Name: Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprende a visualizar redes de microtúbulos en uniones neuromusculares y células musculares de larvas de Drosophila melanogaster mediante microscopía confocal. Este protocolo facilita el análisis genético de proteínas reguladoras del citoesqueleto neuronal.

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Agradecemos al Dr. Ying Xiong por las discusiones y comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo de una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias de China (NSFC) a C. M. (31500839).

1. Disección de larvas
NOTA: La solución diseccionadora de solución salina similar a la hemolinfa (HL3.1)18 y la solución de fijación al 4% de paraformaldehído (PFA)19,20 se utilizan a temperatura ambiente porque los microtúbulos se despolimerizan cuando la temperatura es demasiado baja.
<ol><li>Escoge una larva errante de3er estadio con pinzas largas y romas. Lávelo con HL3.1 y colóquelo en la placa de disección bajo el microscopio estereoscópico. NOTA: La larva errante del3er estadio se identifica por el espiráculo anterior ramificado y se arrastra alrededor del tubo aproximadamente a 96 h (25 °C)21.</li>
	<li>Coloque la larva con el lado dorsal o ventral hacia arriba. Identifique el lado dorsal por las dos tráqueas largas y el ventral por los cinturones dentículos abdominales.<ol><li>Dependiendo del tejido a observar, opta por la disección dorsal o ventral. Esto permitirá una visión más precisa y detallada del área específica de interés. Para la observación de la NMJ y de las células musculares, abra las regiones dorsal y ventral de las larvas, respectivamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Sujeta con alfileres los ganchos de la boca y la cola. Ajuste los alfileres para mantener la larva en un estado prolongado. Añade una gota de HL3.1 a la larva para evitar que se seque. NOTA: Se puede utilizar HL 3.1 libre de Ca2+ para minimizar la contracción de los músculos durante la disección.</li>
	<li>Use las tijeras de disección para hacer un pequeño corte transversal cerca del extremo posterior, pero no corte el extremo posterior. Luego corte a lo largo de la línea media ventral hacia el extremo anterior.</li>
	<li>Inserte cuatro alfileres de insectos en las cuatro esquinas de la larva. Reajuste los alfileres de insectos de modo que la larva se estire al máximo en todas las direcciones.</li>
	<li>Use las pinzas para extirpar los órganos internos sin dañar los músculos.</li>
</ol>2. Fijación
<ol><li>Añadir 100 μL de PFA (4%) para sumergir las canales durante 40 minutos mientras las canales aún están fijadas en la placa de disección. PRECAUCIÓN: Se toman medidas de protección efectivas para evitar el contacto directo con la piel o la inhalación, ya que el PFA es un peligro.</li>
	<li>Desmonte los pasadores y transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Enjuague el PFA con 1 solución salina tamponada con fosfato que contenga 0,2 % de Triton X-100 (0,2 % PBST) para llenar el tubo de microcentrífuga de 2 ml durante 10 min en el agitador decolorante a 15 rpm. Repita el proceso de lavado 5 veces.</li>
</ol>3. Inmunocitoquímica
<ol><li>Sumergir las canales en agente bloqueante (suero de cabra al 5% en PBST al 0,2%) y bloquear durante 40 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retirar el agente bloqueante y sustituirlo por 200 μL del anticuerpo primario (p. ej., anti-α-tubulina, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) diluido con PBST al 0,2% a 4 °C durante la noche. Visualizar los microtúbulos musculares mediante inmunotinción con anti-α-tubulina monoclonal. El anti-Futsch puede reflejar indirectamente la morfología de los microtúbulos en la NMJ.</li>
	<li>Después de la incubación del anticuerpo primario, lavar las larvas con PBST al 0,2% durante 10 min. Repetir 5 veces.</li>
	<li>Incubar las larvas con 200 μL de anticuerpo secundario (p. ej., anti-Mouse-488 de cabra, 1:1000) diluido con PBST al 0,2% a temperatura ambiente durante 1,5 h en la oscuridad.</li>
	<li>A continuación, agregue un colorante nuclear como yoduro TO-PRO(R) 3 (T3605) a una concentración de 1:1000 en el tubo de incubación durante 30 min al teñir los microtúbulos en la oscuridad20,22.</li>
	<li>Enjuague el anticuerpo secundario y el colorante nuclear con PBST al 0,2% durante 10 min. Repita 5 veces en la oscuridad.</li>
</ol>4. Montaje
<ol><li>Coloque el cadáver de la larva en PBST al 0,2% en un portaobjetos de vidrio y ajústelo bajo el microscopio estereoscópico. Asegúrese de que la superficie interna del cadáver de la larva esté hacia arriba y que todos los cadáveres de las larvas estén dispuestos como se desee.</li>
	<li>Absorba el exceso de solución PBST con una toallita y agregue suavemente una gota de medio de montaje antidecoloración.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos en el portaobjetos para cubrir las larvas disecadas lenta y suavemente para evitar burbujas.</li>
	<li>Aplica esmalte de uñas alrededor del cubreobjetos. Coloque el portaobjetos en el espacio oscuro para reducir la atenuación fluorescente.</li>
</ol>5. Adquisición de imágenes
<ol><li>Para adquirir las imágenes, utilice un microscopio confocal de barrido láser, seleccione el objetivo de inmersión en aceite de 60x (apertura numérica 1,42) o similar, y ajuste la potencia del láser y la longitud de onda en función del experimento.</li>
	<li>Para identificar la NMJ, capture imágenes en el músculo 4 en el segmento A3 (como se muestra en la ubicación de la Figura 1F). Seleccione un láser de 488 nm para activar la α-tubulina o Futsch y 543 nm para activar la pista de imágenes HRP. Ajuste los parámetros a un tamaño de fotograma de 800 píxeles x 800 píxeles, un zoom digital de 2,0 y un intervalo de imagen de 0,8 μm en NMJ (Figura 2).</li>
	<li>Para identificar los microtúbulos en el músculo, capture imágenes del músculo 2 en el segmento A3-A5 (como se muestra en la ubicación de la Figura 1G) ya que tiene menos ramas traqueales. Elija un láser de 488 nm para activar la α-tubulina y un láser de 635 nm para activar la pista de imágenes T3605. Ajuste los parámetros a un tamaño de fotograma de 1024 píxeles x 1024 píxeles, un zoom digital de 3,0 y un intervalo de imagen de 0,4 μm en células musculares (Figura 3).</li>
</ol>

Visualización de redes de microtúbulos en uniones neuromusculares y células musculares de Drosophila

<ol><li>Halpain, S., Dehmelt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP1+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP1 family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 7 (6), 224(2006).</li>
<li>Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+microtubule-associated+protein+2+%28MAP2%29+and+its+relevance+for+the+regulation+of+the+neuronal+cytoskeleton+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function.</a> Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).</li>
<li>Dehmelt, L., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAP2%2FTau+family+of+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 6 (1), 204(2005).</li>
<li>Roll-Mecak, A., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing enzymes.</a> Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).</li>
<li>Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-depolymerizing+kinesins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-depolymerizing kinesins.</a> Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).</li>
<li>Bramblett, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+tau+phosphorylation+at+Ser396+in+Alzheimer%27s+disease+recapitulates+development+and+contributes+to+reduced+microtubule+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding.</a> Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).</li>
<li>Van Vactor, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+morphogenesis%2C+active+zone+organization+and+structural+plasticity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).</li>
<li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch%2F22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).</li>
<li>Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Futsch+regulates+synaptic+microtubule+organization+and+is+necessary+for+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth.</a> Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).</li>
<li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Wnt%2C+wingless%2C+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111 (3), 319-330 (2002).</li>
<li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).</li>
<li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).</li>
<li>Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+katanin+in+severing+microtubules+in+the+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron.</a> The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidgetin+regulates+cultured+astrocyte+migration+by+severing+tyrosinated+microtubules+at+the+leading+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge.</a> Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).</li>
<li>Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Tau+and+taxol+on+polymerization+of+MCF7+microtubules+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro.</a> International journal of molecular sciences. 23 (2), 677(2022).</li>
<li>Velasco, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+depolymerization+contributes+to+spontaneous+neurotransmitter+release+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro.</a> Communications biology. 6 (1), 488(2023).</li>
<li>Höög, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+reveals+a+flared+morphology+on+growing+microtubule+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends.</a> Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+mutations+rescue+human+tau-induced+microtubule+defects+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Mao, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-severing+protein+Katanin+regulates+neuromuscular+junction+development+and+dendritic+elaboration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila.</a> Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Tubulin-specific+chaperone+E+functions+at+neuromuscular+synapses+and+is+required+for+microtubule+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation.</a> Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).</li>
<li>Sarthi, J., Elefant, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dTip60+HAT+activity+controls+synaptic+bouton+expansion+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PloS one. 6 (10), 26202(2011).</li>
<li>Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+factor+essential+for+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A protein factor essential for microtubule assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hereditary+spastic+paraplegia+gene%2C+spastin%2C+regulates+microtubule+stability+to+modulate+synaptic+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function.</a> Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se describe un protocolo para la disección e inmunotinción de las uniones neuromusculares y las células musculares de las larvas de Drosophila . Hay varios puntos esenciales a tener en cuenta. En primer lugar, evitar lesiones en los músculos observados es crucial durante el proceso de disección. Puede valer la pena arreglar el filete antes de extraer los órganos internos para evitar el contacto directo entre las pinzas y los músculos. Para evitar daños musculares o la separación de la epidermis larvaria, es...

Los microtúbulos (MT), como uno de los componentes estructurales del citoesqueleto, desempeñan un papel importante en diversos procesos biológicos, incluida la división celular, el crecimiento y la motilidad celular, el transporte intracelular y el mantenimiento de la forma celular. La dinámica y la función de los microtúbulos están moduladas por interacciones con otras proteínas, como MAP1, MAP2, Tau, Katanin y Kinesin 1,2,3,4,5.
En las neuronas, los microtúbulos son esenciales para el desarrollo y mantenimiento de axones y dendritas. Las anomalías en los microtúbulos conducen a la disfunción e incluso a la muerte de las neuronas. Por ejemplo, en el cerebro de los pacientes con Alzheimer, la hiperfosforilación de la proteína Tau reduce la estabilidad de la red de microtúbulos, causando irregularidades neurológicas6. Por lo tanto, el examen de las redes de microtúbulos contribuirá a la comprensión del neurodesarrollo y la patogénesis de las enfermedades neurológicas.
La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis periférica formada entre el terminal axonal de una neurona motora y una fibra muscular, que es un excelente y potente sistema modelo para estudiar la estructura y las funciones sinápticas7. Futsch es una proteína de Drosophila que es homóloga a la proteína de unión a microtúbulos MAP1B que se encuentra en los mamíferos8. Se expresa solamente en las neuronas y desempeña un papel en el desarrollo de los botones sinápticos de la NMJ 8,9. En el tipo salvaje, los haces filamentosos que corren a lo largo del centro de los procesos NMJ se visualizan mediante inmunotinción con anti-Futsch. Al llegar al final de NMJ, este haz tiene la capacidad de formar un bucle formado por microtúbulos o de perder su estructura filamentosa, lo que da lugar a un aspecto difuso y punteado10. Los bucles de microtúbulos se asocian con conos de crecimiento en pausa, lo que sugiere que la matriz de microtúbulos es estable11. Por lo tanto, podemos determinar indirectamente el desarrollo estable de microtúbulos en NMJ mediante tinción de Futsch. El gran tamaño de las células musculares de la larva de Drosophila permite una visualización clara de la red de microtúbulos. Los factores que afectan la estabilidad de la red de microtúbulos se pueden encontrar analizando la densidad y la forma de los microtúbulos. Al mismo tiempo, el estado de la red de microtúbulos de las células musculares se puede verificar de forma cruzada con el resultado de la NMJ para obtener conclusiones más completas.
Se han empleado muchos protocolos para investigar la red y la dinámica de los microtúbulos. Sin embargo, estas investigaciones muchas veces se han centrado en estudios in vitro 12,13,14,15,16. Alternativamente, algunos experimentos in vivo han empleado microscopía electrónica para detectar el citoesqueleto17. De acuerdo con la unión específica de anticuerpos marcados con fluorescencia o colorantes químicos a proteínas o ADN, los métodos aquí presentados permiten la detección de redes de microtúbulos en NMJ a nivel de neuronas individuales in vivo, con resultados corroborados por observaciones en células musculares. Este protocolo es simple, estable y repetible cuando se combina con las poderosas herramientas genéticas disponibles en Drosophila melanogaster, lo que permite una amplia gama de exámenes fenotípicos y exámenes genéticos para el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso in vivo.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor Plus 405 phalloidin</td><td>invitrogen</td><td>A30104</td><td>diluido 1:200</td></tr><tr><td>Medio de montaje antidecoloración mejorado</td><td>Beyotime</td><td>P0128M</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW Microscopio confocal</td><td>Olympus Goat</td> anti-Mouse, Alexa <td></td><td></td></tr><tr><td>Fluor 488 conjugado</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11001</td><td>diluido 1:1.000</td></tr><tr><td>Microscopio confocal láser LSM 710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors</td><td>66vision</td><td>54138B</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Futsch de ratón</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas&nbsp; &nbsp;</td><td>22C10</td><td>diluido 1:50</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-&alfa;-tubulina de ratón</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td>diluido 1:1.000</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Wako</td><td>168-20955</td><td>Concentración final: 4% en PB Tampón</td></tr><tr><td>de acero inoxidable Minutien Pins</td><td>Entomoravia</td><td></td><td>0.1mm</td></tr><tr><td>Diam Microscopio estereoscópico SMZ161</td><td>Motic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluorescencia estereoscópica microscopio BX41</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Cabra conjugada roja anti-HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>diluido 1:100</td></tr><tr><td>TO-PRO(R) 3 yoduro</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>diluido 1:1.000</td></tr><tr><td>Transfer agitador decolorante TS-8</td><td>Kylin-Bell instrumentos de laboratorio</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>BioFroxx</td><td>1139</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas&nbsp;</td><td>Dumont</td><td>500342</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de la unión neuromuscular de las larvas de drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

La red de microtúbulos es un componente esencial del sistema nervioso. Las mutaciones en muchas proteínas reguladoras de los microtúbulos se asocian con trastornos del neurodesarrollo y enfermedades neurológicas, como la proteína Tau asociada a microtúbulos a enfermedades neurodegenerativas, la proteína cortante de microtúbulos Spastin y Katanin 60 causan paraplejia espástica hereditaria y anomalías del neurodesarrollo, respectivamente. La detección de redes de microtúbulos en las neuronas es ventajosa para dilucidar la patogénesis de los trastornos neurológicos. Sin embargo, el pequeño tamaño de las neuronas y la densa disposición de los haces de microtúbulos axonales dificultan la visualización de las redes de microtúbulos. En este estudio, describimos un método para la disección de la unión neuromuscular larvaria y las células musculares, así como la inmunotinción de α-tubulina y la proteína Futsch asociada a microtúbulos para visualizar redes de microtúbulos en Drosophila melanogaster. La unión neuromuscular nos permite observar los microtúbulos pre y postsinápticos, y el gran tamaño de las células musculares en la larva de Drosophila permite una visualización clara de la red de microtúbulos. Aquí, mutando y sobreexpresando Katanin 60 en Drosophila melanogaster, y luego examinando las redes de microtúbulos en la unión neuromuscular y las células musculares, revelamos con precisión el papel regulador de Katanin 60 en el neurodesarrollo. Por lo tanto, combinado con las poderosas herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Demostramos un procedimiento paso a paso para visualizar la red de microtúbulos tanto en las uniones neuromusculares (NMJ) como en las células musculares. Después de la disección de acuerdo con el diagrama esquemático (Figura 1A-E), se realiza la inmunotinción y posteriormente se observan las imágenes y se recogen bajo un microscopio confocal láser o un microscopio de fluorescencia estereoscópica (Figura 1F, G).
<p class="jo...

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

Actualmente, la dinámica de los microtúbulos se observa indirectamente a través de proteínas de unión a microtúbulos como EB1. Dado que los heterodímeros de tubulina alfabéticos son abundantes en el citoplasma, se pliegan directamente, los heterodímeros de tubulina vecinos carecen de la dinámica de las redes de microtúbulos in vivo. Nuestro protocolo visualiza los microtúbulos en las sinapsis neuromusculares y las células musculares.Cuando se combina con las poderosas herramientas genéticas disponibles en Drosophila melanogaster, permite una amplia gama de exámenes fenotípicos y el cribado genético del papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso in vivo. Nuestra investigación se centra en la relación entre el citoesqueleto y el neurodesarrollo, así como sus implicaciones para las enfermedades neurológicas. Esperamos descubrir el mecanismo del neurodesarrollo y la partenogénesis de las enfermedades neurológicas destacando el efecto de las proteínas reguladoras del citoesqueleto en las neuronas.

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Research

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Neuroscience

Neurociencia

Drosophila larval NMJ Disección

Este protocolo muestra cómo realizar técnicas de inmunohistoquímica sobre disecados larvas de Drosophila.

Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

A continuación se describen los métodos electrofisiológicos para la medición de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. Liberación evocada se inicia artificialmente mediante la estimulación de los axones de la neurona motora, y la transmisión a través de la UNM se puede medir por la respuesta postsináptica evocado en el músculo.

Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila

Se describen las características estructurales de la sinapsis neuromuscular Glia-en una nueva preparación de tejidos de adentro hacia afuera de las larvas de mosca en directo con tintes fluorescentes con microscopía confocal. Hemos marcado terminales de las neuronas en vivo con anticuerpos fluorescentes primaria de HRP, y también se visualiza el espacio perisynaptic con dextranos fluorescentes.

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

Este protocolo describe un método fiable para la anestesia y la imagen intacta...

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

Para entender cómo las formas complejas de células, como las dendritas neuronales, se obtienen durante el desarrollo, es importante ser capaz de precisión organización de microtúbulos ensayo. Aquí se describe un método robusto de etiquetado inmunohistoquímico para examinar la organización de microtúbulos de las dendritas arborización dendrítica neurona sensorial, la tráquea, músculos y...

Etiquetado inmunohistológica de microtúbulos en las dendritas neurona sensorial, tráqueas y los músculos en el Drosophila Larva pared del cuerpo

La unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) se utiliza como modelo para estudiar la morfología y función de las sinapsis. Este video describe características importantes que los investigadores cuantifican para caracterizar el NMJ. El protocolo de ejemplo muestra un software capaz de realizar la cuantificación automáticamente.

Drosophila Cuantificación de la unión neuromuscular (NMJ): un método para evaluar la morfología y la función sináptica

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Este informe proporciona un nuevo procedimiento de preparación de muestras para visualizar las uniones neuromusculares en larvas de Drosophila . Este método es más eficaz para evitar el enroscamiento de las muestras en comparación con el método tradicional y es particularmente útil para el análisis ultraestructural de la unión neuromuscular de Drosophila .

Optimización del proceso de preparación de muestras para la microscopía electrónica de transmisión de uniones neuromusculares en larvas de Drosophila

Aprende a visualizar redes de microtúbulos en uniones neuromusculares y células musculares de larvas de Drosophila melanogaster mediante microscopía confocal. Este protocolo facilita el análisis genético de proteínas reguladoras del citoesqueleto neuronal.

Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

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