Name: Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprende el protocolo de inoculación con vainas de maíz desprendidas para estudiar interacciones con patógenos fúngicos foliares. Este método permite obtener imágenes en tiempo real de células vivas sin necesidad de fijación.

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Los autores agradecen al USDA-NIFA por su apoyo financiero (números de subvención 2018-67013-28489 y 2020-70410-32901). Todas las opiniones, hallazgos, conclusiones o recomendaciones expresadas en este manuscrito pertenecen exclusivamente a los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. Agradecemos a la estudiante visitante de Ciencia Sin Fronteras de Brasil, Mayara de Silva, por las imágenes que aparecen en la Figura 6A y en la Figura 7D. También reconocemos al Departamento de Patología Vegetal de la Universidad de Kentucky por proporcionar acceso a los microscopios confocales Olympus.

NOTA: El flujo de trabajo del método se muestra en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig01.jpg"> Figura 1: Pasos del protocolo de inoculación optimizado utilizando vainas de hojas de maíz desprendidas. La preparación de la suspensión de esporas, la inoculación de la vaina foliar y la preparación de la muestra para la microscopía de células vivas se resaltan en los cuadros verde (A), púrpura (B) y naranja (C), respectivamente. Creado con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
1. Material vegetal y fúngico
<ol><li>Crecimiento de las plantas<ol><li>Cultive plántulas de maíz (ver Tabla de Materiales) en invernadero (14 h de luz/27 °C y 10 h de oscuridad/22 °C) en recipientes SC10 (ver Tabla de Materiales). Use un medio de cultivo que consista en tres partes de tierra para macetas comerciales (consulte la Tabla de materiales) y dos partes de tierra vegetal esterilizada con vapor.</li>
		<li>Riegue las plántulas durante 2 minutos con un sistema de riego por aspersión una vez al día, por la mañana.</li>
		<li>Coseche las plántulas en la etapa V2 cortándolas a nivel del suelo. La etapa de crecimiento V2 se alcanza cuando las plántulas miden de 5 a 10 cm de altura y tienen dos hojas visibles con collar21.</li>
		<li>Envuelva las plantas con una toalla de papel húmeda y colóquelas en una bolsa de plástico para transportarlas al laboratorio para su posterior procesamiento.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivos fúngicos<ol><li>Reactivar los cultivos madre de sílice fúngica almacenados en condiciones asépticas22rociando aproximadamente 50 gránulos de la sílice infestada en un medio de agar apropiado. Para evitar cambios morfológicos y pérdida de patogenicidad, las cepas del subcultivo no superan las 3 veces después de la reactivación. El agar papa dextrosa (PDA; ver Tabla de Materiales) se usa rutinariamente para cultivar C. graminicola, mientras que el agar avena (OA; ver Tabla de Materiales) se usa para S. maydis.</li>
		<li>Para preparar PDA para el cultivo de poblaciones de hongos, suspenda 19,5 g de PDA deshidratado preparado comercialmente en 500 mL de agua desionizada (DI). Para hacer artrosis, hierva 36 g de artrosis deshidratada preparada comercialmente en agua desionizada durante 15-30 minutos, filtre a través de tres capas de gasa y lleve el filtrado a 500 ml con agua desionizada. Medios de autoclave para esterilizar.</li>
		<li>Aumente el medio fundido y enfriado con un antibiótico apropiado (p. ej., higromicina B, genética) cuando trabaje con cepas transformantes. Las concentraciones finales de higromicina o genética en 500 mL de medio son 250 μg/mL y 100 μg/mL, respectivamente.</li>
		<li>Incubar los cultivos en condiciones óptimas hasta que se haya desarrollado un micelio esporulante. Colletotrichum graminicola y S. maydis crecen bien a 23 °C con luz fluorescente continua y niveles de humedad ambiental. La esporulación ocurre a los 7 días después de la inoculación (dai) para S. maydis o 14 dai para C. graminicola.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inoculación de la vaina foliar
<ol><li>Conjunto de la unidad de filtro de lana de vidrio<ol><li>Utilice tijeras o tijeras de alta resistencia para cortar la tapa y aproximadamente a 0,5 mm del fondo cónico de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (consulte la tabla de materiales).</li>
		<li>Coloque un pedazo de lana de vidrio (aproximadamente 0.5 cm x 0.5 cm; ver Tabla de Materiales) dentro del tubo cortado para cubrir el orificio central, como se muestra en la Figura 2.</li>
		<li>Use guantes mientras corta lana de vidrio, ya que el vidrio de borosilicato puede causar irritación.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de los bastidores de soporte de la vaina de las hojas.<ol><li>Corte una placa de PCR de 96 pocillos sin faldón (consulte la Tabla de materiales) en seis bastidores de soporte de dos columnas (8 x 2 pocillos) como se muestra en la Figura 3A.</li>
		<li>Voltee las rejillas de dos columnas de modo que los fondos cónicos de los pocillos miren hacia arriba y los superiores planos miren hacia abajo (Figura 3B).</li>
		<li>Coloque cada soporte en una placa de Petri de vidrio que contenga papel de filtro humedecido y cúbralo con la tapa (consulte la Tabla de materiales). Esta unidad funciona como una pequeña cámara de humedad para las vainas.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del inóculo<ol><li>Para cada cepa fúngica, coloque una unidad de filtro de lana de vidrio ensamblada en un tubo de microcentrífuga estéril intacto de 1,5 ml como se muestra en la Figura 2. Este último funciona como un tubo de recolección.</li>
		<li>Etiqueta los tubos.</li>
		<li>Coseche los conidios de los cultivos esporulados inundando primero cada placa con 3-4 ml de agua desionizada estéril. En algunos casos, puede ser necesaria más agua para producir una capa de líquido en la superficie de la colonia. Los agentes humectantes no son necesarios en este sistema.</li>
		<li>Afloje las esporas del agar usando un mortero estéril de punta cónica (consulte la Tabla de materiales) para raspar uniformemente en toda la placa.</li>
		<li>Aplique 1 ml de la suspensión de esporas a una unidad de filtro de lana de vidrio de forma aséptica y deje que las esporas fluyan por gravedad hacia el tubo de recolección.</li>
		<li>Centrifugar los tubos de recolección que contienen las suspensiones de esporas filtradas a 3.500 x g durante 5 min. Las esporas deben peletizarse en el fondo del tubo de microcentrífuga. NOTA: La centrifugación de esporas de C. graminicola a velocidades superiores a las recomendadas aquí da como resultado una pérdida significativa de viabilidad.</li>
		<li>Vierta el líquido en un recipiente esterilizable en autoclave, agregue 1 ml de agua desionizada estéril y agite suavemente para resuspender las esporas granuladas. Centrífuga como en el paso 2.3.6.</li>
		<li>Lave las esporas 3 veces para eliminar cualquier matriz conidial que pueda contener inhibidores automáticos que puedan reducir la germinación o la penetración.</li>
		<li>Después del tercer lavado, agregue 300-500 μL de agua desionizada estéril para resuspender las esporas para su cuantificación.</li>
		<li>Utilice un hemocitómetro bajo un microscopio compuesto con un aumento de 100x para determinar la concentración de esporas. No es necesario teñir las esporas antes de contar.</li>
		<li>Prepare una suspensión de 5 x 105 esporas/ml con agua desionizada estéril. NOTA: La suspensión de esporas de C. graminicola puede mantenerse a temperatura ambiente durante no más de 4 horas antes de una rápida pérdida de viabilidad. Refrigerar los conidios no aumenta la viabilidad.</li>
	</ol></li>
	<li>Inoculaciones de vaina<ol><li>Verifique las prácticas y procedimientos de bioseguridad pertinentes antes de inocular las plantas con cepas fúngicas.</li>
		<li>Retire la vaina de la primera hoja verdadera de las plántulas V2 pasando una uña del pulgar a lo largo del margen superpuesto de la vaina y aflójela suavemente del brote. Afloje la funda de ambos lados del brote antes de intentar quitarla.</li>
		<li>Corta las vainas de las hojas recuperadas en segmentos de 3-5 cm. No es necesario desinfectar las vainas antes de la inoculación.</li>
		<li>Desenrolle cada segmento muy suavemente para exponer la capa epidérmica interna (adaxial).</li>
		<li>Mientras prepara las vainas para la inoculación, mantenga las vainas restantes extirpadas envueltas con una toalla de papel húmeda para evitar la desecación.</li>
		<li>Coloque 20 μL de la suspensión de esporas de hongos en la superficie interna en el centro de la pieza de la vaina, directamente encima de la nervadura central, como se muestra en la Figura 4.</li>
		<li>Coloque las vainas de las hojas inoculadas horizontalmente, con la nervadura central colocada en la parte inferior, en el soporte dentro de una placa de Petri de vidrio que contenga un papel de filtro humedecido como se muestra en la Figura 5.</li>
		<li>Cada estante tiene capacidad para siete fundas. Inocular al menos cinco vainas por cepa para compensar la pérdida de réplicas que pueda producirse durante la preparación de la muestra o la incubación.</li>
		<li>Coloque las pequeñas cámaras de humedad en una caja de almacenamiento transparente forrada con papel de germinación humedecido (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Cubre la caja con la tapa. Incubar la caja a 23 °C con iluminación continua durante el tiempo previsto, que depende del hongo y de las etapas de desarrollo del hongo que se observarán. En la Tabla 1 se presenta un resumen de la evolución temporal de las vainas de maíz inoculadas con C. graminicola.</li>
		<li>Revise todos los días si hay signos / síntomas de enfermedad en las vainas y mantenga húmedos tanto la germinación como los papeles de filtro. Las vainas de las hojas pueden retenerse hasta 6 días sin que se produzca una muerte o degradación evidente de las células vegetales en ausencia de inoculación.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig02.jpg"> Figura 2: Preparación de la unidad de filtro de lana de vidrio. (A) Se coloca una bola de lana de vidrio de 0,5 cm x 0,5 cm dentro del tubo de microcentrífuga 1 al que se le quita el fondo cónico. (B-C) A continuación, el tubo de filtro se coloca en el tubo de microcentrífuga 2 para generar una unidad de filtro ensamblada para la preparación de la suspensión de esporas. Creado con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig03.jpg"> Figura 3: Método de corte de una placa de PCR de 96 pocillos sin faldón. (A) Placa de PCR cortada en seis bastidores de soporte, 8 x 2 pocillos. Un ejemplo de un solo soporte de vaina se muestra en (B). Las vainas de las hojas se colocan horizontalmente sobre el soporte. Creado con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig04.jpg"> Figura 4: Método de inoculación de la vaina. Una sola gota de inóculo aplicada directamente a la superficie adaxial de la sección de la vaina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65755/65755fig05.jpg"> Figura 5: Método de incubación de la vaina. Vainas de hojas inoculadas colocadas horizontalmente en una rejilla de soporte dentro de una placa de Petri de vidrio que contiene papel de filtro humedecido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65755/65755fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. Microscopía de células vivas
<ol><li>Preparación de muestras para microscopía<ol><li>Enjuague suavemente las piezas de la vaina con agua desionizada estéril para eliminar las esporas no adheridas o el crecimiento de hongos superficiales.</li>
		<li>Coloque la vaina en un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio (ver Tabla de Materiales) con la superficie adaxial (interior) de la pieza de la vaina hacia abajo y la superficie abaxial (exterior) hacia arriba.</li>
		<li>Utilice una nueva hoja de afeitar de un solo filo (consulte la Tabla de materiales) para recortar aproximadamente 1 cm de los extremos de la vaina y eliminar la mayor parte del tejido de la lámina a ambos lados de la nervadura central.</li>
		<li>Sostenga la hoja de afeitar en un ángulo de 90° con respecto a la vaina para afeitar el tejido de la nervadura central abaxial y exponer la capa epidérmica en la superficie adaxial por encima del punto inoculado. Trate de mantener un grosor uniforme. Una vez afeitadas las vainas de las hojas, no se recomienda recortar más, ya que esto puede dañar la muestra.</li>
		<li>Asegúrese de que las secciones afeitadas no tengan más de 1 cm x 1 cm de tamaño. Evite presionar el centro de la funda durante este proceso. Cuando trabaje con vainas inoculadas con diferentes suspensiones de esporas, desinfecte los guantes y cambie la hoja de afeitar entre muestras.</li>
		<li>Tenga listo un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio. Levante la sección de la funda desde un borde y transfiérala con cuidado a una nueva guía. La superficie inoculada (adaxial) de la vaina debe estar más arriba, más cerca de la lente del objetivo. Monte las secciones suavemente para evitar daños en las estructuras fúngicas.</li>
		<li>Aplique 60 μL de agua desionizada estéril a la sección y agregue un cubreobjetos de vidrio de 24 mm x 60 mm (ver Tabla de Materiales). Hazlo lentamente para evitar burbujas de aire.</li>
		<li>Cuando esté listo para la microscopía, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente (consulte la Tabla de materiales) colocando una pequeña gota en cada borde y luego conectando las gotas con un cepillo de esmalte de uñas para hacer un sellado perfecto. NOTA: Este protocolo de vaina se puede utilizar con tinciones citológicas, por ejemplo, 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), rojo neutro o azul de tripano, o para la observación de la plasmólisis celular para evaluar la viabilidad de las células vegetales. Para la tinción de la vaina o los ensayos de plasmólisis celular, no selle el cubreobjetos.</li>
		<li>Para los ensayos de plasmólisis, agregue una solución hipertónica (0,75 M de sacarosa o 1 M de cloruro de sodio) a un borde del cubreobjetos y use un papel de seda doblado sin pelusa para extraer la solución a través de la muestra hasta el otro borde del cubreobjetos. Para teñir, use un método similar para aplicar la solución de tinción.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopía de campo amplio<ol><li>Una vez que las vainas de las hojas estén montadas en portaobjetos de microscopio, inspecciónelas en busca de colonización fúngica utilizando un microscopio óptico de campo amplio con un aumento de 400x.</li>
		<li>Para observar las estructuras fúngicas en detalle, utilice un objetivo de inmersión en agua en lugar de aceite para obtener una mejor calidad de imagen de las muestras. La aberración esférica debida a un desajuste del índice de refracción puede causar degradación de la imagen. Los objetivos de agua están disponibles para microscopios ópticos de campo amplio, así como para microscopios confocal.</li>
		<li>Para determinar la cantidad relativa de colonización por vaina, cuente el número de células de maíz invadidas desde cada sitio de penetración fúngica utilizando un microscopio óptico de campo amplio con un aumento de 100x. Esta cuantificación es un paso de cribado adecuado antes de cualquier análisis estadístico que compare cepas, tratamientos y/o etapas de desarrollo.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopía de barrido láser confocal<ol><li>Para observar las proteínas fluorescentes en los tejidos de maíz durante el desarrollo de cepas fúngicas transgénicas, ajuste los parámetros básicos de adquisición de imágenes. Identifique los mejores ajustes de excitación/emisión en función del marcador fluorescente seleccionado. NOTA: Es preferible un objetivo de agua de 60x cuando se analizan fusiones fluorescentes construidas con proteínas secretadas. Los microscopios confocales modernos tienen objetivos de inmersión en agua altamente corregidos para evitar artefactos y aberraciones de forma.</li>
		<li>Si se pretende obtener imágenes de células vivas de proteínas fluorescentes, utilice cepas fúngicas no transformadas como controles de autofluorescencia. Utilice los siguientes parámetros de adquisición de imágenes para capturar la dinámica fúngico-huésped en un microscopio confocal invertido y para la proteína fluorescente mCherry. Ajuste la potencia del láser hasta el 5%, 450-600 de alto voltaje (HV) según el nivel de expresión, ganancia de 1.375X, desplazamiento del 3%, un factor de zoom óptico de 1 para el análisis de hasta cinco células de maíz por sección y un factor de zoom óptico de 2-5 para hifas individuales. NOTA: Las imágenes confocales Z-stack de alta resolución proporcionan datos tridimensionales y una mejor visión de las interacciones en tiempo real entre el huésped y el patógeno.</li>
		<li>Para la cuantificación de las intensidades de fluorescencia correspondientes a las proteínas de fusión secretadas, utilice un software de análisis de imágenes del fabricante confocal o un programa de procesamiento de imágenes como ImageJ, que se puede descargar gratuitamente en línea. Consulte un manual para obtener detalles sobre cómo cuantificar las señales fluorescentes en consecuencia.</li>
	</ol></li>
</ol>

Visualización de las interacciones celulares entre las vainas de maíz y los hongos

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos y nada que revelar.

El método optimizado de inoculación de la vaina foliar descrito aquí es una modificación de un protocolo original que se desarrolló y se ha aplicado a las vainas foliares de arroz 6,8,36. Permite observaciones directas y detalladas del crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas con microscopía de campo amplio o confocal. El protocolo es adecuado para la caracterización, comparación y cuantificación de una vari...

Los análisis espaciales y temporales a nivel celular son fundamentales para comprender la fisiología y la citología de las interacciones entre hongos y plantas. Los tejidos foliares que han sido fijados químicamente 1,2,3 o aclarados y teñidos4, así como las membranas artificiales5, se han utilizado en el pasado para investigar la citología del desarrollo de patógenos foliares y las interacciones planta-hongo. Sin embargo, la investigación de eventos de infección en tejidos vivos del huésped en tiempo real sin fijación o aclaramiento es un desafío debido a problemas técnicos relacionados con la preparación de muestras ópticamente transparentes para la obtención de imágenes.
A finales de la década de 1940 se desarrolló un protocolo de inoculación de la vaina de la hoja separada para la investigación microscópica de campo claro de la resistencia de las células epidérmicas vivas del arroz al hongo del brusone del arroz Magnaporthe oryza6. Más recientemente, las observaciones moleculares, fisiológicas y citológicas detalladas de la colonización del huésped por las especies Colletotrichum y Magnaporthe se han facilitado en gran medida mediante la combinación de versiones modificadas de este método de vaina foliar con transformadores fúngicos que expresan proteínas fluorescentes y protocolos de imágenes de células vivas de alto rendimiento, incluida la epifluorescencia y la microscopía confocal 7,8,9,10.11,12,13.
En este trabajo se detalla un protocolo de inoculación optimizado utilizando vainas foliares de maíz separadas para la observación de procesos de infección por patógenos fúngicos foliares hemibiotróficos y necrótrofos. Lo hemos utilizado específicamente para estudiar Colletotrichum graminicola (C. graminicola), el agente causal del tizón de la hoja y la pudrición del tallo de la antracnosis, y Stenocarpella maydis, que causa el tizón de la hoja y la pudrición del tallo por Diplodia. Sin embargo, el método debe ser aplicable a otros patógenos fúngicos foliares hemibiotróficos y necrótrofos. Las respuestas citológicas y fisiológicas durante los eventos de infección y colonización en estas vainas foliares extirpadas son similares a las de las láminas foliares enteras12,14,15. Además, la colonización hemibiotrófica de las células epidérmicas de la vaina por C. graminicola es similar a la colonización de las células de la médula del tallo16,17. Las vainas desprendidas muestran mayor sincronicidad y reproducibilidad experimental de la penetración y colonización fúngica que las láminas foliares o los tejidos de la médula del tallo14,16,17,18. La mayoría de las variedades de maíz se pueden utilizar para este protocolo. Sin embargo, los endogámicos o híbridos con exceso de pigmentos púrpuras en las vainas son menos adecuados, ya que los pigmentos interfieren con las imágenes. El maíz dulce del Jubileo de Oro ha sido particularmente útil para nuestros estudios porque las semillas no tratadas están disponibles comercialmente, las plantas son altamente susceptibles a muchas enfermedades foliares y crecen bien en el invernadero. Las primeras epidemias de pudrición del tallo por antracnosis en los Estados Unidos provocaron la pérdida total de las cosechas de maíz dulce en Indiana en la década de 197019,20. Este método de inoculación de la vaina foliar se puede aplicar para observar y cuantificar directamente el crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas frente a células vegetales muertas localmente, para demostrar reacciones de resistencia en respuestas compatibles/incompatibles a la infección fúngica y para probar las interacciones entre cepas fúngicas en la misma vaina en tiempo real.

<table><tbody><tr><td>Cámara microscópica monocromática Axiocam</td><td>ZEISS</td><td>426560-9010-000</td><td>Compatible con el microscopio Axioplan 2; Proporciona un bajo ruido de lectura y alta velocidad para la obtención de imágenes de células vivas</td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia Axioplan 2</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Permite la visualización en directo y la captura de imágenes/vídeos&nbsp; de muestras biológicas&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa 24 X 1,5/2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002431</td><td>Sorvall Legend Micro 17; Velocidad máxima: 13.300 rpm (17.000 x g)</td></tr><tr><td>Placa de Petri bacteriológica Falcon con tapa</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-105 Material de</td><td>poliestireno; superficie hidrofóbica</td></tr><tr><td>Papel de filtro&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-920-115</td><td>Whatman grado 1 para cámaras húmedas de placa de Petri</td></tr><tr><td>FV 3000 microscopio confocal de barrido láser</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Para la visualización de transformadores fúngicos'&nbsp;</td></tr><tr><td>Papel de germinación</td><td>Anchor Paper Co.</td><td>SD7615L</td><td>76 # peso pesado para cámaras húmedas de caja de plástico</td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidrio</td><td>VWR International</td><td>75845-542</td><td>Tipo 1 clase A, vidrio de borosilicato de 33 expansiones; juego completo (tapa + fondo), para cámaras húmedas de placa de Petri</td></tr><tr><td>Lana de vidrio&nbsp;</td><td>Especialidad química del valle de Ohio&nbsp;</td><td>3350</td><td>Para unidades de filtro de lana de vidrio</td></tr><tr><td>Hemocitómetro/cámara de recuento de Neubauer y cubreobjetos</td><td>VWR International</td><td>15170-172</td><td>0,1 mm de profundidad de la cámara; viene con dos cubreobjetos de 0,4 mm cubreobjetos de</td></tr><tr><td>microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-457&nbsp;</td><td>Vidrio de borosilicato; 100/paquete; 22 mm de largo, 22 mm de ancho</td></tr><tr><td>Cultivar de maíz Golden Jubilee seeds</td><td>West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canadá</td><td>CN361</td><td>Matures&nbsp; en 95-105 días; tipo de semilla: Tubos</td></tr> de <tr><td>microcentrífuga F1&nbsp;</td><td>Científico de EE. UU.&nbsp; &nbsp;</td><td>1415-2500</td><td>Capacidad de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-123&nbsp;</td><td>Corredera de lengüeta blanca Superfrost; 76 mm de largo, 25 mm de ancho</td></tr><tr><td>Agar de avena (OA)</td><td>VWR International</td><td>255210</td><td>Agar de avena Difco, BD; 500 g</td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>Revlon</td><td>43671</td><td>Esmalte de uñas transparente para sellar portaobjetos de microscopio; color 771 Transparente</td></tr><tr><td>Placa de PCR de 96 pocillos sin faldón</td><td>USA Sientific</td><td>1402-9500 Volumen de</td><td>placa de 100 uL</td></tr><tr><td>Mortero para tubos de microcentrífuga</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1415-5390</td><td>Punta cónica; material de polipropileno</td></tr><tr><td>PlanApo 60X/1,00 WLSM objetivo de agua&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>1-UB933</td><td>Compatible con el microscopio confocal Olympus FV 3000</td></tr><tr><td>Agar patata dextrosa (PDA)</td><td>VWR International</td><td>90000-758</td><td>Difco Medios de dextrosa patata, BD; 500 g</td></tr><tr><td>Pro-Mix BX</td><td>Premium Horticulture Supply Co.</td><td>N/A</td><td>Medio de cultivo premium de uso general formulado para proporcionar a&nbsp; equilibrio entre la retención de agua y el drenaje adecuado</td></tr> de <tr><td>los conos SC10&nbsp;</td><td>Megatienda de invernaderos&nbsp;</td><td>CN-SS-SC-10B</td> de <td>1,5 pulgadas de diámetro, 8,25 pulgadas de profundidad y un volumen de 164 mL</td></tr><tr><td>Bandeja de conos SC10</td><td>Invernadero Megastore&nbsp;</td><td>CN-SS-SCTR98</td><td>24 pulgadas de largo x 12 pulgadas de ancho x 6.75 pulgadas de alto; Sostiene hasta 98 de los conos SC10 Hoja de</td></tr><tr><td>afeitar de un solo filo Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-989-145</td><td>Hoja AccuTec; material de acero; hoja de 38 mm de longitud</td></tr><tr><td>Contenedores/cajas de almacenamiento con cierre de pestillo</td><td>Objetivo</td><td>002-02-0405</td><td>Cajas de almacenamiento de visión clara para cámara de humedad; Dimensiones exteriores: 23 5/8 pulgadas x 16 3/8 pulgadas x 6 1/2 pulgadas; Capacidad de 32 cuartos de galón</td></tr></tbody></table>

vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

Hemos optimizado un protocolo para inocular vainas foliares de maíz con hongos patógenos foliares hemibiotróficos y necrótrofos. El método es una modificación de uno aplicado originalmente a las vainas de las hojas de arroz y permite la observación microscópica directa del crecimiento y desarrollo de hongos en células vegetales vivas. Las vainas foliares recolectadas de plántulas de maíz con dos collares foliares completamente emergidos se inoculan con 20 μL de suspensiones de esporas fúngicas de 5 x 105 esporas/mL y se incuban en cámaras de humedad a 23 °C bajo luz fluorescente continua. Después de 24-72 h, el exceso de tejido se elimina con una cuchilla de afeitar para dejar una sola capa de células epidérmicas, una muestra ópticamente clara que se puede obtener directamente sin necesidad de fijación química o aclaramiento. Las células vegetales y fúngicas permanecen vivas durante la duración del experimento y las interacciones se pueden visualizar en tiempo real. Las vainas pueden teñirse o someterse a plasmólisis para estudiar la citología del desarrollo y la viabilidad de las células huésped y patógena durante la infección y la colonización. Las cepas fúngicas transformadas para expresar proteínas fluorescentes pueden ser inoculadas o co-inoculadas en las vainas para aumentar la resolución y facilitar la evaluación de interacciones competitivas o sinérgicas. Las cepas fúngicas que expresan proteínas de fusión fluorescentes se pueden utilizar para rastrear y cuantificar la producción y el objetivo de estas proteínas individuales en la planta. Los tejidos de la vaina inoculados se pueden extraer para caracterizar ácidos nucleicos, proteínas o metabolitos. El uso de estos ensayos de vaina ha hecho avanzar en gran medida los estudios detallados de los mecanismos de patogenicidad fúngica en el maíz y también de los efectores proteicos fúngicos y los metabolitos secundarios que contribuyen a la patogenicidad.

En los ejemplos siguientes se describen resultados representativos tras el uso del método de inoculación de la vaina foliar de maíz. Estos ejemplos demuestran la facilidad, velocidad y precisión con la que se puede observar y comparar las interacciones maíz-hongo en tiempo real con este ensayo optimizado. Las imágenes de células vivas también permiten la extracción de información cuantitativa, proporcionando una herramienta útil para estudios moleculares, citológicos y fisiológicos comparativos. Se pueden encontrar más d...

En este manuscrito se detalla un protocolo de inoculación optimizado que utiliza vainas de hojas de maíz desprendidas para estudios citológicos, fisiológicos y moleculares reproducibles de las interacciones del maíz con los patógenos fúngicos de las plantas. Las vainas de las hojas facilitan la observación en tiempo real de las interacciones celulares entre la planta viva y el hongo en tejidos no fijados.

Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz

We have optimized a protocol to inoculate maize leaf sheaths with hemibiotrophic and necrotrophic foliar pathogenic fungi. The method is modified from one ...

Por lo tanto, nuestro equipo tiene como objetivo comprender los mecanismos de patogenicidad de los hongos en las plantas para mejorar el manejo de enfermedades. Actualmente estamos explorando cómo el hongo autóctono del maíz regula la secreción de proteínas más allá de su función de limpieza. Nuestro protocolo muestra una alta sincronicidad entre las réplicas y la reproducibilidad de la colonización fúngica.Además, con nuestros ensayos, no es necesario limpiar o fijar las muestras antes de obtener imágenes de ellas en tiempo real. El método ofrece una variedad de aplicaciones en las interacciones planta-patógeno y contribuyó a estudios detallados sobre los mecanismos de patogenicidad fúngica en el maíz y análisis genómicos comparativos.

detached-maize-sheaths-for-live-cell-imaging-infection-fungal-foliar

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Planta defensinas juegan un papel importante en defensa de la planta contra patógenos. Para el uso efectivo de estos péptidos antifúngicos como antifúngicos, comprender sus modos de acción (MOA) es crítico. Aquí, se describe un método de proyección de imagen de células vivas para estudiar los aspectos críticos de MOA de estos péptidos.

Imágenes de células vivas de células fúngicas a investigar los modos de entrada y localización subcelular de defensinas de plantas antifúngicas

Se presenta un protocolo de inyección (agroinyección) a base de Agrobacterium para la inoculación del virus del mosaico de la cola de zorro y los clones del virus del mosaico de la caña de azúcar en las plántulas de maíz. La inoculación de esta manera conduce a la infección viral, el silenciamiento génico inducido por virus de los genes marcadores y la sobreexpresión viral de GFP.

Agroinoculación directa de plántulas de maíz por inyección con clones infecciosos recombinantes del virus del mosaico de la cola de zorro y virus del mosaico de la caña de azúcar

Este es un protocolo sencillo de un ensayo de vaina de hoja de cebada que utiliza reactivos mínimos y equipo de laboratorio común (incluido un teléfono inteligente básico). El propósito es visualizar el proceso de infección temprana de la enfermedad blástica en laboratorios sin acceso a equipos avanzados de microscopía.

Visualización de los sitios de infección temprana de la enfermedad por explosión de arroz (Magnaporthe oryzae) en cebada (Hordeum vulgare) usando un microscopio básico y un teléfono inteligente

Los primordios de hojas de maíz están profundamente enfundados y enrollados, lo que los hace difíciles de estudiar. Aquí, presentamos métodos para preparar secciones transversales y montajes enteros desenrollados de primordios de hojas de maíz para imágenes fluorescentes y confocales.

Métodos mejorados para preparar secciones transversales y montajes enteros desenrollados de primordios de hojas de maíz para imágenes de fluorescencia y confocales

Este protocolo de inmunolocalización en los meiocitos de maíz macho mantiene la integridad tridimensional de las células durante la meiosis. Permite el seguimiento dinámico de la localización intracelular de hasta tres anticuerpos independientes en material preservado fijado con paraformaldehído, además de DAPI, que tiñe el ADN.

Inmunolocalización tridimensional en meiocitos de maíz

Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Aquí se presenta un método conveniente y poderoso para estudiar la autofagia en Penicillium chrysogenum mediante el uso de almohadillas de inanición (mezclas de agarosa y agua del grifo en un portaobjetos de microscopio que contiene una cavidad central).

Análisis de la autofagia en<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por la inanición Pads en combinación con microscopía de fluorescencia

El Sistema Inducible de Raíces Laterales (LRIS) permite la inducción sincrónica de raíces laterales y se presenta para Arabidopsis thaliana y maíz.

Lateral sistema inducible Raíz en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Y maíz

La amebas social Dictyostelium discoideum se ha establecido recientemente como un sistema para estudiar el mal plegamiento de proteínas y la proteostasis. Aquí, describimos una nueva metodología basada en imágenes para estudiar la agregación de proteínas inducida por la temperatura y la respuesta al estrés celular en D. discoideum.

Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso de imágenes de células vivas con temperatura controlada

Aprende el protocolo de inoculación con vainas de maíz desprendidas para estudiar interacciones con patógenos fúngicos foliares. Este método permite obtener imágenes en tiempo real de células vivas sin necesidad de fijación.

Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz (Video) | JoVE Journal

Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz

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