Name: Aplicación de la tinción de mitocondrias vivas en la clasificación celular para purificar hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprende a purificar hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas mediante tinción de mitocondrias vivas y FACS. Este método alcanza 97% de pureza sin modificación genética para aplicaciones en medicina regenerativa.

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Este trabajo contó con el apoyo de la subvención número [23390072] del Ministerio de Educación, Cultura, Deporte, Ciencia y Tecnología.

En este estudio se utilizaron células iPS humanas obtenidas comercialmente (cepa 253G1) (véase la Tabla de Materiales).
1. Mantenimiento de las células iPS humanas
<ol><li>Mantener las células iPS humanas en condiciones libres de alimentador en medio AK02 en placas de cultivo recubiertas con iMatrix-511 de 0,25 μg/cm2 (ver Tabla de Materiales).</li>
</ol>2. Diferenciación hepática de células iPS humanas en cultivos 2D
NOTA: Consulte la Figura 1A para ver el programa diario de diferenciación hepática. A lo largo del proceso, use placas de cultivo de 6 pocillos y agregue 2 mL del medio de lavado o cultivo designado a cada pocillo. Mantener la condición de cultivo celular al 100% de humedad, 5% de CO2 y 20% deO2 a 37 °C.
<ol><li>Cubra cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 mL de matriz de membrana basal (diluida 1/25 en PBS (-)), e incube a 37 °C durante 1 h.</li>
	<li>Pase las células iPS humanas a la placa recubierta a una densidad de 20.000-30.000 células/cm² utilizando el medio AK02N suplementado con 10 μM de inhibidor de ROCK (Y-27632) (ver Tabla de Materiales). Reemplace el medio sin Y-27632 al día siguiente y cultive durante 2 días adicionales.</li>
	<li>Lave las celdas una vez con el medio RPMI-1640. Iniciar la diferenciación del endodermo sustituyendo el medio por RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% de insulina B27 + 1% de dipéptido L-Alanil-L-glutamina) suplementado con 3-6 μM de CHIR-99021 y 100 ng/mL de activina A durante 24 h (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Sustituya el medio por RPMI-B27-Glu suplementado con 50 ng/mL de Activina A durante 24 h.</li>
	<li>Para inducir la diferenciación de los progenitores hepáticos, reemplace el medio con RPMI-B27-Glu suplementado con dimetilsulfóxido (DMSO) al 1% durante 5 días.</li>
	<li>Para promover la maduración de los hepatocitos, cambie a un medio de maduración de hepatocitos: medio L-15 de Leibovitz que contiene 10 μM de hidrocortisona 21-hemisuccinato, 8,3% de caldo de fosfato de triptosa, 100 nM de dexametasona (DEX), 50 μg/mL de sodio-L-ascorbato, 0,58% de insulina-transferrina-selenio (ITS), 8,3% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de dipéptido L-Alanil-L-glutamina y 100 nM N-Hexanoico-Try-Ile-(6)-amino amida hexanoica (Dihexa) (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Cambie el medio cada 2 días durante 20 días. Ordene las celdas aproximadamente 27 días después de iniciar la diferenciación.</li>
</ol>3. Preparación celular para la purificación de hepatocitos derivados de células iPS humanas
<ol><li>Lave las células hepáticas diferenciadas con 2 mL de PBS (-) por pocillo.</li>
	<li>Agregue 1 mL de solución enzimática por pocillo, que incluye 0.1% de colagenasa, 0.083% de tripsina, 10 μM de inhibidor de ROCK (Y-27632), 20 nM de ciclosporina A y 50 μg/mL de sodio-L-ascorbato en tampón Ads (116 mM de NaCl, 12.5 mM de NaH2PO4, 20 mM de HEPES, 5.4 mM de KCl, 5.6 mM de glucosa y 0.8 mM de MgSO4; pH 7.35) (ver Tabla de Materiales). Separe las células de las placas girando horizontalmente a 37 °C durante aproximadamente 2 h.</li>
	<li>Después de confirmar que las células se han desprendido y redondeado bajo un microscopio, disperse en células individuales mediante un pipeteo suave y recójalas en un tubo de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 18 °C para peletizarlas. Retire el sobrenadante con un aspirador.</li>
	<li>Teñir las mitocondrias de las células dispersándolas en 5 mL de medio de maduración de hepatocitos que contenga 100 nM de TMRM (tetrametilrodamina, éster de metl) (ver Tabla de Materiales). Incubar durante 30 minutos a 37 °C mientras se protege de la luz envolviéndolo en papel de aluminio.</li>
	<li>Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 18 °C para granularlas. Retire el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células con 1-5 mL de tampón Ads frío que contenga un 2% de FBS.</li>
	<li>Cuente el número de células con una solución de azul de tripano al 0,4% y una placa de recuento de células.</li>
	<li>Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 °C para granularlas. Retire el sobrenadante.</li>
	<li>Diluir un anticuerpo anti-ALCAM (anticuerpo primario, ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:50 en tampón Ads y añadir 100 μL del anticuerpo diluido por cada 106 células. Tiñe las células durante 50 minutos con hielo. Prepare las células que no están teñidas con el anticuerpo primario como control negativo.</li>
	<li>Lave las celdas con tampón frío Ads que contiene 2% de FBS dos veces.</li>
	<li>Diluir una Alexa Fluor 488 donkey anti-cabra IgG (anticuerpo secundario, ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:100 en tampón Ads, y añadir 100 μL del anticuerpo diluido por cada 106 células. Tiñe las células durante 30 minutos con hielo. Tinte las células que no se tiñeron con el anticuerpo primario utilizando el anticuerpo secundario.</li>
	<li>Lave las celdas con tampón frío Ads que contiene 2% de FBS dos veces.</li>
	<li>Vuelva a suspender las celdas en el búfer de anuncios y fíltrelas a través de un filtro de celdas de tapa a presión (malla de 35 μm) justo antes de clasificarlas por FACS para eliminar los grupos de celdas grandes y los desechos.</li>
</ol>4. Análisis FACS y clasificación de hepatocitos derivados de células iPS humanas
<ol><li>Configure la máquina FACS para la clasificación de celdas siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). NOTA: Utilice un tamaño de boquilla de 85 μm o 100 μm y un filtro ND de 2.0 para los hepatocitos. Utilice el canal FITC para detectar Alexa Flour 488 para ALCAM y el canal PE para detectar la fluorescencia de TMRM para las mitocondrias.</li>
	<li>Ajuste los voltajes FSC (dispersión directa) y SSC (dispersión lateral) para visualizar correctamente la población de celdas.</li>
	<li>Ajuste los voltajes de los canales fluorescentes FITC y PE. Comience con celdas sin etiquetar y centre la población de celdas en la parte inferior de cada gráfico de canal. Asegúrese de que las celdas etiquetadas estén colocadas correctamente dentro de la gráfica.</li>
	<li>Utilice una estrategia de compuerta común para eliminar los dobletes: Puerta el FSC-A principal vs. Población SSC-A (Figura 2A), seguida de FSC-H vs. -W, y luego SSC-H vs. -W (Figura 2B,C).</li>
	<li>Controlar la población de TMRMhi y ALCAM+ (P2 en la Figura 2E) para clasificar los hepatocitos. Controlar la población de TMRMhi y ALCAM- (P1 en la Figura 2E) para clasificar los no hepatocitos. Recoja hepatocitos clasificados y no hepatocitos en tubos de recolección de 15 mL que contengan medio de maduración de hepatocitos.</li>
	<li>Centrifugar el tubo de recogida que contiene las células clasificadas a 200 x g durante 5 min a 18 °C.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante y resuspender las células en medio de maduración de hepatocitos.</li>
	<li>Siembre las células en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) tratados con mitomicina C o en una matriz de membrana basal gelatinosa con medio de maduración de hepatocitos suplementado con 10 μM de Y-27632 y 20 nM de ciclosporina A. Cultive las células en una incubadora de CO2 a 37 °C durante 5 días.</li>
</ol>5. Inmunocitoquímica para la detección de hepatocitos derivados de células iPS humanas
<ol><li>Lavar las células cultivadas durante 5 días después de la clasificación con PBS (-).</li>
	<li>Fije las celdas con paraformaldehído al 4% durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave las células con tampón TBS-T (1x TBS con 1% Tween 20) dos veces para eliminar el paraformaldehído.</li>
	<li>Incubar las células con tampón TBS-T diluido Triton X-100 al 0,1% durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave las celdas con tampón TBS-T dos veces para eliminar Triton X-100.</li>
	<li>Agregue la solución de bloqueo disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) a las celdas durante 30 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir anticuerpos primarios contra la albúmina (marcador de hepatocitos) y el antígeno nuclear humano (hNA, ver Tabla de Materiales), diluidos 1:50 en solución de bloqueo.</li>
	<li>Incubar las células a 4 °C durante la noche. Lave las células con tampón TBS-T dos veces.</li>
	<li>Añadir anticuerpos secundarios: Alexa Fluor 488 burro anti-conejo IgG y Alexa Fluor 546 burro anti-ratón IgG, diluidos 1:100 en solución de bloqueo (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Incuba las células a temperatura ambiente durante 30 min. Lave las células con tampón TBS-T dos veces.</li>
	<li>Evalúe la pureza de los hepatocitos mediante el recuento de células positivas para albúmina y hNA positivas bajo un microscopio de fluorescencia. Calcule el porcentaje de células positivas para albúmina por célula hNA positiva para las poblaciones P1 y P2.</li>
</ol>

Purificación de hepatocitos derivados de iPSC humanos mediante clasificación mitocondrial-ALCAM

<ol><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+pluripotent+stem+cells+correlates+to+the+level+of+CHD7%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7.</a> Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).</li>
<li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3%CE%B2+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li>
<li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+serendipity+and+reproducibility%3A+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li>
<li>Chen, C. X. -Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quality+control+workflow+to+evaluate+the+reproducibility+and+differentiation+potential+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+originating+from+induced+pluripotent+stem+cells+and+methods+for+their+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).</li>
<li>Nori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+issues+of+iPSC-based+cell+therapy+in+a+spinal+cord+injury+model%3A+oncogenic+transformation+with+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).</li>
<li>Hentze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Hidaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber-specific+differentiation+of+Nkx2.5-positive+cardiac+precursor+cells+from+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells.</a> The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).</li>
<li>Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+induces+differentiation+of+ANP-EGFP+expressing+embryonic+stem+cells+towards+a+pacemaker+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype.</a> The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).</li>
<li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li>
<li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+high-functioning+human+iPS+cell-derived+hepatocyte-like+cells+for+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research.</a> Biomaterials. 161, 24-32 (2018).</li>
<li>Hattori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature methods. 7, 61-66 (2009).</li>
<li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22JMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+mitochondrial+activity+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis.</a> Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).</li>
<li>Swart, G. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule+%28CD166%2FALCAM%29%3A+Developmental+and+mechanistic+aspects+of+cell+clustering+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration.</a> European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1475-1481 (2016).</li>
<li>Kamiya, A., Inagaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell+systems+in+liver+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration.</a> Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).</li>
<li>Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+vitro+expansion+system+for+generation+of+human+ips+cell-derived+hepatic+progenitor-like+cells+exhibiting+a+bipotent+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential.</a> PLOS One. 8 (7), e67541(2013).</li>
<li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+a+surface+marker+for+early+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes.</a> Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Debido a sus funciones en el metabolismo de nutrientes y la desintoxicación, los hepatocitos poseen un número relativamente grande de mitocondrias en comparación con otros tipos de células15. ALCAM es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y desempeña un papel en la adhesión y migración celular. Se expresa en varios tipos de células, incluyendo células hepáticas, epiteliales, linfocíticas, mieloides, fibroblastos y neuronales16. Mediante la utilización de una...

Las células madre pluripotentes embrionarias e inducidas (ES e iPS, respectivamente) se consideran fuentes celulares prometedoras para terapias regenerativas. Sin embargo, la eficiencia de diferenciar estas células en tipos específicos de células objetivo puede variar, incluso cuando se utiliza la misma línea celular, protocolo y experimentador 1,2,3,4. Esta variabilidad puede atribuirse a la alta sensibilidad de las células ES/iPS humanas a su entorno. Por lo tanto, actualmente es difícil obtener de manera consistente células diana puras. Para lograr una medicina regenerativa altamente segura, es crucial eliminar las células proliferativas y las células madre indiferenciadas en las células terapéuticas, y la tecnología avanzada de purificación para las células diana es esencial 5,6,7.
Un clasificador de células es un dispositivo que analiza instantáneamente las células individuales y clasifica las células vivas de interés en función de la intensidad de la señal fluorescente, lo que ofrece una solución prometedora. Esto se puede lograr mediante la tinción de anticuerpos de marcadores de superficie específicos del tipo celular o mediante la utilización de expresiones de genes reporteros específicos del tipo celular. Utilizando esta técnica, existen varios reportes sobre métodos para purificar cardiomiocitosderivados de células madre pluripotentes 8,9,10 y hepatocitos 11,12. Hattori et al. desarrollaron un innovador método de purificación mitocondrial utilizando un clasificador de células13. Aprovechando el hecho de que los cardiomiocitos tienen altas demandas de energía a través de la actividad mitocondrial, la tinción de las células con el colorante indicativo de mitocondrias vivas TMRM (éster metílico de tetrametilrodamina) se puede utilizar para marcar y purificar altamente cardiomiocitos por FACS a partir de cuerpos embrioides derivados de células madre embrionarias humanas que contienen varios tipos de células. La ausencia de tumorigénesis se confirmó mediante ensayos de formación de teratomas con los cardiomiocitos purificados. Además, Yamashita et al. descubrieron inesperadamente un método para purificar hepatocitos de cuerpos embrioides derivados de células madre embrionarias humanas mediante el aislamiento de fracciones con alta actividad mitocondrial y expresión positiva de ALCAM14. La justificación de este método es que los hepatocitos también tienen un número relativamente alto de mitocondrias debido a su alto consumo de ATP para el metabolismo de nutrientes y la desintoxicación15, y los hepatocitos expresan ALCAM, un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que desempeña un papel en la adhesión y migración celular16.
Los métodos previos de alta purificación para hepatocitos derivados de células madre pluripotentes requerían modificaciones genéticas, y los métodos de purificación no genética tenían baja eficiencia17. El método mitocondrial no genético tiene mérito para lograr una alta pureza. Cuando se necesitan células progenitoras hepáticas, se pueden elegir los métodos basados en CD133 y CD13 o Dlk118,19. Aunque la precisión de la tecnología de edición del genoma ha avanzado, el riesgo potencial de cambios genómicos imprevistos (por ejemplo, carcinogénesis) no se puede eliminar por completo. Los métodos basados en la actividad mitocondrial, sin implicar modificación genética, pueden estar libres de tales riesgos.
Como resultado del examen de varios indicadores mitocondriales en cardiomiocitos de ratas neonatales, se observó que la TMRM desapareció completamente en 24 h, mientras que otros colorantes permanecieron durante al menos 5 días13. Además, es importante señalar que TMRM y JC-1 no afectaron la viabilidad celular cuando se evaluaron con el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), mientras que otros colorantes demostraron efectos variables sobre la viabilidad celular13. TMRM demuestra una mayor seguridad.
Hasta la fecha, se han desarrollado varios métodos de diferenciación bidimensional (2D) como enfoques más eficientes para inducir la diferenciación en comparación con la formación de cuerpos embrioides tridimensionales (3D). Esto se debe a que los compuestos o citocinas inductoras de diferenciación escalonada se pueden administrar uniformemente a las células en un plano 2D, en lugar de en un espacio 3D. En este estudio, el método20 previamente reportado fue modificado para inducir la diferenciación en hepatocitos derivados de células iPS humanas. Aquí, se describen los detalles de los procedimientos para la diferenciación y purificación 2D actualizada de hepatocitos derivados de células iPS humanas.

<table><tbody><tr><td>253G1 línea celular iPS humana</td><td>Centro de Investigación de Recursos Biológicos RIKEN</td><td>HPS0002</td><td></td></tr><tr><td>4% de paraformaldehído</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Activina Una Solución, Humana, Recombinante</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>18585</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-núcleos, clon 235-1</td><td>Chemicon</td><td>MAB1281</td><td>Anticuerpo contra el antígeno nuclear humano</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x), sin suero</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences Clasificador de</td><td></td><td>células</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ciclosporina A</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>035-18961</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>034-22363</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basal</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matriz de membrana basal gelatinosa</td></tr><tr><td>CultureSure Y-27632</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>036-24023</td><td>Inhibidor de ROCK</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-18863</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-29353</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-Cabra IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón Donkey IgG (H+L) altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de células Tapón a presión</td><td>Suero</td><td></td> bovino fetal de Corning 352235 <td></td></tr><tr><td></td><td>Biowest</td><td>51820-500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Dipéptido L-Alanil-L-Glutamina</td></tr><tr><td>Humano/Ratón/Rata/Canino ALCAM/CD166 Anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF1172</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona 21-hemisuccinato sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2270</td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511</td><td>seda Nippi</td><td>892021</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoBlock</td><td>KAC CTKN001</td><td></td><td>solución de bloqueo</td></tr><tr><td>ITS-G Suplemento(&times; 100)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>090-06741</td><td></td></tr><tr><td>Medio L-15 de Leibovitz</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>128-06075</td><td></td></tr><tr><td>N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Amida hexanoica (Dihexa)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>H293745</td><td></td></tr><tr><td>Conejo policlonal Albúmina antihumana</td><td>Dako</td><td>A0001</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno Sorbitán Monolaurato (preadolescente 20)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28353-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbato de sodio</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>03422-32</td><td></td></tr><tr><td>StemFit AK02N</td><td>REPROCELL</td><td>RCAK02N</td><td></td></tr><tr><td>TBS (10x)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>12748-31</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, éster metílico (TMRM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28229-25</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Azul de Tripán</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>20577-34</td><td></td></tr><tr><td>TRIPSINA 250</td><td>Difco</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Solución de caldo de fosfato de triptosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8159</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicación de la tinción de mitocondrias vivas en la clasificación celular para purificar hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Las células madre embrionarias humanas (ES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS) tienen aplicaciones potenciales en la medicina regenerativa basada en células para el tratamiento de órganos gravemente enfermos debido a su proliferación ilimitada y propiedades pluripotentes. Sin embargo, diferenciar las células ES/iPS humanas en tipos de células diana 100% puras es un reto debido a su alta sensibilidad al medio ambiente. La tumorigénesis después del trasplante es causada por células contaminadas, proliferantes e indiferenciadas, lo que hace que la tecnología de alta purificación sea esencial para la realización segura de la medicina regenerativa. Para mitigar el riesgo de tumorigénesis, se ha desarrollado una tecnología de alta purificación para hepatocitos derivados de células iPS humanas. El método emplea FACS (clasificación celular activada por fluorescencia) utilizando una combinación de alto contenido mitocondrial y el marcador de superficie celular ALCAM (molécula de adhesión celular leucocitaria activada) sin modificación genética. El 97% ± 0,38% (n = 5) de los hepatocitos purificados mediante este método mostraron expresión de la proteína albúmina. Este artículo tiene como objetivo proporcionar procedimientos detallados para este método, aplicados al método de diferenciación bidimensional más actual para células iPS humanas en hepatocitos.

Se muestra la cronología de los procesos que inducen a las células iPS humanas a diferenciarse en hepatocitos a través de cultivo 2D (Figura 1A) y las características celulares representativas (Figura 1B). Aproximadamente en el día 12 de diferenciación, las células comenzaron a exhibir formas celulares poligonales y núcleos redondos, característicos de los hepatocitos. Algunos hepatocitos también mostraron multinucleación.
El análisis...

Los hepatocitos derivados de células madre pluripotentes se pueden purificar a través de la clasificación celular, utilizando una combinación de tinción de moléculas de adhesión de células leucocitarias mitocondriales y activadas (ALCAM, también conocida como CD166).

Aplicación de la tinción de mitocondrias vivas en la clasificación celular para purificar hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...

El alcance de nuestra investigación es purificar hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas, utilizando sin modificación genética. Nuestro objetivo es abordar la cuestión del riesgo tumorigénico asociado a las células indiferenciadas, entre las diferenciadas de las células iPS humanas. Uno de los retos experimentales actuales es la baja pureza de las células, debido al almacenamiento mecánico de la clasificación.Estamos desarrollando un nuevo método de purificación, que utiliza las características metabólicas únicas de los hepatocitos, para la purificación a gran escala. Un método de clasificación no celular para las células progenitoras hepáticas no puede obtener hepatocitos puros. Otro para hepatocitos maduros solo puede tratar una pequeña fracción de hepatocitos, debido a la expresión limitada de la proteína marcada.Por el contrario, nuestro enfoque puede obtener hepatocitos en diferentes niveles de maduración con una mayor eva. Los hepatocitos derivados de células iPS humanas son extremadamente inmaduros y muestran una expresión más reducida de macrocitos después de la purificación. Nuestro objetivo futuro es mejorar la modulación de los hepatocitos utilizando tecnología organoidal y los avances diarios hacia la medicina regenerativa y el descubrimiento de fármacos.

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Biología

Este estudio demuestra la reprogramación de las células somáticas hacia la pluripotencia in vivo sin la generación de teratomas. Utilizamos la inyección hidrodinámica de ADN plásmido en la vena de cola que codifica los factores Yamanka para inducir la reprogramación in vivo de hepatocitos adultos en células de mayor pluripotencia.

En Reprogramación vivo de células somáticas de adultos a Pluripotencia por la sobreexpresión de factores de Yamanaka

Aquí, describimos un protocolo robusto para la derivación de cardiomiocitos humanos que combina la diferenciación cardíaca modulada por moléculas pequeñas y la purificación de cardiomiocitos mediada por privación de glucosa, lo que permite la producción de cardiomiocitos purificados para fines de modelado de enfermedades cardiovasculares y detección de fármacos.

Derivación de cardiomiocitos altamente purificada de células madre humanas pluripotentes inducidas Uso Pequeño Diferenciación molécula modulada y posterior glucosa inanición

Se describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. Los diferentes tipos de células hepáticas constituyen la base para los modelos funcionales de hígado y la ingeniería de tejidos. Este nuevo método tiene como objetivo aislar células hepáticas en un alto rendimiento y viabilidad.

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

El objetivo de este protocolo es obtener alta viabilidad y alto rendimiento de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado. Esto se logra por perfundiendo el hígado con una solución de colagenasa tipo IV a través de la vena porta, seguida de centrifugación diferencial para obtener hepatocitos y células endoteliales sinusoidales.

Purificación de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado de ratón de perfusión

El protocolo que presentamos describe una plataforma para la identificación de pequeñas moléculas para el tratamiento de la enfermedad hepática. Se presenta una descripción paso a paso detallando cómo iPSCs se diferencian en células con características de hepatocitos en placas de 96 pocillos y utilizar las células para detectar pequeñas moléculas con potencial actividad terapéutica.

Usando humanos inducida por células de hepatocito-como derivado de células madre pluripotentes de descubrimiento de fármacos

Este protocolo describe un enfoque semiautomático para producir células similares a hepatocitos de células de vástago pluripotent humana en formato de 96 placa bien. Este proceso es rápido y eficiente, permitiendo que la producción de calidad asegurada lotes de hepatocitos como las células para investigación básica y aplicada.

Producción semi automatizada de hepatocitos como células de células madre pluripotentes

Este protocolo detalla un método monocapa y libre de suero para generar eficientemente células similares a hepatocitos a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en 18 días. Esto implica seis pasos a medida que los hPSCs se diferencian secuencialmente en tipos celulares intermedios como la raya primitiva, el endodermo definitivo, los progenitores posteriores del antebrazo y del brote hepático antes de formar células similares a los hepatocitos.

Diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas en células hepáticas

Los hepatocitos primarios son una herramienta valiosa para estudiar la respuesta hepática y el metabolismo in vitro. Utilizando reactivos disponibles comercialmente, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón.

Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la diferenciación de células madres embrionarias humanas (hESCs) en hepatocito-como las células funcionales (HLCs) complementando continuamente Activin A y CHIR99021 durante la diferenciación del hESC en el endodermo definitivo (DE).

Un Método Eficiente Para La Inducción De Células Dirigidas Hepatocitos-Como De Las Células Madre Embrionarias Humanas

Este estudio informa un enfoque novedoso para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales basados en citometría de flujo y tinción doble con dos reporteros fluorescentes o anticuerpos para detectar cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la composición de la cadena respiratoria mitocondrial y el ADN mitocondrial.

Análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales en células madre pluripotentes inducidas por humanos y sus derivados neuronales y gliales

Aprende a purificar hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas mediante tinción de mitocondrias vivas y FACS. Este método alcanza 97% de pureza sin modificación genética para aplicaciones en medicina regenerativa.

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Aplicación de la tinción de mitocondrias vivas en la clasificación celular para purificar hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

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