Name: Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Aprende a utilizar citometría de flujo por imágenes para analizar la autoagregación microbiana en Lactobacillaceae. Este método de alto rendimiento permite estudiar cómo los carbohidratos dietéticos afectan el comportamiento de agregación bacteriana.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Israelí para la Ciencia (Subvención 119/16) y la subvención IMoh (3-15656) al IKG. R.S. con el apoyo de la beca Kreitman.

El archivo .ast, con la plantilla para Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) como ejemplo, se proporciona en el Archivo de codificación suplementaria 1.
1. Preparación de los medios
<ol><li>Prepare el caldo Lactobacili MRS siguiendo las instrucciones del fabricante (55 g en 1 L de agua desionizada) y las placas de agar Lactobacilli MRS con agar al 1,5% (p/v) (ver Tabla de Materiales). Después de la esterilización en autoclave, el medio está listo para usar directamente o se puede almacenar a 4 °C.</li>
	<li>Preparar caldo de soja tríptico al 50% (15 g en 1 L de agua desionizada) (ver Tabla de Materiales), TSB suplementado con 1% (p/v) de D-(+)-glucosa y 1% (p/v) de D-(+)-rafinosa, luego autoclave para esterilizar el medio. Es preferible almacenarlo a 4 °C para evitar la contaminación.</li>
	<li>Para un medio tamponado con glucosa, prepare TSB suplementado con 1% (p/v) de D-(+)-glucosa, 5 mM de fosfato de potasio monobásico junto con dibásico de potasio y 100 mM de MOPS (3-(N-morfolino) ácido propano sulfónico, ver Tabla de Materiales) pH 7. A continuación, autoclave para esterilizar el medio.</li>
</ol>2. Preparación de las muestras
NOTA: Este paso implica la evaluación de la agregación celular en respuesta al azúcar fermentable o no fermentable de nuestra dieta. En la Figura 1 se muestra una representación esquemática del proceso de preparación de la muestra.
<ol><li>Raye la cepa de Lactobacillaceae de un caldo de glicerol congelado (50% de glicerol) en una placa de caldo Lactobacilli MRS (agar al 1,5%). NOTA: En el experimento de ejemplo presentado aquí, se utilizaron cepas probióticas de Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) y Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG). Para expandir esta metodología a otros miembros probióticos del filo firmicutes, se seleccionó Bacillus coagulans (ATCC 10545).</li>
	<li>Cultive las células durante la noche a 37 °C en condiciones estáticas.</li>
	<li>Inocular 5 mL de caldo Lactobacilos MRS con una sola colonia y cultivarlo a 37 °C en condiciones estáticas durante la noche.</li>
	<li>Diluir el cultivo celular del paso anterior (1:100) en 3 mL de caldo de soja tríptico al 50% (TSB), TSB suplementado con 1% (p/v) de D-(+)-glucosa, o TSB suplementado con D-(+)-rafinosa al 1% (p/v).</li>
	<li>Incubar durante la noche a 37 °C en condiciones estáticas.</li>
	<li>Prepare la muestra mezclando las células uniformemente en el medio y agite suavemente el tubo de cultivo celular desde el paso 2.5. Invierta suavemente el tubo de ensayo hasta que se complete la mezcla. Transfiera 200-300 μL a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. NOTA: Es esencial no sonicar la muestra para evitar romper los agregados. Durante la adquisición de datos de los pasos 3.4 a 3.10, puede haber casos en los que las muestras estén demasiado concentradas. Si se observa que la muestra funciona muy lentamente o no funciona en absoluto, se puede diluir la muestra con el medio fresco adecuado.</li>
</ol>3. Adquisición de datos
<ol><li>Configure el citómetro de flujo de imágenes de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Ajuste el láser de 785 nm a 5 mW para la medición de campo oscuro (equivalente a la dispersión lateral en la citometría de flujo convencional, abreviada como SSC). Utilice un objetivo de 60x con una apertura numérica (N.A) de 0,9, seleccione una sensibilidad alta y ajuste la velocidad a baja.</li>
	<li>Antes de recopilar cualquier dato, asegúrese de la estabilidad del flujo de las cuentas de calibración en el canal SSC. Haga clic en el botón de reproducción en el cuadro "fluidos" y examine la calidad de las imágenes de las cuentas. Las imágenes de las cuentas deben aparecer nítidas y nítidas.</li>
	<li>Presione el botón Cargar y coloque un tubo con una muestra (del paso 2.6) en el soporte.</li>
	<li>Cree un nuevo diagrama de dispersión en el cuadro "espacio de trabajo". Haga clic en Nuevo diagrama de dispersión y seleccione el área en el canal de campo claro correspondiente a la intensidad del canal SSC. Excluya los cordones de calibración que se ejecutan en el instrumento junto con la muestra. NOTA: Las cuentas se pueden excluir cargando una muestra solo con búfer e identificando las cuentas en el Área vs. Parcela SSC. A continuación, dibuje una puerta alrededor de la población de cuentas con el botón Crear región de polígono .</li>
	<li>En el cuadro "Configuración de adquisición", introduzca el nombre de la muestra, especifique la ubicación para el almacenamiento de datos, elija la población (todas las celdas sin cuentas) para registrar y establezca el número de eventos que se recopilarán. Normalmente, entre 10.000 y 20.000 eventos son suficientes.</li>
	<li>Haga clic en el botón Grabar ubicado en el cuadro "Adquisición", y el proceso de adquisición finalizará automáticamente una vez que se alcance el número especificado de eventos.</li>
	<li>Haga clic en el botón Devolver para descargar el tubo y retírelo del soporte cuando se le solicite en una ventana pequeña.</li>
	<li>Repita los pasos 3.5-3.9 para cada muestra.</li>
	<li>Guarde la plantilla para mantener la uniformidad de la adquisición de datos para las repeticiones posteriores.</li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Mida el porcentaje (%) de autoagregación de la población.<ol><li>Analice los datos adquiridos en el citómetro de flujo de imágenes utilizando el software IDEAS (consulte la tabla de materiales).</li>
		<li>Cree un archivo de análisis de datos (.daf) a partir del archivo sin procesar (.rif) cargando el archivo (.rif) en el software de análisis. Haga clic en el botón Archivo y abra el archivo (.rif) necesario. En la ventana abierta, haga clic en usar análisis de adquisición y, a continuación, haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Cree un histograma de gradiente RMS (una medida del contraste y el enfoque de la imagen) en el canal de campo claro para identificar eventos enfocados. En el área de análisis, haga clic en el botón Nuevo histograma . En la ventana "Nuevo histograma", elija la población de la adquisición para analizar, y en la "característica del eje x", seleccione Gradiente RMS del canal de campo claro.<ol><li>Coloque una puerta haciendo clic en el botón Crear región de línea en el área de análisis para excluir eventos no enfocados (Figura 2A). NOTA: Normalmente, la región de línea "Enfocada" debe incluir el 80%-90% de los eventos con la puntuación RMS de gradiente más alta, pero se deben determinar umbrales específicos para las celdas "enfocadas" para cada configuración experimental.</li>
		</ol></li>
		<li>Cree un diagrama de dispersión del área (μm2) frente a la relación de aspecto (anchura dividida por la longitud de una elipse de mejor ajuste) del canal de campo claro. Presione el botón Nuevo diagrama de dispersión en el área de análisis. En la ventana "Nuevo diagrama de dispersión", elija la población enfocada del paso 4.1.3.<ol><li>Seleccione Área del canal de campo claro para la entidad del eje x y Relación de aspecto del canal de campo claro para la entidad del eje y. Este diagrama de dispersión permite determinar la compuerta de la población objetivo para distinguir los singletes y los eventos de agregados pequeños de los agregados y cadenas microbianas más grandes.</li>
		</ol></li>
		<li>En este diagrama de dispersión, dibuje una puerta con el botón Crear región rectangular (o Crear región de polígono) en función del valor del área para la población de eventos de agregación y otra puerta para la población de singletes y agregados pequeños (Figura 2B). NOTA: En ciertos contextos, separar agregados pequeños de singletes puede ser un desafío, por lo que se pueden combinar en la misma puerta. Lo mismo se aplica a los agregados y cadenas más grandes (Figura 3).</li>
		<li>Revise y evalúe manualmente las imágenes de los eventos dentro de cada puerta para verificar la confiabilidad de la estrategia de compuertas. Si es necesario, ajuste el valor del área de la puerta. Para ello, seleccione la población revisada en el menú desplegable "Poblaciones". NOTA: La compuerta no tiene un valor de área específico, ya que puede variar dependiendo de las características de las bacterias que se están analizando.</li>
		<li>Guarde el análisis de datos como plantilla. Haga clic en la pestaña Archivo , seleccione Guardar como Template.ast y abra el siguiente archivo de ejemplo (.rif) con la misma plantilla para crear el archivo de análisis de datos (.daf) (archivo .ast compatible como ejemplo para LGG).</li>
		<li>Cree una tabla de estadísticas para enumerar los eventos clave para su posterior análisis. Haga clic en la pestaña Informes , luego haga clic en Definir informe de estadísticas.</li>
		<li>En la nueva ventana, haga clic en Agregar columnas. Agregue el recuento de singlets/agregados y las estadísticas %gated. En "estadísticas", elija %gated/count y, en la población seleccionada, elija singlets/aggregates. Haga clic en Agregar estadísticas para agregar la estadística a la lista y guardarla como plantilla.</li>
		<li>Haga clic en Generar informe estadístico y elija la plantilla de estadísticas y los archivos (.daf) para el análisis.</li>
	</ol></li>
	<li>Mida la distribución del tamaño de los agregados.<ol><li>Para analizar el tamaño medio de los eventos de agregación, trace un histograma del área (μm2) de la población de eventos de agregación del paso 4.1.5 (Figura 2C).</li>
		<li>Guarde el análisis de datos como plantilla. Haga clic en la pestaña Archivo , seleccione Guardar como plantilla y abra el siguiente archivo de muestra (.rif) con la misma plantilla para el archivo de análisis de datos (.daf).</li>
		<li>Repita los pasos 4.1.7-4.19. Para el tamaño de los agregados, elija valor medio en estadísticas y seleccione agregados en la población seleccionada. En Características, seleccione Área del canal de campo claro. Haga clic en Agregar estadísticas para agregar la estadística a la lista y guardarla como plantilla.</li>
		<li>Repita el paso 4.1.9 para generar un informe estadístico.</li>
	</ol></li>
</ol>

Análisis cuantitativo de la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes

<ol><li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autoaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li>
<li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtaA%2C+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830(2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein%2C+Flp%2C+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li>
<li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932(2022).</li>
<li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268(2021).</li>
<li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li>
<li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+%26%2334%3BDried+Ossban%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &#34;Dried Ossban&#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607(2018).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus%3C%2Fem%3E+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li>
<li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li>
<li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli%3A+cell+aggregation+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87(2022).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285(2021).</li>
<li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host%3A+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W. Jr, Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochemica+et+Cytobiologica%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li>
<li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li>
<li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778(2021).</li>
<li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms%3A+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li>
<li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096(2021).</li>
<li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178(2016).</li>
</ol>

La citometría de flujo es un método ampliamente utilizado para cuantificar las intensidades de fluorescencia en las células eucariotas, pero es posible que no proporcione mediciones precisas para las células bacterianas debido a su mayor tamaño o pequeños agregados. Estos factores pueden tener un impacto significativo en la cuantificación precisa de la autoagregación y el nivel basal de formación de agregados en diferentes condiciones. Para abordar esto, se empleó la citometría de flujo por imágenes (IFC) para obtener un...

La autoagregación bacteriana se considera un paso primordial en la formación de biopelículas. En este proceso (a veces también llamado autoaglutinación o floculación), las bacterias del mismo tipo forman grupos multicelulares que eventualmente se asientan en el fondo de los tubos de cultivo o se adhieren a su tejidoo superficie objetivo.
La autoagregación es un fenómeno ampliamente observado y se ha demostrado hasta ahora en patógenos gramnegativos como el patógeno oportunista Acinetobacter baumannii2, el patógeno dental Aggregobacter actinomycetemcomitans3 y el patógeno emergente Burkholderia pseudomallei4. La autoagregación también se ha descrito en varias cepas grampositivas probióticas 5,6,7,8. En Lactobacillus (L.) acidophilus, la autoagregación fue parcialmente mediada por proteínas de la capa S y se correlacionó con una adhesión al xilano7. Del mismo modo, encontramos una correlación entre la autoagregación dependiente de glucosa y la inducción de las propiedades adhesivas (a juzgar por la adhesión a la mucina) de las especies probióticas Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei y Lactiplantibacillus plantarum5. Lo más probable es que el aumento de la autoagregación reflejara cambios en la expresión de adhesinas celulares en respuesta a la glucosa y sus catabolitos9. Si bien los mecanismos moleculares de la autoagregación aún no se han determinado, se ha demostrado que este proceso altera el fenotipo de las bacterias agregadas y les otorga una mayor tolerancia a los factores de estrés ambiental1, así como una mayor sensibilidad a las moléculas de detección de quórum10.
Se han utilizado varios enfoques para medir la autoagregación; Un enfoque experimental consiste en dejar que los cultivos permanezcan estáticos en tubos de cultivo estrechos durante un tiempo determinado. Los cultivos de control permanecen turbios, mientras que los cultivos de autoagregación se asentarán en el fondo del tubo. Un enfoque más cuantitativo mide la autoagregación por sedimentación o ensayo de sedimentación11.
La citometría de flujo también se ha empleado cada vez más en los últimos años para investigar la autoagregación bacteriana. Este método es apropiado para analizar partículas de entre 0,5 y 1000 μm de tamaño aproximado. La bacteria individual o los agregados formados se suspenden en el fluido, se introducen en una corriente y se pueden detectar uno por uno11. El registro de la luz dispersada hacia adelante permite medir el tamaño relativo de la célula o agregado. Es relativamente rápido y sencillo, pero no puede detectar varios parámetros, como el tamaño del agregado o el número promedio de celdas en los agregados. Por lo tanto, este enfoque puede complementarse microscópicamente, permitiendo verificar más parámetros12. Sin embargo, la microscopía tradicional requiere mucho tiempo y, por lo tanto, limita el número de muestras analizadas y el poder estadístico del análisis. En general, la citometría de flujo por imágenes proporciona varias características en comparación con la citometría de flujo tradicional, como el análisis simultáneo de la morfología y el fenotipo celular, la realización de análisis basados en imágenes, la detección de eventos raros y la validación de los datos de citometría de flujo13. Estas ventajas mejoran las capacidades de la citometría de flujo y facilitan un examen más detallado de las poblaciones celulares.
Este estudio proporciona un protocolo valioso para la obtención de imágenes de citometría de flujo para monitorear la autoagregación en bacterias de ácido láctico (BAL). Estos bastones Gram-positivos son anaerobios facultativos y pertenecen al grupo LAB. Estos eficientes fermentadores de glucosa generan ácido láctico como su principal producto final del metabolismo de los carbohidratos14. Estas bacterias son miembros centrales beneficiosos del microbioma y se encuentran naturalmente en el tracto gastrointestinal (TGI) de humanos y animales, así como en el tracto urogenital de lasmujeres. Por lo tanto, la caracterización exacta de sus propiedades de autoagregación es de alto interés biotecnológico y clínico.
Nuestros hallazgos previos indicaron que el nivel basal de autoagregación difiere entre las diferentes cepas probióticas. Esta heterogeneidad se ve afectada por los diferentes hidratos de carbono utilizados como fuente de carbono5. Para superar esta propiedad fundamental de las bacterias probióticas, se monitorizaron los efectos de los hidratos de carbono de la dieta sobre la autoagregación a nivel unicelular mediante IFC. Este enfoque basado en IFC combina la potencia y la velocidad de los citómetros de flujo tradicionales con la resolución del microscopio. Por lo tanto, permite mediciones morfométricas complejas de alta velocidad de una forma fenotípicamente definida16,17. Este enfoque puede extenderse a otras bacterias probióticas y patógenas, combinadas con reporteros fluorescentes para monitorear la expresión génica y cepas marcadas con fluorescencia para monitorear la presencia y abundancia de especies bacterianas específicas en agregados heterogéneos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de cultivo de 14 mL Falcon</td><td></td><td>352051</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Baeton,Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Typtic Caldo de soja</td><td>Baeton,Dickinson and Company</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Rafinosa pentahidrato</td><td>Sigma</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>Difco Lactobacilos MRS caldo</td><td>Baeton,Dickinson and Company</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)</td><td>FL medical</td><td>23053</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Detalles disponibles en: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1</td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Detalles disponibles en:</td></tr><tr><td>https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F MOPS, ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Fisher Scientific, 174,18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma, 136,09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Las bacterias beneficiosas y probióticas desempeñan un papel esencial en sus huéspedes, proporcionando diversos beneficios para la salud, incluida la inmunidad a las enfermedades infecciosas. La familia Lactobacillaceae está formada por bacterias grampositivas con propiedades probióticas confirmadas. Este estudio utiliza especies de Lactobacillaceae como modelo para demostrar la efectividad del análisis de alto rendimiento de una sola célula en el estudio de la agregación celular. El objetivo es analizar la respuesta de estas especies beneficiosas a los hidratos de carbono simples de la dieta.
El estudio muestra cómo la citometría de flujo por imágenes (IFC) puede superar las diferencias fundamentales en el ensamblaje de bacterias probióticas en presencia y ausencia de carbohidratos. IFC combina la potencia y la velocidad de la citometría de flujo convencional con la resolución espacial de la microscopía, lo que permite mediciones morfométricas complejas de alta velocidad de una manera fenotípicamente definida en una biblioteca de cepas y condiciones bacterianas beneficiosas. Este protocolo proporciona información sobre la autoagregación de las especies de Lactobacillaceae y arroja luz sobre su respuesta a los carbohidratos de la dieta, lo que contribuye a comprender los mecanismos detrás de los efectos beneficiosos de estas bacterias probióticas.

Los resultados demuestran que este método puede medir fácilmente las diferencias en la autoagregación en respuesta a los azúcares de la dieta en las bacterias BAL. Al separar los individuos de los agregados, el método permite calcular el porcentaje de la población de los eventos de agregación de todos los eventos en respuesta a azúcares fermentables o no fermentables de la dieta. Además, fue posible medir si existen diferencias en el tamaño medio de la población agregada entre tratamientos.
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Este protocolo describe un enfoque cuantitativo para medir la autoagregación microbiana mediante citometría de flujo por imágenes.

Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

Este estudio utilizó especies de Lactobacillus como modelo para demostrar la efectividad del análisis de citometría de flujo por imágenes en el estudio de la autoagregación microbiana. El objetivo es analizar la respuesta de la autoagregación de las especies de Lactobacillus a los carbohidratos simples de la dieta. Los métodos más utilizados para medir la autoagregación son la fotometría espectral, que mide las suspensiones microbianas, la turbidez o la densidad óptica, y las técnicas de microscopía tradicionales, como el campo claro, el contraste de fase y la microscopía fluorescente.Cuando se habla de imágenes de alto rendimiento, un desafío experimental importante es la segmentación de un solo evento. En este protocolo, es un solo agregado. La citometría de flujo por imágenes aborda este desafío con elegancia y brinda a los investigadores una herramienta poderosa para estudiar la autoagregación.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un método que utiliza multi-espectral citometría de flujo de imágenes para cuantificar la internalización de nanopartículas polianhídrido o bacterias de las células RAW 264.7.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

Se presentan métodos para estudiar el efecto de las MEP y otras toxinas secretadas...

El estudio de las interacciones de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso

Este método demuestra una técnica para evaluar la función de los granulocitos midiendo simultáneamente la fagocitosis de las bacterias y el estallido oxidativo. La citometría de flujo basada en imágenes permitió la identificación de tres subconjuntos distintos de granulocitos activados que diferían en su capacidad funcional relativa.

Imagen basada en Citometría de Flujo Técnica para evaluar los cambios en función de los granulocitos In Vitro

Citometría de flujo en combinación con agrupamiento visual ofrece un método rápido y fácil de usar para el estudio de biopelículas acuáticas. Puede ser utilizado para la caracterización de biopelículas, detección de cambios en la estructura de la comunidad de biofilm y la detección de partículas abióticas en el biofilm.

Caracterización de biopelículas acuáticas con citometría de flujo

Análisis cytometric del flujo ha demostrado ser valioso para investigar cultivos puros y monitoreo de la dinámica de la comunidad microbiana. Presentamos tres flujos de trabajo integrales, de muestreo para análisis de datos, para cultivos puros y comunidades complejas en medio claro, así como en matrices difíciles, respectivamente.

Caracterización dinámica de microbioma-citometría de flujo basado en flujos de trabajo de cultivos puros de las comunidades naturales

Las curvas innovadoras (BTC) son herramientas eficientes para estudiar el transporte de bacterias en medios porosos. Aquí introducimos herramientas basadas en dispositivos fluidos en combinación con microscopía y conteo citométrico de flujo para obtener BTC.

Combinación de dispositivos fluidos con microscopía y citometría de flujo para estudiar el transporte microbiano en medios porosos a través de escalas espaciales

El objetivo de este protocolo es cuantificar la unión del norovirus humano del patógeno eucariota a las bacterias. Después de realizar un ensayo inicial de apego a la bacteria del virus, la citometría de flujo se utiliza para detectar bacterias ligadas viralmente dentro de la población.

Cuantificación de partículas similares al virus del norovirus humanos que se unen a bacterias comensales mediante citometría de flujo

El aislamiento de células de implantes disecados y su caracterización por citometría de flujo puede contribuir significativamente a la comprensión del patrón de respuesta inmune contra implantes. En este trabajo se describe un método preciso para el aislamiento de células de implantes disecados y su tinción para el análisis citométrico de flujo.

Citometría de flujo de alta dimensionalidad para el análisis de la función inmunitaria de tejidos de implantes disecados

El medio de esputo sintético para fibrosis quística (SCFM2) se puede utilizar en combinación con microscopía de barrido láser confocal y clasificación celular activada por fluorescencia para observar agregados bacterianos a alta resolución. Este documento detalla los métodos para evaluar las poblaciones agregadas durante el tratamiento antimicrobiano como plataforma para futuros estudios.

Herramientas para la evaluación en tiempo real de un modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa

Aprende a utilizar citometría de flujo por imágenes para analizar la autoagregación microbiana en Lactobacillaceae. Este método de alto rendimiento permite estudiar cómo los carbohidratos dietéticos afectan el comportamiento de agregación bacteriana.

Citometría de flujo por imágenes para estudiar la autoagregación microbiana

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