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano-CD73( APC)</td><td>Biolegend</td><td>344006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano-CD90 (FITC)</td><td>Biolegend</td><td>328108</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Solarbio</td><td>A8100</td><td></td></tr><tr><td>BMP-6</td><td>Novoprotein</td><td>C012</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de nivel de dióxido de carbono</td><td>Crystal</td><td>CO-06UC6</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de compensación</td><td>BioLegend</td><td>424601</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Tecnología STEMCELL</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnología</td><td>ST1254</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp; medio</td><td>Servicebio</td><td>G4610</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>HAKATA</td><td>HS-FBS-500</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Stemcell</td><td>78003.1</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500-100G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>humano IgG1 control de isotipo APC</td><td>BioLegend</td><td>403505</td><td></td></tr><tr><td>control de isotipo de IgG1 humano FITC</td><td>BioLegend</td><td>403507</td><td></td></tr><tr><td>control de isotipo de IgG1 humano PE</td><td>BioLegend</td><td>403503</td><td></td></tr><tr><td>TGF-& beta humano; 1</td><td>Célula madre</td><td>78067</td><td></td></tr><tr><td>Humana TruStain FcX&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnología</td><td>ST1398</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Solarbio</td><td>SI9020</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnología</td><td>P3376</td><td></td></tr><tr><td>iPSC medio de mantenimiento</td><td>Tecnología STEMCELL</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>ITS Suplemento de medios</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnología</td><td>C0341-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, factor de crecimiento reducido</td><td>BD Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Oli Red O kit de tinción</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnología</td><td>C0158S</td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Solarbio</td><td>P0011</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; 3</td><td>Novoprotein</td><td>CJ44</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción azul de toluidina</td><td>Solarbio</td><td>G2543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme(1x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos de fijación ultra baja</td><td>Costar</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-66</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stemcell</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30265</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Solarbio</td><td>G8100</td><td></td></tr></tbody></table>

comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Las células estromales mesenquimales (MSC) son células madre pluripotentes adultas que se han utilizado ampliamente en medicina regenerativa. Dado que las MSC derivadas de tejidos somáticos están restringidas por la donación limitada, las variaciones de calidad y la bioseguridad, en los últimos 10 años se ha visto un gran aumento en los esfuerzos para generar MSC a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). Los esfuerzos pasados y recientes en la diferenciación de las hiPSC en MSC se han centrado en dos metodologías de cultivo: (1) la formación de cuerpos embrioides (EB) y (2) el uso del cultivo monocapa. Este protocolo describe estos dos métodos representativos para derivar MSC a partir de hiPSC. Cada método presenta sus ventajas y desventajas, incluyendo el tiempo, el costo, la capacidad de proliferación celular, la expresión de marcadores MSC y su capacidad de diferenciación in vitro. Este protocolo demuestra que ambos métodos pueden derivar MSC maduras y funcionales a partir de hiPSC. El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil, mientras que el método EB se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Siguiendo el protocolo (Figura 1A), las hiPSC se diferenciaron en MSC mediante los métodos de formación de EB y cultivo monocapa. Durante la diferenciación, las células mostraron diferentes morfologías representativas (Figura 1B,C).
Como se muestra en la Figura 1B, las colonias de hiPSCs muestran una morfología compacta típica antes de la diferenciación con un borde claro compuesto por cé...

Este protocolo describe y compara dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en células estromales mesenquimales (MSC). El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil. El método de los cuerpos embrioides (EB) se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...

El alcance de nuestro estudio es un mecanismo y una estrategia terapéutica de investigación de enfermedades genéticas. Nuestra investigación se basa en modelos de enfermedades multinivel, como líneas celulares, iPSC, organoides y ratones. Las iPSC tienen una clara ventaja sobre otros modelos.Las iPSC de los pacientes y cualquier célula y organoide derivado posterior comparten el mismo genoma con los pacientes, lo que proporciona un banco de células de pacientes y modelos para muchas enfermedades. Además, con los métodos de las iPSC establecidas, los pacientes están bastante maduros. Quedan muchos desafíos en la dirección de diferenciar las iPSC en células y organoides específicos, con una comprensión cada vez más profunda de los mecanismos de desarrollo en el desarrollo actual que se producirá en el campo.

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Biología

Este video describe un método in vitro para generar macrófagos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs). La generación de macrófagos a partir de iPSCs ocurre en tres etapas: (i) agregación de iPSCs en suspensión para formar cuerpos embrioides tridimensionales (EBs) que se diferencian en células mesodérmicas, (ii) formación de células precursoras de macrófagos a partir de las EBs diferenciadas, y (iii) diferenciación de las células precursoras de macrófagos en macrófagos...

Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en macrófagos

El artículo describe la metodología detallada para diferenciar eficazmente células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos mediante la modulación de la vía Wnt selectivamente, seguido por citometría de flujo análisis de marcadores de referencia para evaluar la homogeneidad e identidad de la población.

Alta Eficiencia Diferenciación de células madre pluripotentes humanas a cardiomiocitos y Caracterización por citometría de flujo

Con la intención de caracterizar los cambios en los miRNAs en células madre neurales humanas diferenciadas (hNSCs) describimos la diferenciación de hNSC en un sistema tridimensional, la evaluación de los cambios en la expresión de microRNA por la matriz de PCR de miRNA, y el análisis computacional para la predicción de objetivos de miRNA y su validación por ensayo de luciferasa dual.

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen la capacidad intrínseca para diferenciarse y auto-organizarse en patrones de tejidos distintos; aunque esto requiere la presentación de los gradientes ambientales espaciales. Presentamos micropatterning plantilla como un método simple y robusto para generar gradientes bioquímicas y mecánicas para el control de los patrones de diferenciación HPSC.

Stencil Micropatterning de las células madre pluripotentes para el sondeo Organización Espacial de la diferenciación Parcas

Aquí, se presenta un protocolo para la disección de cordón umbilical humano umbilical (CU) y la muestra de placenta fetal en cable de forro (CL), gelatina de Wharton (WJ), la unión de cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP) para el aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales (MSCs) utilizando la técnica de cultivo de explantes.

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

Aquí, presentamos un método para aprovechar eficientemente el potencial de diferenciación cardiaca de jóvenes fuentes de células madre mesenquimales humanas con el fin de generar las células funcionales, contratantes, cardiomiocitos-como en vitro.

In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

La generación de tipos de células diferenciadas a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) tiene una gran promesa terapéutica, pero sigue siendo un desafío. Los PSC a menudo exhiben una incapacidad inherente para diferenciar incluso cuando se estimulan con un conjunto adecuado de señales. Aquí se describe una herramienta sencilla para mejorar la diferenciación multilínea en una variedad de líneas PSC.

Tratamiento transitorio de células madre pluripotentes humanas con DMSO para promover la diferenciación

En este protocolo, describimos una estrategia de diferenciación estable y altamente eficiente para la generación de neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas. Este modelo hará que las neuronas estén disponibles para el uso de estudios de múltiples trastornos autonómicos.

Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

Este estudio informa un enfoque novedoso para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales basados en citometría de flujo y tinción doble con dos reporteros fluorescentes o anticuerpos para detectar cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la composición de la cadena respiratoria mitocondrial y el ADN mitocondrial.

Análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales en células madre pluripotentes inducidas por humanos y sus derivados neuronales y gliales

El protocolo permite la generación de una población de adipocitos puros a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). El ácido retinoico se utiliza para diferenciar las iPSC en células madre mesenquimales (MSC) que se utilizan para producir adipocitos. Luego, se utiliza un enfoque de clasificación basado en la tinción de rojo del Nilo para obtener adipocitos puros.

Diferenciación robusta de iPSCs humanas en una población pura de adipocitos para estudiar trastornos asociados a adipocitos

Este protocolo presenta la diferenciación de osteoclastos humanos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y describe métodos para la caracterización de osteoclastos y precursores de osteoclastos.

Diferenciación y caracterización de osteoclastos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas

Descubre dos métodos para diferenciar células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales: monocapa y cuerpos embrionoides. El método de monocapa muestra mayor eficacia en diferenciación osteogénica.

Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales (Video) | JoVE Journal

Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

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